專利名稱：加工食品中的豬肉的檢測法及其檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及針對加工食品、特別是加熱處理的加工食品中的豬肉的檢測方法及其檢測試劑盒。更具體地說，本發(fā)明涉及加工食品、特別是加熱處理的加工食品中的來自動(dòng)物種類的檢測用抗原的制備方法，以及用該檢測用抗原得到的抗體。
背景技術(shù)：
歐盟科學(xué)運(yùn)營委員會(huì)在其意見中報(bào)告了牛腦海綿狀病(BSE)等牛傳染病對人傳染的危險(xiǎn)性，自此，BSE感染牛的肉骨粉在家畜飼料中使用的問題受到重視。另外，假冒品牌肉或偽裝成品牌牛肉的問題以及用其它肉類偽裝成牛肉的問題也是一般消費(fèi)者所關(guān)心的問題。另一方面，食物變態(tài)反應(yīng)患者會(huì)因食品中所含的食物變態(tài)反應(yīng)原而引發(fā)哮喘、 皮炎、胃腸功能障礙、過敏性休克等各種變態(tài)反應(yīng)癥狀，有時(shí)還有造成了非常嚴(yán)重的后果的病例。食物變態(tài)反應(yīng)患者還有增加的傾向，消費(fèi)者對于食品的安全性的關(guān)注也非常高。通常已知的含有食物變態(tài)反應(yīng)原的代表性食品有谷類(蕎麥、小麥等)、蛋類、肉類(牛、豬、雞等)、魚類(鯖魚、沙丁魚等)、牛乳類、甲殼類(蟹等)、軟體動(dòng)物類、豆類(花生、大豆等)、果實(shí)類(芒果等)、蔬菜類(蒜等)等，這些食物變態(tài)反應(yīng)誘發(fā)食品中含有谷蛋白、明膠、酪蛋白、卵清蛋白、卵類粘蛋白、溶菌酶、α-乳清蛋白、β_乳球蛋白等食物變態(tài)反應(yīng)誘發(fā)成分。加工食品中的很多食品或食物也含有變態(tài)反應(yīng)原，目前的現(xiàn)狀是無法簡便地檢測出它們。另外，對于進(jìn)行了加工處理(加熱、加壓、酶解處理、冷凍、干燥、鹽藏等)的食品，由于處理而使食品中的蛋白質(zhì)成分發(fā)生分子結(jié)構(gòu)性的改性或分子修飾。因此，為了簡便地檢測出加工食品中的這些成分，針對加工處理過的成分和未經(jīng)加工處理的生鮮成分分別使用與其對應(yīng)的適當(dāng)?shù)目乖虮砦皇欠浅Ｖ匾?，這方面的探索和研究也得到了進(jìn)展。例如，人們發(fā)現(xiàn)作為用于檢測在高溫、例如超過100°C的溫度條件下加熱處理過的存在于罐裝食品或家畜用飼料等試樣中的來自以牛、豬、雞為代表的動(dòng)物性組織的原料的檢測試劑，人們已開發(fā)了一種具有標(biāo)記抗體和載體的檢測試劑，所述標(biāo)記抗體是在120°C以上的溫度下加熱處理的上述來自動(dòng)物性組織的原料中的血清白蛋白的抗體或其抗原結(jié)合性片段，并用標(biāo)記物標(biāo)記得到；所述載體具備固定有上述來自動(dòng)物性組織的原料中的血清白蛋白的抗體或其抗原結(jié)合性片段的檢測區(qū)域。也就是說，人們發(fā)現(xiàn)用加熱改性的血清白蛋白作為免疫原對動(dòng)物進(jìn)行免疫所生產(chǎn)的抗體可特異性地識(shí)別該加熱改性的血清白蛋白，而對非加熱的血清白蛋白不顯示交叉反應(yīng)性，從而提供了一種用于檢測試樣中是否存在加熱處理過的來自動(dòng)物性組織的原料的方法(包含免疫層析法)。(參照專利文獻(xiàn)I、專利文獻(xiàn)2)將含有未改性和/或改性物質(zhì)的食物變態(tài)反應(yīng)原的混合物(蛋白質(zhì))對動(dòng)物免疫所得到的IgE (免疫球蛋白E)抗體，以及使用該抗體檢測食物變態(tài)反應(yīng)原和食物變態(tài)反應(yīng)誘發(fā)性食品的方法(包含免疫層析法)是公知的。(參照專利文獻(xiàn)3)
