一種免疫磁珠及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫磁珠技術領域，尤其涉及一種表面基團為羧基的免疫磁珠及其制 備方法和其在食源性致病菌檢測中的應用。
【背景技術】
[0002] 食源性致病菌檢測免疫磁珠制備技術是將檢測用抗體分子固定在磁性粒子表面， 在外加磁場作用下，利用特異性識別結合作用將免疫磁珠以及捕獲到的致病菌富集分離的 技術。這一檢測方法靈敏度高，且具有操作簡單便捷的優(yōu)勢。
[0003] 在食源性致病菌檢測分離用免疫磁珠中，采用羧基固定抗體分子的免疫磁珠應用 較廣。這類免疫磁珠多是將羧基材料(如聚丙烯酸）包裹在磁珠表面，利用免疫磁珠表面 存在的大量自由羧基與多肽或者抗體結構中氨基反應，將抗體或者多肽固定在免疫磁珠表 面。這種免疫磁珠表面大量自由羧基的存在利于提高抗體固定效率。但是也存在弊端，由 于電荷屏蔽作用降低了粒子間斥力，單純的聚丙烯酸包被的免疫磁珠在檢測液體中粒度穩(wěn) 定性下降，易于發(fā)生粒子間團聚導致沉淀失去檢測能力。
[0004] 為保證上述免疫磁珠粒度穩(wěn)定性，免疫磁珠的表面自由羧基量受到一定限制。然 而，羧基數量以及由之決定的抗體分子的固定量直接決定免疫分離識別效率。因此，在基于 羧基磁珠的分離體系中，設法平衡磁珠粒度穩(wěn)定性以及羧基數量相關的免疫分離效果極為 重要。尋求一種制備簡單的表面富含羧基并能維持檢測緩沖液環(huán)境下粒度穩(wěn)定性的羧基化 磁珠成為目前免疫磁珠研究領域面臨的難題之一。

【發(fā)明內容】

[0005] 針對現有技術的不足，本發(fā)明提供一種免疫磁珠及其制備方法和應用，所述免疫 磁珠為羧基磁珠，其表面富含羧基，抗體固定效率高；并且所述免疫磁珠在檢測緩沖液環(huán)境 下粒度穩(wěn)定性高。
[0006] 在第一方面，本發(fā)明提供一種免疫磁珠，包括磁性粒子內核和包被在所述磁性粒 子內核外表面的羧基糖類，其中所述磁性粒子包括超順磁性四氧化三鐵。
[0007] 本發(fā)明的免疫磁珠中，超順磁性四氧化三鐵為免疫磁珠提供磁分離所需要的磁 性，除此之外還可能在不影響磁性的情況下包含三氧化二鐵或雜質成分。
[0008] 本發(fā)明的免疫磁珠中，羧基糖類分子中眾多羥基的水合性能保證磁珠的水力學尺 寸穩(wěn)定性，能夠長期穩(wěn)定地分散在電解質溶液中，而不發(fā)生沉淀或團聚現象，例如本發(fā)明的 尺寸為30nm的羧基葡聚糖免疫磁珠在磷酸緩沖液中能夠維持長期（24小時以上)穩(wěn)定而不 沉淀，而相同條件下尺寸相當的聚丙烯酸免疫磁珠在磷酸緩沖液中靜置2小時就會完全沉 淀至容器底部；同時糖類分子中部分羥基轉化為羧基，利于抗體或多肽的高效固定。
[0009] 本發(fā)明的免疫磁珠中，糖類的作用在于一方面提供大量的羥基，其水合性能保證 磁珠的水力學尺寸穩(wěn)定性；另一方面部分羥基轉化為羧基提供抗體或多肽固定所需要的位 點。因此本發(fā)明中糖類的具體種類可以不做限定，只要具有大量羥基，并且部分羥基能夠轉 化為羧基即可。
[0010] 作為本發(fā)明的優(yōu)選技術方案，所述糖類選自葡萄糖、果糖、葡聚糖、蔗糖和麥芽糖 中的1種或至少2種的組合，所述組合典型并非限定性的實例比如葡萄糖和果糖的組合，葡 萄糖和葡聚糖的組合，葡萄糖和蔗糖的組合，果糖和葡聚糖的組合，果糖和蔗糖的組合，果 糖和麥芽糖的組合，蔗糖和麥芽糖的組合，葡萄糖、果糖和葡聚糖的組合，果糖、葡聚糖和蔗 糖的組合，葡聚糖、蔗糖和麥芽糖的組合，等等；優(yōu)選葡萄糖、果糖和葡聚糖中的1種或至少 2種的組合。
[0011] 作為本發(fā)明的優(yōu)選技術方案，所述免疫磁珠的粒徑介于20nm-3 μ m范圍內，例 如 30nm、50nm、100nm、200nm、300nm、500nm、700nm、900nm、1. 2 μ m、1. 5 μ m、1. 8 μ m、2. 1 μ m、 2· 4 μ m、2. 7 μ m、2. 8 μ m、2. 9 μ m、50nm-800nm或 200nm_l· 5 μ m，優(yōu)選 lOOnm-l μ m范圍內。免 疫磁珠的粒徑過大會造成沉淀或團聚現象的發(fā)生，分散性能差；免疫磁珠的粒徑過小往往 導致與抗體或多肽結合的困難，可能由于空間位阻效應。
