高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測dna氧化與dna甲基化的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測DNA氧化與DNA甲基化的方法，包括以下步驟：水解DNA，將DNA水解產(chǎn)物用HPLC-ESI-MS/MS測定5-甲基胞嘧啶和8-羥基脫氧鳥苷的含量；高效液相色譜：流動相A：體積比0.01～0.3%的甲酸/甲醇；流動相B：體積比0.01～0.3%的甲酸水溶液；在流速為0.2～0.4ml/min、柱溫15～40℃條件下經(jīng)液相色譜柱分離；電噴霧質(zhì)譜：以電噴霧離子源離子化，在正極模式下通過多反應監(jiān)測系統(tǒng)進行質(zhì)譜分析。本發(fā)明的高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測DNA氧化與DNA甲基化的方法可以同時檢測DNA樣品中的8-OHdG和5-mdC含量。
【專利說明】高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測DNA氧化與DNA甲基化的方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及分析化學領域，更具體的說，涉及一種高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測DNA 氧化與DNA甲基化的方法。

【背景技術】
[0002] 在需氧生物體正常的生理過程，代謝過程和其他的生物化學反應過程中會形成一 系列的活性氧自由基，如超氧陰離子自由基（〇 2〇,單線態(tài)氧（1O2),過氧化氫（H2O2),羥基自 由基（-0H)等。然而這些內(nèi)生的活性氧自由基可能會導致DNA大分子被氧化損傷，并形成多 種DNA損傷分子。其中8-羥基脫氧鳥苷（8-0HdG)是一種普遍存在的被氧化的DNA核苷， 被用來作為DNA氧化損傷的生物標志物。人群調(diào)查結(jié)果與細胞實驗均表明8-0HdG可以通 過遺傳變異和非遺傳變異兩種機制誘導癌癥的發(fā)生。其中遺傳變異機制主要涉及到在DNA 復制時8-0HdG會發(fā)生堿基錯配，導致G :T轉(zhuǎn)化的點突變。非遺傳變異機制是指在DNA大分 子內(nèi)的8-0HdG可以降低DNA與DNA甲基化酶之間的親和力，使DNA甲基化模式發(fā)生變化。
[0003] 從低等的細菌到哺乳動物體內(nèi)，DNA甲基化是一種主要的表觀遺傳修飾。這種化 學修飾是指在一族甲基轉(zhuǎn)移酶DNMTs催化下將甲基基團從S-腺苷甲硫氨酸(縮寫為SAM) 轉(zhuǎn)移到胞嘧啶的C-5位置并形成5-甲基胞嘧啶（5-mdC)。在真核生物體中DNMTs主要包 括DNMT1，DNMT3a，DNMT3b等，其中DNMTl對半甲基化狀態(tài)的雙鏈DNA有很高的甲基轉(zhuǎn)移活 性。它為新合成的子鏈DNA提供了甲基化模式。另一方面，DNMT3a、MMT3b等DNA甲基轉(zhuǎn) 移酶則會轉(zhuǎn)移一個甲基基團到未甲基化的CpG堿基對上，形成新的甲基化單鏈和甲基化雙 鏈。5-mdC主要位于CpG二聚體中，在哺乳動物全基因組中5-mdC約占總脫氧胞苷的3-6%。 DNA甲基化在生物體正常發(fā)育和功能分化中具有十分重要的生物學意義，如轉(zhuǎn)錄調(diào)控，X染 色體失活和基因印跡等。DNA甲基化被認為與衰老和多種重大疾病的發(fā)生有關。全基因組 低甲基化可以啟動原癌基因的表達，染色體不穩(wěn)定和基因印跡丟失?；騿幼訁^(qū)域過度 甲基化可以干擾轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合和/或使DNA聚集轉(zhuǎn)錄抑制復合物從而導致抑癌基 因表達沉默。
[0004] 越來越多的研究證明氧化性DNA損傷和DNA甲基化異常與多種疾病的發(fā)生機制 緊密相關，特別是衰老和癌癥的發(fā)生。與此同時很多的證據(jù)表明一些環(huán)境因子可以誘發(fā) DNA氧化損傷并改變DNA甲基化模式，如輻射、吸煙煙氣、重金屬和大氣污染等。因而，氧化 性DNA損傷和DNA甲基化常常被作為重要的生物標志物，不僅用于疾病的早期診斷也可用 于高風險人體的檢測和風險評估。此外，最近的報告指出在DNMT識別域內(nèi)或附近存在的 8-0HdG可以顯著地降低DNMTs和甲基化-CpG-結(jié)合蛋白與雙鏈DNA的結(jié)合力并抑制DNA 甲基化過程。相反，研究也表明DNA過度甲基化可以使一些抗氧化基因表達沉默，如谷胱甘 肽-S-轉(zhuǎn)移酶Pl和錳超氧化物歧化酶基因等。因此，建立一個簡單有效的同時檢測DNA樣 品中5-甲基-脫氧胞苷和8-羥基-脫氧鳥苷的方法對于評價環(huán)境因子對生物體遺傳損傷 和表觀遺傳變異效應，進一步搞清楚8-0HdG和5-mdC在癌癥和腫瘤發(fā)生中的角色以及相互 作用是十分有益的。