不僅如此，將已經(jīng)保藏的特定細(xì)胞(加熱的豬肉中的特定蛋白質(zhì)對動(dòng)物免疫所得的細(xì)胞)生產(chǎn)的單克隆抗體用于ELISA (免疫學(xué)測定的一種)方法中以檢測加熱處理的食品中的豬肉也是公知的。(參照專利文獻(xiàn)4)由于該檢測方法使用了由特定細(xì)胞(加熱過的豬肉中的特定蛋白質(zhì)對動(dòng)物免疫所得的細(xì)胞)生產(chǎn)的單克隆抗體，因此可以準(zhǔn)確地進(jìn)行檢測。然而，單克隆抗體的制備需要高額費(fèi)用，因此該方法不適合在醫(yī)療領(lǐng)域中針對多數(shù)患者的普及。本發(fā)明人使用多克隆抗體代替上述單克隆抗體，利用免疫層析法進(jìn)行了同樣的試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其與加熱食品中的豬肉以外的原料、如牛肉等有交叉反應(yīng)性，在精度方面未能得到令人滿意的結(jié)果。如上所述，在使用多克隆抗體通過免疫層析法檢測試樣中的檢測對象物一加熱食品中的豬肉時(shí)，可觀察到會(huì)發(fā)生非特異性反應(yīng)、無法充分抑制非特異性反應(yīng)的問題依然存
在。 另外，在通過免疫學(xué)測定法來檢測食品中的變態(tài)反應(yīng)原物質(zhì)(蛋白質(zhì))時(shí)，所使用的檢體稀釋液含有TWeen20等表面活性劑或氯化鈉等無機(jī)鹽也是公知的(參照專利文獻(xiàn)5)。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)I :日本特開2006-317226專利文獻(xiàn)2 :日本特開2005-164583專利文獻(xiàn)3 日本特開2003-155297專利文獻(xiàn)4 :美國專利6288215專利文獻(xiàn)5 :日本特開2009-08591
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的問題本發(fā)明的目的在于提供一種來自檢體的成分的制備方法，該成分可通過免疫測定法高性能且高靈敏度地檢測加熱加工食品中的豬肉，不會(huì)引發(fā)非特異性反應(yīng)；還提供一種使用由該成分得到的多克隆抗體來進(jìn)行的簡便且高精度的檢測方法，以及該檢測方法使用的檢查試劑盒。解決該問題的手段本發(fā)明涉及對加熱加工食品中的來自豬肉的蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫層析檢測。本發(fā)明使用的展開液組成和試驗(yàn)試劑盒中使用的化學(xué)物質(zhì)(生物物質(zhì)以外)的組成是以往在免疫層析法中常用的試劑。例如，展開液是在純凈水或緩沖液中加入非離子性表面活性劑(例如Tween20> Triton-100等)和氯化鈉,根據(jù)情況還加入酪蛋白(脫脂粉乳)等。本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)由生豬肉中提出的提取物、即生豬肉中所含的約50kD (分子量50，000)的蛋白質(zhì)最為適合作為免疫用抗原用于制備在加熱食品檢測系統(tǒng)中使用的抗體。因此，本發(fā)明的用于檢測來自加熱加工食品中來自豬肉的蛋白質(zhì)的免疫層析檢測所使用的檢測抗體(生物物質(zhì))特別適合于加熱食品的檢測系統(tǒng)。該檢測抗體不僅與針對非加熱食品中的來自豬肉的蛋白質(zhì)的免疫層析檢測系統(tǒng)中所用的檢測抗體不同，也與以往公知的針對加熱加工食品中的來自豬肉的蛋白質(zhì)的免疫層析檢測中所用的檢測抗體(生物物質(zhì))不同。在確定了該檢測抗體的基礎(chǔ)上，本發(fā)明人首次完成了通過免疫層析法檢查(探測)加熱加工食品中有無豬肉的方法及其檢查(檢測)試劑盒。在本發(fā)明的加熱食品的檢測系統(tǒng)中，優(yōu)選使用可特異性識(shí)別經(jīng)過加熱處理、例如在100°c以上的溫度下加熱處理的豬肉中所含的約23kD (分子量23，000)的蛋白質(zhì)的多克隆抗體作為檢測抗體。本發(fā)明提供下述(a)-(e)的免疫層析檢測法、該方法中使用的抗體、檢測裝置，以及檢測試劑盒。