一種鉑納米籠免疫探針及其制備方法和在制備電化學(xué)免疫傳感器中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種貴金屬納米顆粒及其制備方法和在制備免疫探針中的應(yīng)用，尤其 涉及一種笛納米籠及其制備方法和在制備免疫探針及電化學(xué)免疫傳感器中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 癌癥是一種致命的疾病，每年，全球范圍內(nèi)因癌癥死亡的人數(shù)達(dá)700萬(wàn)人，我國(guó)也 有100萬(wàn)人因此失去生命。癌癥患者存活的可能性，很大程度上依賴(lài)于癌癥的發(fā)現(xiàn)時(shí)間。 癌癥的早期發(fā)現(xiàn)和治療，是癌癥患者存活的關(guān)鍵。癌癥標(biāo)記物是癌癥發(fā)生、存在和發(fā)展的標(biāo) 志（Magdalena Swierczewska, Gang Liu, Seulki Lee,Xiaoyuan Chen,High-sensitivity nanosensors for biomarker detection, Chem. Soc. Rev. , 2011, 41, 2641-2655.)。因 此，癌癥標(biāo)志物的靈敏檢測(cè)是癌癥的早期發(fā)現(xiàn)和治療的關(guān)鍵因素。目前，對(duì)癌癥標(biāo)志物 的檢測(cè)有酶聯(lián)免疫法、比色法、英光法和表面等離子共振等方法，但送些方法往往存在耗 時(shí)、設(shè)備昂貴、過(guò)程繁瑣和靈敏度低等問(wèn)題。綜合考慮上述因素，電化學(xué)方法由于具有操 作簡(jiǎn)單，成本低、靈敏度高等特點(diǎn)，而成為檢測(cè)癌癥標(biāo)志物最理想的方法之一（Aicheng Qien, San曲amitra Qiatterjee, Qiem. Soc. Rev.,2013, 42, 5425-5438.)。電化學(xué)實(shí)驗(yàn)是依 靠檢測(cè)固定在電極上的電化學(xué)物質(zhì)來(lái)給出信號(hào)的。一般使用夾必型電化學(xué)方法檢測(cè)癌癥標(biāo) 記的工作原理如下；（1)利用電活性物質(zhì)來(lái)標(biāo)記示蹤抗體；(2)通過(guò)示蹤抗體識(shí)別分析物；
[3]利用電活性物質(zhì)提供的信號(hào)確定固定在電極表面的目標(biāo)生物標(biāo)記物的濃度。然而，目前 的電化學(xué)檢測(cè)主要集中在單一的腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)，但是由于單一一種癌癥標(biāo)志物與癌癥 之間的靈敏性和特異性很差，因此沒(méi)有一種癌癥標(biāo)志物能成為"理想"的癌癥篩查工具。與 傳統(tǒng)的單祀標(biāo)免疫分析相比，多祀標(biāo)免疫分析有著分析時(shí)間短、樣品體積減小、檢測(cè)效率提 高、成本降低等優(yōu)點(diǎn)，因此多祀標(biāo)的同時(shí)檢測(cè)對(duì)于癌癥的精確診斷也具有很重要的意義。
[0003] 對(duì)于多祀標(biāo)免疫分析，首要問(wèn)題是如何將不同的電信號(hào)區(qū)分開(kāi)來(lái)W及在此基礎(chǔ)上 得到較大的電流。在納米顆粒擴(kuò)增電化學(xué)信號(hào)增強(qiáng)電流的過(guò)程中，貴金屬笛納米顆粒由于 具有良好的導(dǎo)電性，易于負(fù)載抗體W及對(duì)過(guò)氧化氨的催化性質(zhì)能夠進(jìn)一步增強(qiáng)電流等優(yōu) 點(diǎn)。因此在電化學(xué)免疫傳感器的應(yīng)用中可W作為良好的載體。
[0004] 本發(fā)明通過(guò)笛納米籠為載體，通過(guò)先負(fù)載抗體，后連接信號(hào)物質(zhì)的方式制備出笛 納米籠免疫探針。由于笛的價(jià)格昂貴，因此納米籠型結(jié)構(gòu)能夠降低了成本，并且笛的催化性 能受其形貌的影響比較大，而立方體形的納米籠結(jié)構(gòu)比球形的笛顆粒對(duì)過(guò)氧化氨具有更好 的催化效果，因此其信號(hào)擴(kuò)增的效果更加明顯。由于貴金屬納米顆粒對(duì)帶有氨基、琉基等功 能基的電信號(hào)物質(zhì)有優(yōu)秀的結(jié)合能力，因此，使用笛納米籠連接峰電位能區(qū)分的電信號(hào)物 質(zhì)能夠?qū)崿F(xiàn)兩種癌癥標(biāo)記物甚至多種癌癥標(biāo)記物的同時(shí)檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的之一在于提供一種立方體形的笛納米籠狀顆粒及其制備方法；
[0006] 本發(fā)明的目的之二在于提供一種由所述新型笛納米籠狀顆粒制備得到的笛納米 籠免疫探針；
[0007] 本發(fā)明的目的之H在于提供一種由笛納米籠免疫探針制備得到的電化學(xué)免疫傳 感器。
[0008] 本發(fā)明的的上述目的是通過(guò)W下技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)的：
[0009] 本發(fā)明的一種立方體形的笛納米籠狀顆粒，其特征在于通過(guò)W下方法制備得到：
[0010] (1)將十六烷基H甲基漠化倭（CTAB)的水溶液加熱至80-12(TC后，加入氯鉛酸水 溶液，然后加入抗壞血酸，反應(yīng)IO-SOmin后，離必，沉淀用去離子水清洗，然后分散在去離 子水中；
[0011] 似將步驟（1)得到的溶液和CTAB的水溶液混合，加熱至80-100。將氯笛酸鐘 水溶液加入其中，攬拌10-20小時(shí)，產(chǎn)物離必，沉淀去離子水清洗，即得。
