快速檢測大豆致敏蛋白glycinin的膠體金免疫層析試紙及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種快速檢測大豆致敏蛋白glycinin的膠體金免疫層析試紙及制備 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近幾年,食物過敏逐漸成為重要的食品安全問題,引起了各國食品安全監(jiān)督管理 部門的重視。一些發(fā)達國家為保護食物過敏人群,專門立法規(guī)定食品包裝上要標注食物過 敏原,我國在2012年實施的食品安全國家標準《預(yù)包裝食品標簽通則》(GB 7718-2011)中 也推薦食品包裝上標注致敏物質(zhì)。因此,針對食品過敏原的檢測技術(shù)就顯得意義重大,可為 食品安全提供重要的技術(shù)依據(jù)。
[0003] 大豆中蛋白質(zhì)含量豐富,一般為35°/『38%,氨基酸組成平衡,且富含不飽和脂肪酸, 是人體和動物體重要的植物蛋白和植物油來源。由于其種植面積廣,產(chǎn)量大,長久以來一直 被廣泛應(yīng)用于食品和飼料的加工原料,然而,大豆也是聯(lián)合國糧農(nóng)組織認定的8種最重要 的食物過敏源之一。這主要是因為大豆中含有一系列過敏原,容易在嬰幼兒和幼齡動物體 內(nèi)引起IgE (Immunoglobulin E)抗體介導(dǎo)的速發(fā)型(I型)超敏反應(yīng),從而導(dǎo)致腸內(nèi)組胺過 量釋放等過敏性損傷。
[0004] 自1934年Duke發(fā)現(xiàn)大豆可引起嬰兒腹瀉、腸炎等反應(yīng),提出大豆可能是一個重 要的過敏源以來,人們對于大豆中致敏因子的研宄逐步深入。據(jù)統(tǒng)計,大豆過敏原會導(dǎo)致 大約0. 4%的兒童產(chǎn)生過敏反應(yīng),過敏原數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站(http://www. allergenonline. org) 在2014年1月更新的數(shù)據(jù)信息顯示,大豆中共存在38種過敏原,這些過敏原是大豆及其 制品中能夠?qū)е氯嘶蛐笄葸^敏的蛋白質(zhì)或糖蛋白,包括大豆疏水蛋白(Gly m 1)、大豆外 殼蛋白(Gly m 2)、大豆抑制蛋白(Gly m 3)、大豆球蛋白(Glycinin)、β-伴大豆球蛋白 (β-conglycinin)、大豆空泡蛋白(Gly m Bd 30Κ)、胰蛋白酶抑制因子等。其中g(shù)lycinin 大豆中最主要的致敏蛋白之一,并且大量的動物試驗研宄也表明,glycinin可以導(dǎo)致犢牛、 仔豬和鼠等幼齡動物發(fā)生過敏反應(yīng)。當(dāng)其存在于嬰幼兒食品以及幼齡動物飼料中,就很可 能會誘發(fā)過敏反應(yīng)。但是,嬰幼兒配方食品和復(fù)合飼料所用的原料成分較多,其中存在的 glycinin含量相對于其他原料往往很低,這就增加了快速、準確、定量檢測的難度。
[0005] 免疫層析試紙檢測方法具有成本低、快速、便攜且易操作等優(yōu)點,可以用于大批量 樣品的定性與定量檢測,在準確性和靈敏度上也能夠滿足要求,該法分析過程簡單,用作 glycinin的檢測有獨特優(yōu)勢,是需要優(yōu)先發(fā)展的檢測技術(shù)。但目前仍沒有關(guān)于大豆致敏蛋 白glycinin免疫層析試紙檢測方法的報道,所以該方法將會成為未來大豆過敏原檢測方 法的一個發(fā)展方向。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題:針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足,提供一種特異、靈敏、簡便、 安全、快速檢測glycinin的免疫層析試紙及其制備方法。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案: 一種快速檢測glycinin的膠體金免疫層析試紙,底層為支撐層,中間層為吸附層,保 護層固定在吸附層上,吸附層從測試端依次為樣品墊、結(jié)合墊、纖維素膜和吸水墊。在纖維 素膜設(shè)有用glycinin兔源多克隆抗體溶液噴點的檢測線以及用羊抗小鼠 IgG抗體或兔抗 小鼠 IgG抗體溶液噴點的質(zhì)控線;所述結(jié)合墊吸附有膠體金納米顆粒標記的glycinin鼠源 單克隆抗體。
[0008] 所述支撐層用不吸水的韌性材料制成;樣品墊用玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏二氟乙 烯膜或聚酯膜制成;結(jié)合墊用玻璃纖維棉、聚酯膜、醋酸纖維或尼龍膜制成;纖維素膜用硝 酸纖維素膜、純纖維素膜或羧化纖維素膜制成;吸水墊用吸水濾紙或濾油紙制成。纖維素膜 上的隱形檢測線和隱形質(zhì)控線為平行排列的" I I "直線式,或為其他類似印記。