(a)本發(fā)明的第一方面涉及一種利用多克隆抗體作為檢測抗體對來自加熱加工食品中的豬肉的蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫層析檢測的方法，其中所述多克隆抗體可特異性識(shí)別經(jīng)加熱處理的豬肉中所含的分子量處于20kD (分子量20，000)到261^ (分子量26，000)范圍內(nèi)的 23kD (分子量23，000)附近的蛋白質(zhì)，所述多克隆抗體是利用免疫用抗原對動(dòng)物進(jìn)行免疫得到的，所述免疫用抗原是由從生豬肉中提取的提取物的離子交換純化組分中所含的處于40kD (分子量40，000)到601^ (分子量60，000)范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)，其具有在經(jīng)過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)的考馬斯染色分析時(shí)在50kD (分子量50，000)附近顯示出強(qiáng)顯色的分子量。(b)本發(fā)明的第二方面涉及一種多克隆抗體，該多克隆抗體可特異性識(shí)別經(jīng)加熱處理的豬肉中所含的分子量處于20kD (分子量20，000)到26kD (分子量26，000)范圍內(nèi)的23kD (分子量23，000)附近的蛋白質(zhì)，所述多克隆抗體是利用免疫用抗原對動(dòng)物進(jìn)行免疫得到的，所述免疫用抗原是由從生豬肉中提取的提取物的離子交換純化組分中所含的處于40kD (分子量40，000)到601^ (分子量60，000)范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)，其具有在經(jīng)過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)的考馬斯染色分析時(shí)在50kD (分子量50，000)附近顯示出強(qiáng)顯色的分子量。(c)本發(fā)明的第三方面涉及一種針對加熱加工食品中的來自豬肉的蛋白質(zhì)的免疫層析檢測用裝置，該裝置具備標(biāo)記物保持部和檢測部，所述標(biāo)記物保持部保持有作為用標(biāo)記物標(biāo)記根據(jù)(b)的多克隆抗體所得的標(biāo)記抗體，所述檢測部固定有根據(jù)(b)的多克隆抗體。(d)本發(fā)明的第四方面涉及根據(jù)(C)的免疫層析檢測用裝置，該裝置基本上由試樣添加部、標(biāo)記物保持部、層析介質(zhì)、檢測部和吸收部構(gòu)成。(e)本發(fā)明的第五方面涉及針對加熱加工食品中的來自豬肉的蛋白質(zhì)的免疫層析檢測用試劑盒，該檢測用試劑盒基本上由試樣添加部、標(biāo)記物保持部、層析介質(zhì)、檢測部和吸收部構(gòu)成，其中所述標(biāo)記物保持部保持有將根據(jù)(b)的多克隆抗體用標(biāo)記物標(biāo)記所得的標(biāo)記抗體，所述檢測部固定有根據(jù)(b)的多克隆抗體。發(fā)明效果在本發(fā)明的加熱加工食品中來自豬肉的蛋白質(zhì)的免疫層析檢測方法中，將由生豬肉提取的提取物、即生豬肉中所含的50kD (分子量50，000)附近的蛋白質(zhì)對兔或山羊(并不限于此，也可以是除此以外的其它動(dòng)物，例如馬、綿羊、豬、雞、小鼠、大鼠或豚鼠等)免疫得到的多克隆抗體作為檢測抗體(生物物質(zhì))使用，與使用單克隆抗體相比，其價(jià)格便宜，可以對眾多需求者、例如醫(yī)療領(lǐng)域中的很多患者進(jìn)行有效的普及。在本發(fā)明中，將由生豬肉提取的提取物、即生豬肉中所含的50kD (分子量50，000)附近的蛋白質(zhì)作為免疫抗原對動(dòng)物免疫，所得的多克隆抗體作為檢測抗體(生物物質(zhì))使用。