一種用于分離樹苔浸膏中萜烯類組分的高速逆流色譜方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種用于分離樹苔浸膏中萜烯類組分的高速逆流色譜方法，包括如下步驟：1)將正己烷、乙酸乙酯、乙醇、水按照體積比0.7-1.1:0.7-1.1：0.8-1.1：0.8-1.1進行混合，劇烈振蕩、靜置后將溶液分為兩層，上層作為固定相，下層作為流動相；2)采用流動相分散樹苔浸膏，得到待分離的樣品溶液；3)采用高速逆流色譜對樣品溶液進行分離，根據(jù)紫外吸收圖收集相應的餾分，餾分經(jīng)溶劑脫除工藝后，得到相對含量在90％以上的萜烯類組分。該方法條件溫和，分離效率高，穩(wěn)定性好，工藝流程簡單，易于實現(xiàn)推廣使用和工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】一種用于分離樹苔浸膏中萜烯類組分的高速逆流色譜方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及天然香料組分分離方法【技術領域】，更具體的涉及一種應用高速逆流色 譜從樹苔浸膏中分離萜烯類組分的方法。

【背景技術】
[0002] 樹苔浸膏（treemoss concrete)為棕綠色膏狀物，由采用屬于松蘿科扁枝衣屬的 一種茶漬目地衣植物作為原料，經(jīng)石油醚或苯浸提等一定的加工工藝而制得。樹苔浸膏由 于具有獨特的苔類物質(zhì)的自然青香和濃郁的樹脂氣息等香氣特征，常用作煙草添加劑及日 用化妝品自然清香的香原料，在天然香料國際市場，是重要的地衣香料。
[0003] 浸膏類香料的成分復雜，其質(zhì)量、成分不但與植物種類有關，同時也隨著土壤成 分、氣候條件、生長季節(jié)、生成年齡、收割時間、儲運情況而異。以橡苔浸膏為例，產(chǎn)于不同國 家的橡苔制備的浸膏的香氣風格有較大差異，如中國產(chǎn)橡苔浸膏的柔扁枝衣酸乙酯的含量 遠高于國外的橡苔浸膏。事實上，即使是同一地區(qū)的橡苔原料，發(fā)酵、加工等工藝的細微變 化也會引起主要成分含量的變化。有學者認為正是由于這些化合物含量的不同，形成了上 百種不同品種、不同產(chǎn)地和不同廠家的橡苔、樹苔制品。因此，如何準確地對樹苔浸膏的化 學組分進行定性定量分析一直是研究熱點。
[0004] 浸膏類物質(zhì)一般需要經(jīng)過一系列的前處理后才能進行色譜分析，目前常用的前處 理方法主要有固相微萃取、同時蒸餾萃取以及水蒸汽蒸餾等，但是，不同的前處理方式均存 在一定的局限性。
[0005] 萜烯，簡稱萜，是一系列萜類化合物的總稱，是分子式為異戊二烯的整數(shù)倍的烯烴 類化合物。萜烯是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的天然來源碳氫化合物，可從許多植物，特別是 針葉樹得到。很多萜類化合物具有重要的生理活性，是研究天然產(chǎn)物和開發(fā)新藥的重要來 源。有文獻報道，樹苔浸膏中也含有多種異松油烯、檸檬烯、杜松烯、丁子香烯等揮發(fā)性萜類 成分，這些物質(zhì)為縮酚羧酸、縮酚酸環(huán)醚等次生代謝產(chǎn)物的降解產(chǎn)物，這些組分所占的比例 盡管較小，但是大多有一定的甜香、木香、青香等特征，因此對樹苔浸膏的香氣具有一定的 貝獻。
[0006] 采用不同的前處理方式對樹苔浸膏進行分析，鑒定出來的萜類物質(zhì)的種類并不相 同，如采用分子蒸餾法鑒定出杜松萜烯，同時蒸餾萃取法則鑒定出 Y-杜松萜烯、β-杜 松萜烯，而石竹烯、α -白菖考烯、別香樹烯等幾種萜類則僅在同時蒸餾萃取法中鑒定出來。 一方面是由于兩種處理方法之間的根本差異所造成，如同時蒸餾萃取方法的處理條件較分 子蒸餾劇烈的多，在處理過程中導致縮酚羧酸類物質(zhì)水解。另一方面，也可能是因為這些揮 發(fā)性萜類物質(zhì)存在多種同分異構(gòu)體，理化性質(zhì)極為相近，在有限柱效及一定色譜條件下，各 種萜類成分之間分離度不佳，最終導致色譜峰難以定性或者定性不準確。
