專利名稱：高效液相色譜法中分離蠶豆中左旋多巴的流動相的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及ー種生物中左旋多巴成分含量的測定方法，尤其涉及一種高效液相色譜法中分離蠶豆中左旋多巴的流動相。
背景技術(shù)：
左旋多巴(Levodopa，L-D0PA)，即3，4_ ニ羥基苯丙氨酸，是生物體內(nèi)兒茶酚胺類激素、神經(jīng)遞質(zhì)(如去甲腎上腺素、多巴胺)和黑色素的代謝前體，主要用于治療帕金森病(Parkinson s disease),因此測定該藥物制劑和生物樣品中左旋多巴的含量具有重要意義。近年來左旋多巴的體內(nèi)外分析方法都取得了很大進展，紫外分光光度法、高效液相色譜法在左旋多巴的體內(nèi)外分析中應用最廣，流動注射自動分析方法和毛細管電泳法等也有廣 泛應用，可見-紫外分光光度檢測器、熒光檢測器、電化學檢測器、化學發(fā)光檢測、蒸發(fā)光散射檢測器等新型檢測器都有報道。L-DOPA的芳香環(huán)和羧基結(jié)構(gòu)決定了該分子具有一定的紫外吸收，因此分光光度法和液相色譜法是可供選擇的定量方法。它的兒茶酚結(jié)構(gòu)可以發(fā)生氧化還原反應，為電化學檢測、衍生化檢測和比色法奠定了基礎。中國藥典規(guī)定，L-DOPA原料采用非水滴定法，片劑采用紫外分光光度法測定含量，如Nagaraja等用紫外分光光度法測定制劑中兒茶酚胺衍生物多巴胺、左旋多巴、甲基多巴和腎上腺素的含量。該方法穩(wěn)定，具有良好的靈敏度和準確性，簡便快速，不需復雜的設備。對于單方制劑，在沒有輔料干擾的情況下，這是可行的；但生物樣品與藥物制劑相比，藥物濃度更低，樣品成分更復雜，因此在測定生物樣品中左旋多巴濃度時，需采用高靈敏度、高分辨率的方法。HPLC (高效液相色譜)法和毛細管電泳法成為較為理想的分析方法，其中以RPHPLC-ED (反相高效液相色譜)最為常用。HPLC法靈敏度高，操作簡便、快速、準確，易于定量分析，與紫外分光光度法、薄層掃描法測定的準確性和重現(xiàn)性均有所提高。HPLC法具有良好的分離性能，廣泛應用于食品、保健品和藥品的分析工作中，并以CS、C18反相柱居多，現(xiàn)已成為藥物分析的經(jīng)典方法。Tait, Wood、陸興毅等均采用高效液相色譜(HPLC)法測定制劑中L-DOPA的含量，但在流動相的選擇和檢測器的選用上則各有不同。除了制劑分析以外，也常見采用HPLC法測定植物資源中左旋多巴含量的報道。如趙永成以甲醇O.Olmol/L KH2PO4緩沖液(25:75，pH3. 0)為流動相，并應用紫外檢測器，在280 nm波長處測定了狗爪豆中左旋多巴的含量；黃海濱等以流動相為甲醇0. lmol/L醋酸溶液(25:75，v/v)測定藜豆中左旋多巴的含量。結(jié)果均表明，這些方法準確度高，線性關(guān)系好，重現(xiàn)性好。巫世紅等以流動相為0.1 mol/L冰醋酸溶液甲醇(95:5)測定不同采收時期貓豆中左旋多巴的含量，在此條件下，左旋多巴能達到理想的分離效果，保留時間為4. 6min。以上所述的三種流動相測定蠶豆中左旋多巴含量的結(jié)果表明，左旋多巴的出峰時間不穩(wěn)定、分離度低。可能是由于蠶豆中組分復雜，干擾成分多。因此建立一種高效液相色譜法有效分離蠶豆中左旋多巴的流動相，解決現(xiàn)有流動相組成對蠶豆中左旋多巴分離效果不理想的問題十分必要。隨著紫外檢查器的發(fā)展，在280nm處有強烈吸收的一些試劑也可以進行利用，本發(fā)明結(jié)合高效液相色譜(HPLC)發(fā)現(xiàn)多種酸可以代替磷酸/鹽酸等添加劑應用到左旋多巴的檢測，而且與儀器的兼容性非常好。高效液相色譜儀對流動相的吸收波長要求不高，但有腐蝕沉淀作用的流動相對高效液相色譜儀的部件會產(chǎn)生損害作用，如現(xiàn)有流動相中磷酸鹽緩沖液易產(chǎn)生沉淀，造成柱賽桿和密封圈摩擦，損害泵系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供ー種從蠶豆中分離左旋多巴效果好的高效液相色譜法中分離蠶豆中左旋多巴的流動相。本發(fā)明采用以下技術(shù)方案，高效液相色譜法中分離蠶豆中左旋多巴的流動相，其組成成分體積百分比為0. 