因此，不僅對大豆等來自植物的蛋白質(zhì)沒有交叉反應(yīng)，對來自牛、雞、羊等的豬以外動(dòng)物的蛋白質(zhì)也沒有交叉反應(yīng)，可正確且容易地對加熱加工食品中來自豬肉的蛋白質(zhì)的免疫層析法的檢測結(jié)果進(jìn)行判定，且靈敏度不會(huì)降低。根據(jù)本發(fā)明的針對來自加熱處理豬肉的蛋白質(zhì)的免疫層析檢測法不僅能簡便且低成本地應(yīng)用于檢測來自加熱加工食品中的豬肉的蛋白質(zhì)，而且能同樣地應(yīng)用于檢測在會(huì)弓丨起蛋白質(zhì)改性的溫度條件下實(shí)施了加工處理(加熱、加熱/加壓、干燥等)的健康食品、藥品、家畜飼料、寵物食品等中的來自豬肉的蛋白質(zhì)。因此，對于生豬肉可引發(fā)變態(tài)反應(yīng)的患者或者基于嗜好上或飲食文化上不食用豬肉的一般消費(fèi)者，本發(fā)明能夠?yàn)榻鉀Q這些問題作出貢獻(xiàn)。與PCR或ELISA法相比，本發(fā)明的免疫層析檢測法的裝置簡便，可以迅速且低成 本地檢測加熱加工食品中的來自豬肉的蛋白質(zhì)，因此具有能夠解決一般消費(fèi)者的需求的優(yōu)點(diǎn)。


圖I是本發(fā)明的免疫層析檢測用試劑盒的使用概略圖。
具體實(shí)施例方式以下詳細(xì)說明本發(fā)明。在本發(fā)明的加熱食品檢測系統(tǒng)中，優(yōu)選使用可特異性識(shí)別經(jīng)過加熱處理、例如經(jīng)過100°C以上溫度加熱處理的豬肉中所含的23kD (分子量23，000)附近的蛋白質(zhì)的多克隆抗體作為檢測抗體。 在本發(fā)明的加熱加工食品中來自豬肉的蛋白質(zhì)的免疫層析檢測法中，使用來自生豬肉的提取物、即生豬肉中所含的50kD (分子量50，000)附近的蛋白質(zhì)作為免疫用抗原，用其對動(dòng)物(如兔、山羊、馬、綿羊、豬肩、小鼠、大鼠、豚鼠等)進(jìn)行免疫，所得的多克隆抗體作為檢測抗體(生物物質(zhì))。用語“50kD (分子量50，000)附近”的含義對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說并不會(huì)帶來特別的技術(shù)性問題。特別在為了定量表示時(shí)，考慮到作為天然產(chǎn)物的蛋白質(zhì)的不規(guī)則情況，在對由生豬肉提取的蛋白質(zhì)的離子交換柱純化組分進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、然后通過考馬斯染色對蛋白質(zhì)進(jìn)行分析(SDS-PAGE分析)時(shí)，生豬肉中的主要的特征性蛋白質(zhì)具有主要為50kD的分子量(分子量50，000)，其在經(jīng)驗(yàn)上認(rèn)為是完全處于40kD(分子量40，000)到60kD (分子量60，000)左右的范圍內(nèi)，S卩，“50kD (分子量50，000)附近”的蛋白質(zhì)大部分集中在組分1-5的范圍內(nèi)?？梢酝贫ǎ摰鞍踪|(zhì)并不只是單體的形式，除此之外也可為多聚體的形式，例如二聚體、三聚體等，但無論如何，在該分子量的分析中，發(fā)現(xiàn)具有“50kD附近”的分子量的蛋白質(zhì)在豬肉中是特征性的、且適合作為免疫用抗原的主要蛋白質(zhì)。在本發(fā)明中，優(yōu)選生豬肉中所含的50kD (分子量50，000)附近的蛋白質(zhì)作為免疫用抗原使用。該免疫用抗原可以是指在聚丙烯酰胺凝膠電泳等分析方法中顯示為具有50kD附近的分子量的蛋白質(zhì)組分，也可以是主要含有顯示為具有50kD附近的分子量的蛋白質(zhì)組分的蛋白質(zhì)群。另外，在本發(fā)明中，使用將由生豬肉提取的提取物、即生豬肉中所含的50kD (分子量50，000)附近的蛋白質(zhì)用作免疫抗原對動(dòng)物進(jìn)行免疫得到的多克隆抗體作為檢測抗體(生物物質(zhì))。