[0007] 高速逆流色譜（high-speed countercurrent chromatography, HSCCC)是 20 世紀 80年代發(fā)展起來的一種連續(xù)高效的液-液分配色譜分離技術。主要是將兩溶劑的分配體系 置于高速旋轉(zhuǎn)的螺旋管內(nèi)，螺旋管的運動形式，是在自身自轉(zhuǎn)的基礎上，同時繞一公轉(zhuǎn)軸旋 轉(zhuǎn)，形成行星運動。由此加在分配體系上的離心力場不斷發(fā)生變化，使兩相溶劑充分的混合 和分配，從而達到洗脫分離目的。因為樣品中各組分在兩相中分配系數(shù)不同，導致組分在螺 旋柱中的移動速度不同，因而能使樣品組分按分配系數(shù)的大小次序被依次洗脫下來。該技 術由于具有儀器設備簡單、價廉、操作方便、分離效率高等優(yōu)點，在提取分離天然產(chǎn)物中的 黃酮、生物堿、香豆素、等有效成分方面已獲得滿意結(jié)果。然而，截至目前，尚未見到有應用 高速逆流色譜分離浸膏中萜烯類組分的專利和文獻報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明要解決的第一個技術問題是提供一種用于分離樹苔浸膏中萜烯類組分的 高速逆流色譜方法，該方法能實現(xiàn)樹苔浸膏中萜烯類組分與其他組分的有效分離。
[0009] 為解決上述第一個技術問題，本發(fā)明采用下述技術方案：
[0010] 一種用于分離樹苔浸膏中萜烯類組分的高速逆流色譜方法，其特征在于，包含如 下步驟：
[0011] 1)溶劑配制：將正己烷、乙酸乙酯、乙醇、水混合、振蕩、靜置，靜置后混合液分為 兩層，分層后的上層作為固定相，下層作為流動相；
[0012] 2)樣品分散：稱取樹苔浸膏樣品，加入步驟1)得到的流動相，攪拌后超聲分散，得 到待分離的樣品溶液；
[0013] 3)將步驟1)所得固定相充滿高速逆流色譜的分離柱，隨后泵入流動相，待所述流 動相從出口流出后，兩相溶劑體系在色譜分離柱中達到平衡；
[0014] 4)將步驟2)得到的樣品溶液推入進樣圈，樹苔浸膏樣品中的各組分在固定相與 流動相之間分配分離，采用紫外檢測器檢測餾分，根據(jù)紫外吸收圖收集餾分，得到樹苔浸膏 中的萜烯類組分。
[0015] 優(yōu)選地，所述步驟1)中正己烷、乙酸乙酯、乙醇、水按照體積比0. 7-1. 1:0. 7-1. 1 : 0. 8-1. 1 :0. 8-1. 1進行混合，所述振蕩時間為15-20min，所述靜置時間為2-3h ;優(yōu)選地，正 己烷、乙酸乙酯、乙醇、水按照體積比0. 9:0. 9:1:1混合。
[0016] 優(yōu)選地，步驟2)所述流動相的質(zhì)量為樣品質(zhì)量的20-30倍，所述超聲時間為 5_10min〇
[0017] 優(yōu)選地，所述步驟3)中所述固定相以10-30ml/min的流速充滿高速逆流色譜的分 離柱，當主機轉(zhuǎn)速達到750-900rpm時，以3-7ml/min的流速泵入流動相；優(yōu)選地，當主機轉(zhuǎn) 速達到820-860rpm時，以4-6ml/min的流速泵入流動相。
[0018] 優(yōu)選地，所述步驟4)中紫外檢測波長為254nm或365nm。
[0019] 優(yōu)選地，步驟4)得到的萜烯類餾分可經(jīng)萃取、蒸發(fā)、干燥等除去其中的溶劑。
[0020] 優(yōu)選地，步驟4)得到的樹苔浸膏中的萜烯類組分經(jīng)GC/MS檢測，相對含量達90% 以上。
[0021] 進一步地，該方法包含如下步驟：
[0022] 1)將正己烷、乙酸乙酯、乙醇、水按照體積比0.9:0.9:1:1配制于分液漏斗中，振 蕩15min后靜置分層。待平衡2小時后，將上相和下相分開，取上相作為固定相，下相作為 流動相；
[0023] 2)樣品分散：稱取樹苔浸膏樣品，加入浸膏質(zhì)量20倍的步驟1)得到的流動相，攪 拌后超聲lOmin進行分散，得到待分離的樣品溶液；