[0005] 到目前為止，已經(jīng)建立了多種基于色譜方法的檢測8-OHdG或5-mdC的方法，如薄 層色譜，高效毛細管電泳HPCE，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用GC-MS，高效液相的紫外檢測HPLC-UV， 高效液相色譜電化學法HPLC-ECD，液相色譜-質(zhì)譜LC-MS和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用 LC-MS/MS等。在這些方法中，薄層色譜需要的儀器設備簡單但是結(jié)果的準確性較低；HPCE、 HPLC-UV和HPLC-E⑶方法能夠提供高的重復性和靈敏度，但是由于這類方法的檢測器對化 合物(核苷和脫氧核苷）不具備特異性，結(jié)果的準確性取決于色譜對核苷和脫氧核苷分離效 果。GC-MS方法雖然可以提供高的靈敏度，但是樣品的準備需要衍生化步驟，而衍生化又可 以會使一些脫氧核苷和核苷被人工氧化。然而，目前這些方法只是針對8-0HdG或5-mdC的 單一化合物，卻還沒有同時檢測DNA樣品中5-mdC和8-0HdG水平的報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術問題在于，針對現(xiàn)有技術中的缺陷，提供一種同時檢測DNA 樣品中5-mdC和8-0HdG的高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測DNA氧化與DNA甲基化的方法。
[0007] 本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是：提供一種高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢 測DNA氧化與DNA甲基化的方法，包括以下步驟：
[0008] 水解DNA，將DNA水解產(chǎn)物用HPLC-ESI-MS/MS測定5-甲基胞嘧啶和8-羥基脫氧 鳥苷的含量；
[0009] 高效液相色譜：流動相A :體積比0. 01?0. 3%的甲酸/甲醇；流動相B :體積比 0. 01?0. 3%的甲酸水溶液；在流速為0. 2?0. 4ml/min、柱溫15?40°C條件下經(jīng)液相色 譜柱分離；
[0010] 電噴霧質(zhì)譜：以電噴霧離子源離子化，在正極模式下通過多反應監(jiān)測系統(tǒng)進行質(zhì) 譜分析。
[0011] 在本發(fā)明所述的高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測DNA氧化與DNA甲基化的方法中，所 述水解DNA包括以下步驟：
[0012] 取一定量的DNA溶于去離子水中，同時向所述去離子水中加入30毫摩爾每升、pH 為6. 8的乙酸鈉，10毫摩爾每升氯化鋅，50毫摩爾每升的去鐵敏和8U核酸酶P1，將上述混 合物輕微震蕩并在37°C下水浴至預設時間，向混合物中加入30毫摩爾每升、pH為7. 8的乙 酸鈉，0. 4U蛇毒磷酸二酯酶和36U小牛內(nèi)腸堿性磷酸酶，輕微震蕩后在37°C下繼續(xù)水浴，得 到所述DNA水解產(chǎn)物。
[0013] 在本發(fā)明所述的高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測DNA氧化與DNA甲基化的方法中， 30毫摩爾每升的所述乙酸鈉、所述氯化鋅、所述去鐵敏與去離子水的體積比分別為3/10、 1/10,3/100 ；
[0014] 40毫摩爾每升的所述乙酸鈉與所述混合物的體積比為4/10。
[0015] 在本發(fā)明所述的高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測DNA氧化與DNA甲基化的方法中，所 述水解DNA還包括以下步驟：
[0016] 將旋轉(zhuǎn)超濾膜用去離子水沖洗以去除吸附在膜上的甘油，將一定量的所述DNA水 解產(chǎn)物加入到所述旋轉(zhuǎn)超濾膜上，通過超濾裝置在4°C下12000g離心30min，以去除所述 DNA水解產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)。
[0017] 在本發(fā)明所述的高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測DNA氧化與DNA甲基化的方法中，所 述高效液相色譜的分離采用規(guī)格為2. 1_X 150mm，5 Ii m的Waters Atlantis dC18色譜柱， 規(guī)格為 2. 1_X 20mm，5 u m 的 Phenomenex dC18 保護柱。
[0018] 在本發(fā)明所述的高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測DNA氧化與DNA甲基化的方法中，所 述高效液相色譜的梯度洗脫程序為：起始洗脫液中流動相A的體積百分比為100%，流動相B 的體積百分比為〇%，在24min內(nèi)，流動相A由100%下降至82%，流動相B由0%上升至18%。 [0019] 在本發(fā)明所述的高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測DNA氧化與DNA甲基化的方法中，所 述質(zhì)譜儀為三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀。