因此，不僅對來自大豆等植物的蛋白質(zhì)沒有交叉反應(yīng)，對于來自牛、雞、羊等豬以外的動(dòng)物的蛋白質(zhì)也完全沒有交叉反應(yīng)，可以正確且容易地針對加熱加工食品中來自豬肉的蛋白質(zhì)的免疫層析檢測的結(jié)果進(jìn)行判定，并且靈敏度不會(huì)降低，表現(xiàn)出優(yōu)異的性能。本發(fā)明進(jìn)一步對比較容易且可正確識(shí)別加工豬肉的方法進(jìn)行了研究。結(jié)果，通過加工豬肉中所含的蛋白質(zhì)而研究了該可識(shí)別的蛋白質(zhì)的特性與識(shí)別抗體之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在通過蛋白質(zhì)印跡分析(以下簡稱為“WB分析”)對加工豬肉中所含的蛋白質(zhì)進(jìn)行分子量確認(rèn)時(shí)，作為經(jīng)驗(yàn)上認(rèn)為可能的表示范圍，發(fā)現(xiàn)加工豬肉中所含的可特異性識(shí)別的蛋白質(zhì)是23kD (分子量23，000)附近的蛋白質(zhì)。

如果從全部肉類均為天然蛋白質(zhì)的特性考慮，容易預(yù)測到構(gòu)成加工肉類的蛋白質(zhì)的分子量是從低分子量至超高分子量。使用將生豬肉中所含的具有50kD (分子量50，000)附近的蛋白質(zhì)作為免疫抗原對動(dòng)物進(jìn)行免疫得到多克隆抗體，然后對來自各種加工肉類提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳，之后對具有處于OkD (分子量O)到250kD (分子量250，000)左右范圍內(nèi)的各種分子量的蛋白質(zhì)進(jìn)行WB分析。作為經(jīng)驗(yàn)上認(rèn)為可能的表示范圍，發(fā)現(xiàn)所述多克隆抗體對主要含有屬于20kD (分子量20，000)到26kD (分子量26000)左右范圍內(nèi)的以23kD(分子量23，000)的分子量為主的蛋白質(zhì)可強(qiáng)烈地識(shí)別，S卩，可以強(qiáng)烈地識(shí)別具有“23kD (分子量23，000)附近”的豬蛋白質(zhì)，而不識(shí)別豬蛋白質(zhì)以外的牛、羊、雞的蛋白質(zhì)。使用可識(shí)別豬肌鈣蛋白I的單克隆抗體，同樣地將由各種加工肉類中提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳，然后進(jìn)行WB分析，得到與本發(fā)明同樣的結(jié)果。在本發(fā)明中，當(dāng)涉及到對23kD附近的豬蛋白質(zhì)進(jìn)行識(shí)別時(shí)，該用語“23kD附近”是指作為以加工豬肉為檢測對象的蛋白質(zhì)分子量的按照常用測定方法來確定的蛋白質(zhì)的分子量。23kD這個(gè)特定值可發(fā)揮非常有效的功能，在作為檢測用蛋白質(zhì)的應(yīng)用上沒有任何特別的問題。它限定了 23kD附近的蛋白質(zhì)，是用加工豬肉檢測領(lǐng)域中的技術(shù)人員是能充分有效地測定且可識(shí)別的分子量來限定的表述。如果需要進(jìn)一步定量表示該“23kD附近”的含義，考慮到加工肉這一天然產(chǎn)物的分子量、結(jié)構(gòu)等的不規(guī)則的情況，作為數(shù)值上可能的表示范圍，如果表達(dá)為大部分蛋白質(zhì)的分子量集中在20kD-26kD左右的范圍，則為更明確的定量表示。總之，只要通過WB分析確定具有23kD附近分子量的蛋白質(zhì)，本發(fā)明的檢測方法就可以正確地實(shí)施。而且，根據(jù)本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人制作的多克隆抗體可特異性識(shí)別加工豬肉中的23kD附近的蛋白質(zhì)，根據(jù)其原理，可以容易、迅速且低成本地實(shí)現(xiàn)該檢測方法。本發(fā)明中使用的展開液組成或試驗(yàn)試劑盒中使用的化學(xué)物質(zhì)(非生物物質(zhì))的組成是以往的免疫層析法中常用的試劑。