[0024] 3)用固定相以20mL/min流速充滿整個柱子；調(diào)整主機轉(zhuǎn)速850rpm，以4ml/min的 流速將流動相泵入柱內(nèi)；待整個體系建立動態(tài)平衡；
[0025] 4)將步驟2)得到的樣品溶液推入進樣圈，樹苔浸膏樣品中的各組分在固定相與 流動相之間分配分離，采用紫外檢測器檢測餾分，根據(jù)紫外吸收圖收集餾分，得到樹苔浸膏 中的萜烯類組分。
[0026] 本發(fā)明的有益效果如下：
[0027] 首次將高速逆流色譜方法引入樹苔浸膏的成分分離，采用了組成和配比合理的混 合溶劑，僅通過主機轉(zhuǎn)速和流動相等工藝條件的控制即可獲得樹苔浸膏中的萜烯類組分， 有利于進一步準確定性、定量樹苔浸膏中的萜烯類組分；分離過程中，條件溫和，沒有引入 酸堿，也不需要使用固相載體，因此整個過程中不會產(chǎn)生不可逆吸附，減少了化合物性質(zhì)的 變化，樣品無損失、無污染；本發(fā)明的方法操作簡便，工藝流程簡單，得到的萜烯類組分的相 對含量可達90%以上，提供了一種獲取萜烯類組分的新方法，且易于推廣使用，亦可以用于 其他天然香料中萜烯類組分的分離和制備。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0028] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細的說明。
[0029] 圖1為實施例1從樹苔浸膏中分離萜烯類組分的高速逆流色譜圖；
[0030] 圖2為實施例1中用高速逆流色譜分離出的萜烯類組分的GC/MS總離子流圖。

【具體實施方式】
[0031] 為了更清楚地說明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實施例和附圖對本發(fā)明做進一步的說 明。附圖中相似的部件以相同的附圖標記進行表示。本領域技術人員應當理解，下面所具 體描述的內(nèi)容是說明性的而非限制性的，不應以此限制本發(fā)明的保護范圍。
[0032] 實施例1
[0033] 將正己烷、乙酸乙酯、乙醇、水按照體積比0. 9:0. 9:1:1進行混合，劇烈振蕩 15min，靜置2h后混合溶液分為兩層，分層后的上層作為固定相，下層作為流動相；稱取lg 的樹苔浸膏樣品，加入20ml流動相，攪拌后超聲lOmin進行分散，得到待分離的樣品溶液。
[0034] 采用TBE-300型半制備高速逆流色譜儀（上海同田生化技術有限公司），該儀器 配有泵、10_30ml進樣閥、紫外檢測器和記錄儀，其多層纏繞聚四氟乙烯管的柱容量為約 300ml。先用固定相以10mL/min流速充滿高速逆流色譜的分離柱，然后開啟速度控制器，使 高速逆流色譜儀按順時針方向旋轉(zhuǎn)，當主機速度達到850rpm時，以3ml/min的流速泵入流 動相；待所述流動相從出口流出后，兩相溶劑體系在色譜分離柱中達到平衡；將待分離的 樣品溶液推入進樣圈，根據(jù)紫外吸收圖收集餾分，餾分經(jīng)溶劑脫除工藝后采用GC/MS檢測， 萜烯類組分的相對含量為93%左右。如圖1為本實施例的樹苔浸膏中萜烯類組分的高速逆 流色譜圖，圖中色譜峰1、2、3為目標餾分；圖2為本實施例的GC/MS總離子流圖，以C10-C40 正構(gòu)烷烴作為標準，以各正構(gòu)烷烴的保留時間計算樣品中化合物的保留指數(shù)，結(jié)合數(shù)據(jù)庫 檢索（Nist08、Wily7.0)，質(zhì)譜圖解析技術的結(jié)果，并與文獻數(shù)據(jù)相比較，對圖2中的各色譜 峰進行了化學成分定性，各色譜峰的定性結(jié)果如表1所示。表1的結(jié)果可以看出，圖2的色 譜圖共鑒定出了 14種萜烯類化合物。
[0035] 表1質(zhì)譜圖的解析結(jié)果

【權(quán)利要求】