[0012] 在第二方面，本發(fā)明提供一種制備第一方面所述的免疫磁珠的方法，包括如下步 驟：
[0013] (1)磁珠的制備：使三價鐵源、二價鐵源和糖類在堿性溶液作用下共沉淀生成包含 順磁性四氧化三鐵的磁性粒子，所述磁性粒子表面包被有糖類分子；
[0014] (2)磁珠的羧基化：用多元酸酐與磁性粒子表面的糖類分子反應生成羧基糖類包 被的免疫磁珠。
[0015] 作為本發(fā)明的優(yōu)選技術方案，所述三價鐵源與糖類的質量比為0. 1:1~6:1，例如 0· 1:1、0· 2:1、0· 5:1、0· 8:1、1:1、1· 2:1、1· 5:1、2:1、3:1、4:1、5:1 或 5. 8:1，優(yōu)選為 1:1 ~ 4:1。如果三價鐵源過多，會導致形成的磁性粒子不能被糖類充分包被，在免疫反應過程中 可能會有不希望發(fā)生的非特異性結合；如果糖類過多可能會影響共沉淀反應的發(fā)生，導致 不能形成良好的磁性粒子，并且也是不必要的浪費。
[0016] 作為本發(fā)明的優(yōu)選技術方案，所述磁珠的制備在溫度為60~95°C下進行，例如 在溫度為 62°〇、641：、671：、691：、711：、751：、781：、821：、881：、921：或941：下進行，優(yōu)選為 80~90°C下進行。
[0017] 作為本發(fā)明的優(yōu)選技術方案，所述共沉淀的反應時間為15分鐘~1小時，例如16 分鐘、18分鐘、20分鐘、25分鐘、28分鐘、32分鐘、36分鐘、40分鐘、45分鐘、48分鐘、52分 鐘、55分鐘或58分鐘，優(yōu)選為30分鐘~45分鐘。
[0018] 作為本發(fā)明的優(yōu)選技術方案，所述共沉淀反應在惰性氣體保護下進行，所述惰性 氣體包括但不限于氮氣、氦氣、氖氣和氬氣中的1種或至少2種的組合。
[0019] 本發(fā)明中，所述三價鐵源的作用在于提供反應所需要的三價鐵離子，因此對于三 價鐵源的種類不做限定，可以是任何能夠提供三價鐵離子的含鐵化合物。作為本發(fā)明的優(yōu) 選技術方案，所述三價鐵源選自氯化鐵、硝酸鐵和硫酸鐵中的1種或至少2種的組合；所述 組合典型并非限定性的實例比如氯化鐵和硝酸鐵的組合，氯化鐵和硫酸鐵的組合，硝酸鐵 和硫酸鐵的組合，氯化鐵、硝酸鐵和硫酸鐵的組合。
[0020] 本發(fā)明中，所述二價鐵源的作用在于提供反應所需要的亞鐵離子，因此對于二價 鐵源的種類不做限定，可以是任何能夠提供亞鐵離子的含鐵化合物。作為本發(fā)明的優(yōu)選技 術方案，所述二價鐵源選自氯化亞鐵、硝酸亞鐵和硫酸亞鐵中的1種或至少2種的組合；所 述組合典型并非限定性的實例比如氯化亞鐵和硝酸亞鐵的組合，氯化亞鐵和硫酸的組合， 硝酸亞鐵和硫酸的組合，氯化亞鐵、硝酸亞鐵和硫酸的組合。
[0021] 作為本發(fā)明的優(yōu)選技術方案，所述糖類選自葡萄糖、果糖、葡聚糖、蔗糖和麥芽糖 中的1種或至少2種的組合，所述組合典型并非限定性的實例比如葡萄糖和果糖的組合，葡 萄糖和葡聚糖的組合，葡萄糖和蔗糖的組合，果糖和葡聚糖的組合，果糖和蔗糖的組合，果 糖和麥芽糖的組合，蔗糖和麥芽糖的組合，葡萄糖、果糖和葡聚糖的組合，果糖、葡聚糖和蔗 糖的組合，葡聚糖、蔗糖和麥芽糖的組合，等等；優(yōu)選葡萄糖、果糖和葡聚糖中的1種或至少 2種的組合。
[0022] 本發(fā)明中，所述堿性溶液的作用在于為共沉淀反應提供堿性環(huán)境，因此對于堿性 溶液的具體選擇可以不做限定。作為本發(fā)明的優(yōu)選技術方案，所述堿性溶液選自氨水、氫氧 化鈉和氫氧化鉀溶液中的1種或至少2種的組合；所述組合典型并非限定性的實例比如氨 水和氫氧化鉀溶液