作為上述免疫層析用試劑，可以使用各種化學(xué)物質(zhì)，例如緩沖劑、非離子性表面活性劑、根據(jù)情況使用的螯合劑等，以實(shí)現(xiàn)其功能/作用。在本發(fā)明的免疫層析用試劑組合物如提取展開液中，緩沖劑沒有特別的限定，只要它能夠?qū)崿F(xiàn)其作用(緩沖作用)，不會(huì)因試樣的添加、或試樣的蒸發(fā)或稀釋所導(dǎo)致的濃度變化、也不會(huì)因?yàn)樽酝獠炕烊肷僭S雜質(zhì)而產(chǎn)生顯著的影響。
本發(fā)明的緩沖劑的例子有乙酸緩沖液(乙酸+乙酸鈉)、磷酸緩沖液(磷酸+磷酸鈉)、檸檬酸緩沖液(檸檬酸+檸檬酸鈉)、硼酸緩沖液、Tris鹽酸緩沖液(三(羥基甲基)氨基甲烷+鹽酸)、TE緩沖液(Tris+乙二胺四乙酸)、TAE緩沖液(Tris+乙酸+乙二胺四乙酸)、TBE緩沖液(Tris+硼酸+乙二胺四乙酸)、HEPES緩沖液(2- [4- (2-羥基乙基)_1_哌嗪基]乙磺酸)等。優(yōu)選乙酸緩沖液、磷酸緩沖液、Tris鹽酸緩沖液、HEPES緩沖液。本發(fā)明的免疫層析用試劑組合物中使用的緩沖劑的濃度為O. 01-250mM的范圍，優(yōu)選10-200mM的范圍，更優(yōu)選30-180mM的范圍。濃度低于O. OlmM，緩沖作用不充分。濃度為250mM以上，則濃度高于所需，不經(jīng)濟(jì)，浪費(fèi)?？稍诒景l(fā)明的免疫層析用試劑組合物中使用的非離子性表面活性劑的例子有聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯/聚氧丙烯烷基醚、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯(商品名“Tween”系列)、聚氧乙烯對叔辛基苯基醚(商品名“Triton”系列)、聚氧乙烯對叔壬基苯基醚(商品名“TritonN”系列)、烷基聚葡糖苷、脂肪酸二乙醇酰胺、烷基單甘油基醚等。非離子性表面活性劑可以單獨(dú)地使用，或?qū)煞N以上混合使用。

在本發(fā)明的免疫層析用試劑組合物中使用的非離子性表面活性劑的含量為相對于免疫層析用試劑組合物的O. 01-10%重量的范圍,優(yōu)選在O. 05-5%重量的范圍。含量低于O. 05%重量時(shí)，無法抑制非特異性反應(yīng)，導(dǎo)致不正確的判定。含量為10%重量以上，則高于所需的濃度，不僅不會(huì)對非特異性反應(yīng)的抑制帶來有利的影響，并且不經(jīng)濟(jì)，浪費(fèi)。非離子性表面活性劑還可以任選地配合其它非離子性表面活性劑、離子性表面活性劑等結(jié)合使用。在本發(fā)明的免疫層析用試劑組合物中，根據(jù)需要使用的螯合劑沒有特別的限定，只要它可用作具有多個(gè)配位基的配位體即可。在本發(fā)明中，螯合劑的例子有乙二胺、二吡啶、乙二胺四乙酸(以下稱為“EDTA”)、EDTA · 2Na、EDTA · 3Na、EDTA · 4Na、EDTA 衍生物(例如 EDTA · 2NH4、EDTA · 3K、EDTA ·特殊銨鹽等)、EDTA金屬鹽(例如EDTA .Ca *2Na等)、羥基乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)系、二羥基乙基乙二胺二乙酸(DHEDDA)系、1,3-丙烷二胺四乙酸(1，3-PDTA)系、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)系、三乙烯四胺六乙酸(TTHA)系、亞硝基三乙酸(NTA)系、葡糖酸系、羥乙基亞氨基二乙酸(HMDA)系、L-天冬氨酸-N，N-二乙酸(ASDA)系、氨基三亞甲基膦酸(NTMP)系、羥基乙烷膦酸(HEDP)系、3-羥基-2，2’-亞氨基二琥珀酸四鈉、菲咯啉、葉啉、冠醚等。在本發(fā)明的免疫層析用試劑組合物中，根據(jù)需要含有的螯合劑的濃度為O. Ol-IOmM的范圍，優(yōu)選O. l-5mM的范圍，更優(yōu)選O. 5_2mM的范圍。濃度低于O. OlmM，則無法抑制非特異性反應(yīng)，從而無法進(jìn)行正確的判定。濃度為IOmM以上，則高于所需濃度，不經(jīng)