[0020] 本發(fā)明的高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測DNA氧化與DNA甲基化的方法具有以下有益 效果：本發(fā)明的方法可以同時檢測DNA樣品中的8-0HdG和5-mdC含量，對于探討二者在衰 老和癌癥發(fā)生中的角色以及二者的相互關系有積極作用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 下面將結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步說明，附圖中：
[0022] 圖 la、圖 Ib 分別是 8-0HdG ([M+H]+，m/z284. 2)和 5-mdC ([M+H]+，m/z242. 2)在 ESI+模式下的子離子圖；
[0023] 圖2是在284nm波長下正常和修飾核苷的液相色譜圖；
[0024] 圖3a、圖3b分別是小牛胸腺DNA水解產(chǎn)物中8-0HdG和5-mdC的MRM離子圖；
[0025] 圖4a、圖4b分別是8-0HdG和5-mdC在HPLC-ESI-MS/MS條件下的工作曲線。

【具體實施方式】
[0026] 為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對 本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并 不用于限定本發(fā)明。
[0027] 本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例公開了一種高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測DNA氧化與DNA 甲基化的方法，包括以下步驟：
[0028] 1、水解DNA，即在核酸酶P1，磷酸二酯酶和小牛內(nèi)腸堿性磷酸酶三種主要酶的催 化作用下水解，然后將DNA水解產(chǎn)物用高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜HPLC-ESI-MS/MS測定 5_甲基胞嘧啶和8-羥基脫氧鳥苷的含量。
[0029] 優(yōu)選地，水解DNA包括以下步驟：
[0030] 取一定量的DNA溶于去離子水中，同時向去離子水中加入30毫摩爾每升、pH為 6. 8的乙酸鈉溶液，10毫摩爾每升氯化鋅溶液，50毫摩爾每升的去鐵敏和8U核酸酶PMf 上述混合物輕微震蕩并在37°C下水浴至預設時間，優(yōu)選為3小時，水浴后向上述混合物中 加入30毫摩爾每升、pH為7. 8的乙酸鈉，0. 4U蛇毒磷酸二酯酶和36U小牛內(nèi)腸堿性磷酸酶， 輕微震蕩后在37°C下繼續(xù)水浴，得到DNA水解產(chǎn)物，第二次水浴以12小時為宜。其中去鐵 敏是一種抗氧化劑，防止在水解過程中處于高氧化/還原電位的dG轉(zhuǎn)化為8-0HdG。
[0031] 此外，各成分的比例可以采用但不限于以下優(yōu)選方案：30毫摩爾每升的乙酸鈉、 氯化鋅、去鐵敏與去離子水的體積比分別為3/10、1/10、3/100 ;40毫摩爾每升的乙酸鈉與 所述混合物的體積比為4/10。
[0032] 進一步的，水解產(chǎn)物中如果混有蛋白質(zhì)可能會影響后續(xù)的檢測，本實施例中采用 Microcon超濾裝置(型號YM-10,截阻分子量10000)進行過濾以去除蛋白質(zhì)。具體的，將旋 轉(zhuǎn)超濾膜用去離子水沖洗以去除吸附在膜上的甘油，將一定量的DNA水解產(chǎn)物加入到旋轉(zhuǎn) 超濾膜上，通過超濾裝置在4°C下12000g離心30min，以去除DNA水解產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)。其 中，每一次加入超濾膜上的DNA水解產(chǎn)物的量為100 ill。
[0033] 2、高效液相色譜：流動相A :體積比0. 01?0. 3%的甲酸/甲醇；流動相B :體積比 0. 01?0. 3%的甲酸水溶液；在流速為0. 2?0. 4ml/min、柱溫15?40°C條件下經(jīng)液相色 譜柱分離。
[0034] 本實施例的液相分離即LC分離是在AgilentllOO型高效液相色譜進行的，該型液 相色譜配置了真空脫氣機，自動進樣器，快速分離二元泵，二極陣列檢測器和柱溫箱，此處 不作--詳述。
[0035] 反向液相色譜分離米用 Waters Atlantis dC182. 1mmX 1 50mm (5 U m 顆粒 直徑）色譜柱(其中2. Imm為內(nèi)徑長度、150mm為柱長，下同），保護柱為Phenomenex dC182. lmmX20mm (5iim顆粒直徑)，dC18即反向碳十八柱。其中，流動相A優(yōu)選為0. 1%甲 酸/甲醇，流動相B優(yōu)選為0. 1%甲酸水溶液，流速優(yōu)選為0. 22ml/min，色譜柱溫度優(yōu)選為 25°C，進樣量優(yōu)選為10 yl。dC和dG的紫外檢測波長設定為284nm。
[0036] 高效液相色譜的梯度洗脫程序為：起始洗脫液中流動相A的體積百分比為100%， 流動相B的體積百分比為0%，在24min內(nèi)，流動相A由100%下降至82%，流動相B由0%上 升至18%。