[0012] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟（1)所述的十六烷基H甲基漠化倭（CTAB)的水溶液 的濃度為10-25mM，所加入的氯鉛酸溶液的濃度為I-IOmM,體積為十六烷基H甲基漠化倭 (CTAB)的水溶液體積的1/20-1/30,所加入的抗壞血酸與氯鉛酸的摩爾比為1:0. 1-1。
[0013] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟（2)所加入的CTAB水溶液的濃度為6-25mM，所加入的量 為步驟（1)得到的溶液體積的2-5倍，所加入的氯笛酸鐘水溶液的濃度為0.I-IOmM,所加入 的量為步驟（1)得到的溶液體積的1/5-1/2。
[0014] 在本發(fā)明中，首先通過(guò)步驟（1)得到了鉛納米立方體顆粒，然后通過(guò)步驟（2)將鉛 納米立方體顆粒中的鉛原子置換為笛原子，從而得到了一種立方體形的納米籠結(jié)構(gòu)。本發(fā) 明方法簡(jiǎn)單，且制備得到的笛納米籠狀顆粒尺寸均一，實(shí)驗(yàn)證明，立方體形的納米籠結(jié)構(gòu)相 較于球形的笛顆粒對(duì)過(guò)氧化氨具有更好的催化效果，因此其信號(hào)擴(kuò)增的效果更加明顯。因 此使用該笛納米籠制備的免疫探針制備電化學(xué)免疫傳感器信號(hào)強(qiáng)且穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，且通 過(guò)標(biāo)記峰電位能夠區(qū)分的電信號(hào)物質(zhì)實(shí)現(xiàn)了雙祀標(biāo)的同時(shí)檢測(cè)。
[0015] 因此，進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了所述的笛納米籠狀顆粒在制備笛納米籠免疫探 針中的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明的一種笛納米籠免疫探針，其特征在于通過(guò)W下方法制備得到：
[0017] (1)將W上任一項(xiàng)所述的笛納米籠狀顆粒用磯酸緩沖液洗涂、分散；
[0018] (2)室溫下，將笛納米籠狀顆粒與抗體混合，離必除去上清液；
[0019] (3)沉淀用磯酸緩沖液洗涂、分散后與電信號(hào)物質(zhì)混合，離必除去上清液；
[0020] (4)沉淀用磯酸緩沖液洗涂，得到的笛納米籠免疫探針?lè)稚⒌酱壦峋彌_液中，于 4°C儲(chǔ)存。
[002。 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟（1)、似或（4)中所用磯酸緩沖液為0.1M，抑值為 5. 0-8. 0,且含有0.IMKCl的磯酸緩沖液。
[0022] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的電信號(hào)物質(zhì)包括硫堇和琉基二茂鐵。
[0023] 進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了所述的笛納米籠免疫探針在制備電化學(xué)免疫傳感器中 的應(yīng)用，優(yōu)選的，按照本發(fā)明所述的方法分別制備偶聯(lián)兩種或多種抗體及峰電位能區(qū)分的 兩種或多種電信號(hào)物質(zhì)的笛納米籠免疫探針，將制得的兩種或多種笛納米籠探針固定在電 極的表面，得到能夠同時(shí)對(duì)兩種或多種標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)的電化學(xué)免疫傳感器。
[0024] 在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，作為范例，給出了一種能夠同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤標(biāo)志物CEA 和AFP進(jìn)行檢測(cè)的電化學(xué)免疫傳感器，其是通過(guò)W下方法制備得到：
[0025] (1)將本發(fā)明中所述的笛納米籠狀顆粒用磯酸緩沖液洗涂、分散；
[002引 似室溫下，將笛納米籠狀顆粒分別與CEA和AFP抗體混合，離必除去上清液；
[0027] (3)沉淀用PBS洗涂、分散后與分別與硫堇和琉基二茂鐵混合，離必除去上清液；
[0028] (4)沉淀用PBS洗涂，得到的笛納米籠免疫探針?lè)稚⒌酱壦峋彌_液中，制得的笛納 米籠免疫探針于4°C儲(chǔ)存；
[0029] (5)通過(guò)免疫反應(yīng)將制得的兩種笛納米籠探針固定在電極的表面，即得。
[0030] 本發(fā)明通過(guò)將立方體形的笛納米籠狀顆粒分別負(fù)載甲胎蛋白（AF巧和癌胚抗原 (CEA)的抗體后，通過(guò)分別標(biāo)記琉基二茂鐵和硫堇，制備了兩種笛納米籠免疫探針，通過(guò)免 疫反應(yīng)將制得的兩種笛納米籠探針固定在電極的表面從而得到了一種電化學(xué)免疫傳感器， 使用該電化學(xué)免疫傳感器可W實(shí)現(xiàn)對(duì)癌胚抗原和甲胎蛋白的同時(shí)檢測(cè)，并且具有較低的檢 出限、較寬的檢測(cè)范圍和良好的重現(xiàn)性。
[0031] 實(shí)驗(yàn)證明；利用笛納米籠電化學(xué)免疫探針同時(shí)檢測(cè)不同濃度的癌胚抗原（CEA)和 甲胎蛋白（AFP)，其檢測(cè)線性范圍分別為0. 05-200ng/mL和0. 03-100ng/mL。檢出限分別為 0. 014ng/mL和 0.OlOng/mL。
[0032] 因此，進(jìn)