[0009] 快速檢測glycinin的膠體金免疫層析試紙的制備方法:包括用膠體金納米顆粒 標記的glycinin鼠源單克隆抗體(金標單抗)制備結(jié)合墊,用glycinin兔源多克隆抗體溶 液噴點隱形檢測線,用羊抗小鼠 IgG抗體或兔抗小鼠 IgG抗體溶液噴點隱形質(zhì)控線,然后在 支撐層上黏貼樣品墊、結(jié)合墊、纖維素膜和吸水墊。在所述樣品墊、結(jié)合墊及吸水墊上覆蓋 有保護膜,在樣品墊與結(jié)合墊交界處對應(yīng)的保護膜上噴點有樣品標記線,最后加上保護層。
[0010] 該試紙利用雙抗體夾心檢測抗原的原理,當(dāng)試紙測試端插入待測樣品溶液后,待 測溶液通過虹吸作用帶動待測glycinin及結(jié)合墊中的金標單抗一起向纖維素膜擴散,并 最終滲入手柄端的吸水材料層。在擴散過程中待測glycinin可先與金標單抗相結(jié)合,進而 與纖維素膜上噴點的兔源多克隆抗體檢測線結(jié)合,金標抗體和兔源多克隆抗體分別與樣品 中被檢測的glycinin分子上的不同抗原決定簇結(jié)合,glycinin被夾在金標單抗和兔源多 克隆抗體之間,形成金標單抗-抗原-兔源多抗復(fù)合物,即雙抗體夾心模式,顯示紅色檢測 印記" I ";纖維素膜上噴點的羊或兔抗小鼠 IgG抗體質(zhì)控線也可與金標抗體結(jié)合,形成紅色 質(zhì)控印記" I ",即兩條紅色印記" I I "表示為陽性;反之樣品溶液中無 glycinin時,則不 能與金標抗體結(jié)合,同樣也不能與纖維素膜上噴點的兔源多克隆抗體檢測線結(jié)合,不顯示 紅色檢測印記,而纖維素膜上噴點的羊或兔抗小鼠 IgG抗體質(zhì)控線可與金標抗體結(jié)合,顯 示紅色質(zhì)控線印記" I ",形成一條紅色印記" I "表示為陰性。無論結(jié)果為陽性還是陰性, 都會顯示紅色質(zhì)控印記,若不顯示則表示試紙失效。
[0011] 本發(fā)明的積極有益效果: (1)特異性強,靈敏度高。本發(fā)明試紙以雙抗體夾心原理為基礎(chǔ)制備而成,兩種抗體分 別為膠體金納米顆粒標記的鼠源單克隆抗體和兔源多克隆抗體。金標抗體中金顆粒與抗體 分子之間無共價鍵形成,二者通過異性電荷間的范德華力相結(jié)合,膠體金標記對抗體的特 異性及親和力影響很小,且具有較高的標記率。試驗表明,該試紙具有較強的特異性和較高 的靈敏度,可檢測50ng/mL的微量glycinin。
[0012] (2)簡便、快速。使用本發(fā)明試紙,無需其他任何試劑和儀器,可現(xiàn)場操作。只需將 試紙插入被檢樣品液中,IOmin后即可判定檢測結(jié)果。
[0013] (3)結(jié)果顯示形象、直觀、準確。本發(fā)明試紙以顯示紅色印記" I I "和" I "(或類 似性狀)作為檢測的陽性和陰性標記,即在纖維素膜上顯示兩條紅色印記" I I "(檢測線和 質(zhì)控線),表示被檢樣品中含有g(shù)lycinin;顯示一條紅色印記" I "(質(zhì)控線),表示被檢樣品 中不含glycinin。此結(jié)果可用肉眼直接觀測,判定形象、直觀、準確,簡單明了,不易出現(xiàn)假 陽性和假陰性等人為誤判。
[0014] (6)節(jié)省費用。適用于進行現(xiàn)場檢測,費用低廉,節(jié)省大量貴重儀器及設(shè)備費用。
[0015] (7)適用范圍廣,便于推廣應(yīng)用。本發(fā)明實現(xiàn)了基于雙抗體夾心的原理在快速檢測 glycinin膠體金免疫層析試紙中的應(yīng)用,該試紙操作簡便,能滿足不同層次人員的需要,包 括海關(guān)檢疫、衛(wèi)生檢疫、質(zhì)量監(jiān)測、農(nóng)畜產(chǎn)品生產(chǎn)企業(yè)和飼料加工企業(yè)等。本發(fā)明在保障食 品安全、保護對于大豆過敏的消費者健康以及保障畜禽飼料安全等方面具有極其重要的意 義,將具有明顯的經(jīng)濟效益和社會效益。
[0016] (8)本發(fā)明制備的單克隆抗體的特異性較好,以glycinin的半數(shù)抑制濃度(IC5tl) 與各競爭物的IC5tl的百分比作為交叉反應(yīng)率,單克隆抗體與其他食物致敏蛋白競爭物之間 基本沒有交叉反應(yīng),結(jié)果表明其對于glycinin具有良好的特異性。同時通過Western blot 試驗對單克隆抗體的特異性進行鑒定,顯色結(jié)果表明,單克隆抗體與分子量約為40 kDa的 條帶特異結(jié)合,通過與電泳條帶之間的對照,可以清晰看出單克隆抗體只與glycinin酸性 多肽鏈中的A3鏈特異性反應(yīng),與其他大豆蛋白成分沒有反應(yīng)。證明所篩選的雜交瘤細胞分 泌的單克隆抗體特異性強,與其他致敏蛋白無交叉反應(yīng),能夠用于膠體金納米顆粒的標記, 并能夠噴點結(jié)合墊進而對樣品中的glycinin進行特異識別。
【附圖說明】
[0017] 圖1為大豆致敏蛋白gly