1. 一種用于分離樹苔浸膏中萜烯類組分的高速逆流色譜方法，其特征在于，包含如下 步驟： 1) 溶劑配制：將正己烷、乙酸乙酯、乙醇、水混合、振蕩、靜置，靜置后混合液分為兩層， 分層后的上層作為固定相，下層作為流動相； 2) 樣品分散：稱取樹苔浸膏樣品，加入步驟1)得到的流動相，攪拌后超聲分散，得到待 分離的樣品溶液； 3) 將步驟1)所得固定相充滿高速逆流色譜的分離柱，隨后泵入流動相，待所述流動相 從出口流出后，兩相溶劑體系在色譜分離柱中達到平衡； 4) 將步驟2)得到的樣品溶液推入進樣圈，樹苔浸膏樣品中的各組分在固定相與流動 相之間分配分離，采用紫外檢測器檢測餾分，根據(jù)紫外吸收圖收集餾分，得到樹苔浸膏中的 萜烯類組分。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于分離樹苔浸膏中萜烯類組分的高速逆流色譜方 法，其特征在于：所述步驟1)中正己烷、乙酸乙酯、乙醇、水按照體積比0. 7-1. 1:0. 7-1. 1 : 0. 8-1. 1 :0. 8-1. 1進行混合，所述振蕩時間為15-20min，所述靜置時間為2-3h ;優(yōu)選地，正 己烷、乙酸乙酯、乙醇、水按照體積比0. 9:0. 9:1:1混合。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于分離樹苔浸膏中萜烯類組分的高速逆流色譜方法， 其特征在于：步驟2)所述流動相的質(zhì)量為樣品質(zhì)量的20-30倍，所述超聲時間為5-10min。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于分離樹苔浸膏中萜烯類組分的高速逆流色譜方法， 其特征在于：所述步驟3)中所述固定相以10-30ml/min的流速充滿高速逆流色譜的分離 柱，當主機轉(zhuǎn)速達到750-900rpm時，以3-7ml/min的流速泵入流動相；優(yōu)選地，當主機轉(zhuǎn)速 達到820-860rpm時，以4-6ml/min的流速泵入流動相。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于分離樹苔浸膏中萜烯類組分的高速逆流色譜方法， 其特征在于：所述步驟4)中紫外檢測波長為254nm或365nm。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于分離樹苔浸膏中萜烯類組分的高速逆流色譜方法， 其特征在于：步驟4)得到的萜烯類餾分可經(jīng)萃取、蒸發(fā)、干燥等除去其中的溶劑。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于分離樹苔浸膏中萜烯類組分的高速逆流色譜方法， 其特征在于：步驟4)得到的樹苔浸膏中的萜烯類組分經(jīng)GC/MS檢測，相對含量達90%以 上。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于分離樹苔浸膏中萜烯類組分的高速逆流色譜方法， 其特征在于，包含如下步驟： 1) 將正己烷、乙酸乙酯、乙醇、水按照體積比0.9:0. 9:1:1配制于分液漏斗中，振蕩 15min后靜置分層。待平衡2小時后，將上相和下相分開，取上相作為固定相，下相作為流動 相； 2) 樣品分散：稱取樹苔浸膏樣品，加入浸膏質(zhì)量20倍的步驟1)得到的流動相，攪拌后 超聲lOmin進行分散，得到待分離的樣品溶液； 3) 用固定相以20mL/min流速充滿整個柱子；調(diào)整主機轉(zhuǎn)速850rpm，以4ml/min的流速 將流動相泵入柱內(nèi)；待整個體系建立動態(tài)平衡； 4) 將步驟2)得到的樣品溶液推入進樣圈，樹苔浸膏樣品中的各組分在固定相與流動 相之間分配分離，采用紫外檢測器檢測餾分，根據(jù)紫外吸收圖收集餾分，得到樹苔浸膏中的 萜烯類組分。
【文檔編號】G01N30/42GK104155395SQ201410404835
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月15日
【發(fā)明者】朱懷遠, 莊亞東, 秦艷華, 劉琪, 曹毅, 張媛, 尤曉娟, 沈曉晨, 劉獻軍 申請人:江蘇中煙工業(yè)有限責任公司