1%甲酸69%-97%，こ腈2%-30%，0. I mol/L醋酸1%_10%。所述的流動相組成成分體積百分比為0· 1%甲酸90%_97%，こ臆2%_9%，O. I mol/L醋酸1%-6%。 所述的流動相優(yōu)選組成成分體積百分比為0. 1%甲酸95%，こ腈5%。本發(fā)明采用以上技術(shù)方案，利用醋酸替換磷酸鹽緩沖液，可以避免沉淀的產(chǎn)生，減少對泵系統(tǒng)造成損害，只需在流動相中加入一定比例的水以提高流動相的PH值。上述的流動相經(jīng)長期使用，對高效液相色譜儀的泵系統(tǒng)未有任何損害。所述的甲酸在任意比例的こ臆-甲酸-水中能以任意比例完全互溶，不產(chǎn)生任何沉淀，不會對泵系統(tǒng)造成損害，常年使用情況良好，用于等度洗脫時，操作簡單、省時、重現(xiàn)性好、容易重復。該流動相具有以下優(yōu)點
A. L-DOPA在甲酸中經(jīng)紫外檢測(280nm)有最大吸收且吸收值較穩(wěn)定，不受甲酸濃度的影響。B.從試劑應用角度講，本發(fā)明流動相的應用基本不受任何限制。C.使用本發(fā)明流動相檢測得到的基線穩(wěn)定，易于定量分析。D.采用該流動相與梯度方法相比，使用單泵即可實現(xiàn)分離檢測；而梯度方法需要多泵或者多元混合器才能實現(xiàn)。E.采用該流動相，除了可以對左旋多巴進行有效分離，還能分離出其他流動相無法分離的未知物質(zhì)。F.本發(fā)明流動相中存在一定比例的水，可提高流動相的PH值，減少有機酸對色譜柱造成的損害。


現(xiàn)結(jié)合附圖對本發(fā)明做進ー步詳述
圖I是采用本發(fā)明實施例I流動相對左旋多巴標準品進行分離檢測所得的HPLC-UV色譜圖； 圖2是采用本發(fā)明實施例I流動相對蠶豆花中萃取的左旋多巴進行分離檢測所得的HPLC-UV色譜 圖3是采用本發(fā)明實施例2流動相對左旋多巴標準品進行分離檢測所得的HPLC-UV色譜 圖4是采用本發(fā)明實施例2流動相對蠶豆花中萃取的左旋多巴進行分離檢測所得的HPLC-UV色譜 圖5是采用本發(fā)明實施例3流動相對左旋多巴標準品進行分離檢測所得的HPLC-UV色譜 圖6是采用本發(fā)明實施例3流動相對蠶豆花中萃取的左旋多巴進行分離檢測所得的HPLC-UV色譜 圖7是采用本發(fā)明實施例4流動相對左旋多巴標準品進行分離檢測所得的HPLC-UV色譜 圖8是采用本發(fā)明實施例4流動相對蠶豆花中萃取的左旋多巴進行分離檢測所得的HPLC-UV色譜 圖9是采用本發(fā)明實施例5流動相對左旋多巴標準品進行分離檢測所得的HPLC-UV色譜 圖10是采用本發(fā)明實施例5流動相對蠶豆花中萃取的左旋多巴進行分離檢測所得的HPLC-UV色譜 圖11是采用本發(fā)明實施例6流動相對左旋多巴標準品進行分離檢測所得的HPLC-UV色譜 圖12是采用本發(fā)明實施例6流動相對蠶豆花中萃取的左旋多巴進行分離檢測所得的HPLC-UV色譜圖。
具體實施例方式本發(fā)明流動相可以米用組成成分體積百分比為0. 1%甲酸69%_97%，こ臆2%_30%，O. I mol/L 醋酸 1%-10%。所述的流動相也可以采用組成成分體積百分比為0. 1%甲酸90%_97%，こ腈2%-9%, O. I mol/L 醋酸 1%_6%。 所述的流動相優(yōu)選的組成成分體積百分比為0. 1%甲酸95%，こ腈5%。實施例I，如圖I或2所示，采用流動相組成成分體積百分比為0. 1%甲酸95%，乙腈5%，分別對左旋多巴標準品和蠶豆花中萃取的左旋多巴進行分離檢測所得的HPLC-UV色譜圖。色譜柱為資生堂CAPCELL PAK CR色譜柱(150 mmX4. 6 mm, 5 μ m);流動相流速1.0mL/min ;檢測波長280 nm ;柱溫30 V ;進樣量20 μ L，色譜圖中橫坐標是左旋多巴標準品和蠶豆花中萃取的左旋多巴通過色譜柱的保留時間，時間以分鐘為單位，縱坐標是左旋多巴標準品和蠶豆花中萃取的左旋多巴通過色譜柱響應值電壓，該電壓響應值以伏為單位(以下實施例采用色譜柱條件同本實施例)。圖I所示色譜圖，該流動相可將左旋多巴完全基線分離，其峰值4. 915的峰面積與質(zhì)量間呈良好的線性相關(guān)性，而且基線穩(wěn)定。圖2所示色譜圖，該流動相可將左旋多巴完全基線分離和ー些未知物完全基線分離，其峰值4. 762的峰面積與質(zhì)量間呈良好的線性相關(guān)性，而且基線穩(wěn)定。