[0037] 3、電噴霧質(zhì)譜：以電噴霧離子源離子化，在正極模式下通過多反應監(jiān)測系統(tǒng)進行 質(zhì)譜分析。本實施例中選用三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀用于化合物的鑒定與定量。優(yōu)化的ESI 離子源參數(shù)見表1。5-mdC和8-0HdG的定量檢測是在多反應檢測（MRM)模式下進行的，質(zhì)譜 檢測采集兩個質(zhì)譜段的信號，其中7-12min和18-24min時間段分別對應于5-mdC和8-0HdG 的檢測，5-mdC和8-0HdG檢測的過渡離子對分別為m/z242. 2/126. 1和m/z284. 2. /168. 0。 Agilent Mass Hunter工作站（version B. OL 03)用于數(shù)據(jù)的采集和分析。
[0038] 表1優(yōu)化后的質(zhì)譜工作參數(shù)
[0039]

【權利要求】
1. 一種高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測DNA氧化與DNA甲基化的方法，其特征在于，包括以 下步驟： 水解DNA，將DNA水解產(chǎn)物用HPLC-ESI-MS/MS測定5-甲基胞嘧啶和8-羥基脫氧鳥苷 的含量； 高效液相色譜：流動相A :體積比0. 01?0. 3%的甲酸/甲醇；流動相B :體積比0. 01? 0. 3%的甲酸水溶液；在流速為0. 2?0. 4ml/min、柱溫15?40°C條件下經(jīng)液相色譜柱分 離； 電噴霧質(zhì)譜：以電噴霧離子源離子化，在正極模式下通過多反應監(jiān)測系統(tǒng)進行質(zhì)譜分 析。
2. 根據(jù)權利要求1所述的高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測DNA氧化與DNA甲基化的方法， 其特征在于，所述水解DNA包括以下步驟： 取一定量的DNA溶于去離子水中，同時向所述去離子水中加入30毫摩爾每升、pH為 6. 8的乙酸鈉，10毫摩爾每升氯化鋅，50毫摩爾每升的去鐵敏和8U核酸酶P1，將上述混合 物輕微震蕩并在37°C下水浴至預設時間，向混合物中加入30毫摩爾每升、pH為7. 8的乙酸 鈉，0. 4U蛇毒磷酸二酯酶和36U小牛內(nèi)腸堿性磷酸酶，輕微震蕩后在37°C下繼續(xù)水浴，得到 所述DNA水解產(chǎn)物。
3. 根據(jù)權利要求1所述的高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測DNA氧化與DNA甲基化的方法， 其特征在于，30毫摩爾每升的所述乙酸鈉、所述氯化鋅、所述去鐵敏與去離子水的體積比分 別為 3/10、1/10、3/100 ; 40毫摩爾每升的所述乙酸鈉與所述混合物的體積比為4/10。
4. 根據(jù)權利要求1所述的高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測DNA氧化與DNA甲基化的方法， 其特征在于，所述水解DNA還包括以下步驟： 將旋轉(zhuǎn)超濾膜用去離子水沖洗以去除吸附在膜上的甘油，將一定量的所述DNA水解產(chǎn) 物加入到所述旋轉(zhuǎn)超濾膜上，通過超濾裝置在4°C下12000g離心30min，以去除所述DNA水 解產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)。
5. 根據(jù)權利要求1所述的高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測DNA氧化與DNA甲基化的方法， 其特征在于，所述高效液相色譜的分離采用規(guī)格為2. lmmX150mm，5ii m的Waters Atlantis dC18 色譜柱，規(guī)格為 2. 1_X 20mm，5 u m 的 Phenomenex dC18 保護柱。
6. 根據(jù)權利要求1所述的高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測DNA氧化與DNA甲基化的方法， 其特征在于，所述高效液相色譜的梯度洗脫程序為：起始洗脫液中流動相A的體積百分比 為100%，流動相B的體積百分比為0%，在24min內(nèi)，流動相A由100%下降至82%，流動相B 由0%上升至18%。
7. 根據(jù)權利要求1所述的高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測DNA氧化與DNA甲基化的方法， 其特征在于，所述質(zhì)譜儀為三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀。
【文檔編號】G01N30/88GK104374853SQ201310353874
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2013年8月14日 優(yōu)先權日:2013年8月14日
【發(fā)明者】柯躍斌, 吳雙, 朱舟, 耿藝介, 程錦泉 申請人:柯躍斌