濟(jì)，浪費(fèi)。在本發(fā)明的免疫層析用試劑組合物中，可以添加公知的能抑制基于生物學(xué)親和性的副反應(yīng)或抑制非特異性反應(yīng)的添加劑，例如用于促進(jìn)抗原抗體反應(yīng)或抑制非特異性反應(yīng)的蛋白質(zhì)(例如牛血清白蛋白、酪蛋白、明膠等)、高分子化合物(例如聚乙二醇、甲基纖維素、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯基醇、葡聚糖等)、離子性表面活性劑或聚陰離子(例如硫酸葡聚糖、肝素、聚苯乙烯磺酸、硫酸軟骨素等)，以及防腐劑或抗菌劑等。這些添加劑可以單獨(dú)地使用，或兩種以上相結(jié)合地使用，其使用有效，沒有任何限制。這些用于促進(jìn)抗原抗體反應(yīng)或抑制非特異性反應(yīng)的蛋白質(zhì)、高分子化合物、離子性表面活性劑或聚陰離子以及防腐劑或抗菌劑等中的一種或多種添加劑可以保持在構(gòu)成固定相的層析介質(zhì)上的流動(dòng)相的流路上，其使用有效，沒有任何限制。本發(fā)明的免疫層析用試劑組合物的使用方法可以是將組合物涂布在免疫層析裝置的樣品板(試樣添加部分)中，或?qū)悠钒褰⒃诮M合物中，然后進(jìn)行干燥，由此將組合物保持在樣品板上。將本發(fā)明的免疫層析用試劑組合物保持在免疫層析介質(zhì)上的其它方式可以是在試樣添加部位的端部和吸收部位之間的適當(dāng)位置處設(shè)置添加劑保持部，以這樣的方式將組合物保持在其中。例如，組合物的施加區(qū)域可以在試樣添加部分的附近、標(biāo)記物保持部位或其附近。其中，優(yōu)選將組合物只保持在試樣添加部分和/或標(biāo)記物保持部上。本發(fā)明的免疫層析用試劑組合物的使用方法并不限于上述使用方式，該組合物可以提取展開液的形式使用，也可以試樣的稀釋液的形式使用。例如，本發(fā)明的提取展開液是超純水或緩沖液，其中加入了非離子性表面活性劑(如Tween 20、Triton-100等)、氯化鈉， 以及根據(jù)情況加入的酪蛋白(脫脂粉乳)等。提取展開液通常是使用水作為溶劑，在其中加入緩沖液、非離子表面活性劑、蛋白質(zhì)和高分子化合物，還可以根據(jù)需要進(jìn)一步加入螯合劑等。加入的順序沒有特別限定，也可以同時(shí)加入。在該組合物作為提取展開液使用時(shí)，可以根據(jù)所要檢測的試樣的狀態(tài)、例如為固體狀還是糊劑狀來選擇合適提取展開液的使用方式?？梢詫⑺獧z測的試樣與展開液預(yù)先混合，將混合物供給/滴加到樣品板(試樣添加部)上以展開，也可以先將試樣供給/滴加到樣品板(試樣添加部)上，然后將展開液供給/滴加到樣品板(試樣添加部)上以展開。在該組合物作為試樣稀釋液使用時(shí)，將試樣稀釋為稀釋液，然后直接以展開液的形式供給、滴加到樣品板(試樣添加部)上。本發(fā)明的含有檢測對象物的試樣(檢體)的代表性例子有主要采用在可使蛋白質(zhì)變性的溫度下經(jīng)加熱加工或滅菌處理的食品、健康食品等，但并不限于此，家畜飼料或藥品等也可以作為試樣(檢體)使用。在本發(fā)明中，優(yōu)選生豬肉中所含的50kD (分子量50，000)附近的蛋白質(zhì)作為免疫用抗原。該免疫用抗原可以是在聚丙酰胺凝膠電泳等分析方法中顯示為分子量在50kD附近的蛋白質(zhì)組分，或者也可以是主要含有顯示為分子量在50kD附近的蛋白質(zhì)組分的蛋白質(zhì)群。本發(fā)明的免疫用抗原的制備方法如下所示。
權(quán)利要求