實施例2，如圖3或4所示，采用流動相組成成分體積百分比為0. 1%甲酸90%，乙腈9%，O. I mol/L醋酸1%，分別對左旋多巴標準品和蠶豆花中萃取的左旋多巴進行分離檢測所得的HPLC-UV色譜圖，圖I所示色譜圖，該流動相可將左旋多巴完全基線分離，其峰值4.465的峰面積與質(zhì)量間呈良好的線性相關(guān)性，但基線漂移比較明顯。圖2所示色譜圖，該流動相可將左旋多巴完全基線分離和ー些未知物完全基線分離，其峰值4. 490的峰面積與質(zhì)量間呈良好的線性相關(guān)性，但基線漂移比較明顯。實施例3，如圖5或6所示，采用流動相組成成分體積百分比為0. 1%甲酸97%，乙腈2%，O. I mol/L醋酸1%，分別對左旋多巴標準品和蠶豆花中萃取的左旋多巴進行分離檢測所得的HPLC-UV色譜圖，該流動相對左旋多巴標準品和蠶豆花樣品左旋多巴分離較好，保留時間達到6分鐘多，但兩者基線漂移明顯。實施例4，如圖7或8所示，采用流動相組成成分體積百分比為0. 1%甲酸90%，乙腈4%，O. I mol/L醋酸6%，分別對左旋多巴標準品和蠶豆花中萃取的左旋多巴進行分離檢測所得的HPLC-UV色譜圖，該流動相對標準品和蠶豆花樣品左旋多巴分離良好，基線較穩(wěn)定。
實施例5，如圖9或10所示，采用流動相組成成分體積百分比為0. 1%甲酸69%，こ腈30%，O. I mol/L醋酸1%，分別對左旋多巴標準品和蠶豆花中萃取的左旋多巴進行分離檢測所得的HPLC-UV色譜圖，該流動相對標準品和蠶豆花樣品的左旋多巴分離較好，但兩者基線漂移較大。實施例6，如圖11或12所示，采用流動相組成成分體積百分比為0. 1%甲酸70%，こ腈20%，O. I mol/L醋酸10%，分別對左旋多巴標準品和蠶豆花中萃取的左旋多巴進行分離檢測所得的HPLC-UV色譜圖，該流動相對標準品和蠶豆花樣品的左旋多巴均可以較好的分離，但蠶豆花樣品的左旋多巴基線明顯漂移。綜上所述，采用本發(fā)明以上流動相分別對左旋多巴標準品和蠶豆花中萃取的左旋多巴進行分離，可將左旋多巴完全基線分離，易于定量分析。
權(quán)利要求
1.高效液相色譜法中分離蠶豆中左旋多巴的流動相，其特征在于其組成成分體積百分比為0. 1% 甲酸 69%-97%，こ腈 2%-30%, O. I mol/L 醋酸 1%_10%。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的高效液相色譜法中分離蠶豆中左旋多巴的流動相，其特征在于所述的流動相組成成分體積百分比為0. 1%甲酸90%-97%，こ腈2%-9%，0. I mol/L醋酸.1%-6%。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的高效液相色譜法中分離蠶豆中左旋多巴的流動相，其特征在于所述的流動相優(yōu)選組成成分體積百分比為0. 1%甲酸95%，こ腈5%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高效液相色譜法中分離蠶豆中左旋多巴的流動相，其組成成分體積百分比為0.1%甲酸69%-97%，乙腈2%-30%，0.1mol/L醋酸1%-10%。利用醋酸替換磷酸鹽緩沖液，可以避免沉淀的產(chǎn)生，減少對泵系統(tǒng)造成損害。上述的流動相經(jīng)長期使用，對高效液相色譜儀的泵系統(tǒng)未有任何損害。所述的甲酸在任意比例的乙腈-甲酸-水中能以任意比例完全互溶，不產(chǎn)生任何沉淀，不會對泵系統(tǒng)造成損害，常年使用情況良好，用于等度洗脫時，操作簡單、省時、重現(xiàn)性好、容易重復。
文檔編號G01N30/26GK102680616SQ20121017140
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月29日
發(fā)明者廖素鳳, 曹奕鴦, 李愛萍, 鄭開斌, 鄭金貴 申請人:福建省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所