1.ー種利用多克隆抗體作為檢測抗體對來自加熱加工食品中的豬肉的蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫層析檢測的方法，其中所述多克隆抗體能特異性識(shí)別經(jīng)加熱處理的豬肉中所含的分子量處于20kD (分子量20，000)到26kD (分子量26，000)范圍內(nèi)的23kD (分子量23，000)附近的蛋白質(zhì)，所述多克隆抗體是利用免疫用抗原對動(dòng)物進(jìn)行免疫得到的，所述免疫用抗原是由從生豬肉中提取的提取物的離子交換純化組分中所含的處于40kD (分子量40，000)到.60kD (分子量60，000)范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)具有在經(jīng)過十_■燒基硫酸納_聚丙稀酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)的考馬斯染色分析時(shí)在50kD (分子量50，000)附近顯示出強(qiáng)顯色的分子量。
2.ー種多克隆抗體，利用免疫用抗原對動(dòng)物進(jìn)行免疫得到，所述免疫用抗原是由從生豬肉中提取的提取物的離子交換純化組分中所含的處于40kD (分子量40，000)到60kD (分子量60，000)范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)具有在經(jīng)過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)的考馬斯染色分析時(shí)在50kD (分子量50，000)附近顯示出強(qiáng)顯色的分子量，所述多克隆抗體能特異性識(shí)別經(jīng)加熱處理的豬肉中所含的分子量處于20kD (分子量.20，000)到26kD (分子量26，000)范圍內(nèi)的23kD (分子量23，000)附近的蛋白質(zhì)。
3.ー種針對加熱加工食品中的來自豬肉的蛋白質(zhì)的免疫層析檢測用裝置，所述裝置包括標(biāo)記物保持部和檢測部，所述標(biāo)記物保持部保持有作為用標(biāo)記物標(biāo)記根據(jù)權(quán)利要求2所述的多克隆抗體所得的標(biāo)記抗體，所述檢測部固定有根據(jù)權(quán)利要求2所述的多克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的免疫層析檢測用裝置，其特征在于，所述裝置基本上由試樣添加部、標(biāo)記物保持部、層析介質(zhì)、檢測部和吸收部構(gòu)成。
5.ー種針對加熱加工食品中的來自豬肉的蛋白質(zhì)的免疫層析檢測用試劑盒，該檢測用試劑盒基本上由試樣添加部、標(biāo)記物保持部、層析介質(zhì)、檢測部和吸收部構(gòu)成,其中所述標(biāo)記物保持部保持有作為用標(biāo)記物標(biāo)記根據(jù)權(quán)利要求2所述的多克隆抗體所得的標(biāo)記抗體，所述檢測部固定有根據(jù)權(quán)利要求2所述的多克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種作為檢測抗體使用的多克隆抗體的制備方法，該多克隆抗體適用于特異性地、高性能且高靈敏度地通過免疫測定法對加熱加工食品中豬肉的進(jìn)行檢測，不會(huì)引發(fā)非特異性反應(yīng)。本發(fā)明還提供了一種使用該多克隆抗體進(jìn)行簡便的、高精度的檢測法以及用于該檢測方法的檢測試劑盒。利用免疫層析法來檢測試樣中的檢測對象物時(shí)，在一處或兩處地方使用可特異性識(shí)別加熱處理的豬肉中所含的23kD(分子量23,000)附近的蛋白質(zhì)的多克隆抗體作為檢測抗體，檢測加熱加工食品中來自豬肉的蛋白質(zhì)。
文檔編號(hào)G01N33/53GK102687013SQ201180004959
公開日2012年9月19日 申請日期2011年2月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月18日
發(fā)明者巖本久彥, 榊原雄広, 首藤達(dá)也 申請人:田中貴金屬工業(yè)株式會(huì)社