專利名稱：動(dòng)物源性食品獸藥殘留物檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)分析技術(shù)領(lǐng)域中動(dòng)物源性食品獸藥殘留物檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
我國(guó)是農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，其中動(dòng)物源性食品占有農(nóng)產(chǎn)品的很大一部分比例，動(dòng)物源性食品獸藥殘留物的檢測(cè)直接關(guān)系到居民食品消費(fèi)安全。
例如獸藥殘留物中的鏈霉素(streptomycin)是氨基糖甙類抗生素，是由二個(gè)或三個(gè)氨基糖分子和非糖部分的苷元通過氧橋連接而成，鏈霉素具有強(qiáng)大的抗革蘭氏陰性菌的作用，所以被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物疾病的治療。但是鏈霉素具有很多方面的毒性，一可以損害內(nèi)耳柯蒂器內(nèi)、外毛細(xì)胞的糖代謝和能量利用，導(dǎo)致內(nèi)耳毛細(xì)胞膜上鉀、鈉離子泵發(fā)生障礙，而使毛細(xì)胞功能受損害導(dǎo)致耳毒性；二由于鏈霉素經(jīng)腎排泄和在腎皮質(zhì)內(nèi)蓄積而導(dǎo)致腎毒性；三鏈霉素還可以與突觸前膜鈣結(jié)合部位結(jié)合，阻止鈣離子參與乙酰膽堿的釋放所造成的神經(jīng)毒性。其具有耳毒性、神經(jīng)毒性和腎臟毒性。又如獸藥中的氯霉素是一種廣譜抗生素，具有良好的抗菌和藥理特性，被廣泛應(yīng)用于各類家禽、家畜、水生動(dòng)物(魚、蝦等)及蜜蜂等的各種傳染病的防治。但是氯霉素對(duì)人有嚴(yán)重的副作用，可導(dǎo)致再生障礙性貧血；諸如此類的獸藥在食品中的殘留會(huì)影響人類健康，歐美日等國(guó)家及我國(guó)均要求限量使用；但是由于此類獸藥價(jià)格比較便宜，治療效果較好，經(jīng)濟(jì)回報(bào)高，違法使用仍很普遍。因此加強(qiáng)對(duì)動(dòng)物源性食品的檢測(cè)是非常必要的。
目前，主要采用儀器分析法檢測(cè)鏈霉素的殘留量，如薄層電泳法(TLC)、高壓液相色譜法(HPLC)、氣—質(zhì)聯(lián)機(jī)(GC/MS)、液—質(zhì)聯(lián)機(jī)(HPLC/MS)、毛細(xì)管電泳(CE)等。由于復(fù)雜的儀器設(shè)備和繁瑣的過程，不適合現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大量樣本篩選，其中ELISA檢測(cè)方法是一種新型的作為動(dòng)物源性食品中鏈霉素殘留檢測(cè)篩選方法已被使用，如中國(guó)專利申請(qǐng)(03206171.4)鏈霉素ELISA檢測(cè)試劑盒，該專利申請(qǐng)由96孔聚苯乙烯酶聯(lián)板、40ml濃縮洗滌液、11ml過氧化物酶標(biāo)記物、6ml鏈霉素抗體、6ml顯色液A液、6ml顯色液B液、6ml終止液、6瓶不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液和蓋板膜構(gòu)成。采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物鏈霉素將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗鏈霉素抗體，加入酶標(biāo)二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物鏈霉素的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物鏈霉素的含量。該方法與儀器分析技術(shù)相比雖然具有快速、簡(jiǎn)便、的特點(diǎn)，但是它采用的是二抗酶技術(shù)和間接競(jìng)爭(zhēng)免疫檢測(cè)方法，其中在二抗酶技術(shù)中，二抗一酶與一抗結(jié)合反應(yīng)，位點(diǎn)交叉問題，易引起非特異性結(jié)合，導(dǎo)致結(jié)合偏差致使靈敏度較差、而間接競(jìng)爭(zhēng)免疫檢測(cè)方法穩(wěn)定性較差、抗干擾能力較弱。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種動(dòng)物源性食品獸藥殘留物檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法；在本發(fā)明中采用抗原和抗體的直接競(jìng)爭(zhēng)免疫反應(yīng)以及采用生物素—親和素放大反應(yīng)系統(tǒng)；特異性較強(qiáng)，靈敏度較高，穩(wěn)定性較好，抗干擾能力較強(qiáng)。
本發(fā)明所述的上述技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的一種動(dòng)物源性食品獸藥殘留物檢測(cè)試劑盒，包括盒體，其特征在于，該試劑盒還包括生物素化用該試劑盒檢測(cè)的動(dòng)物源性食品獸藥殘留物所對(duì)應(yīng)的抗原或抗體及包被有相對(duì)應(yīng)的單克隆抗體的預(yù)包被板或酶標(biāo)板和親和素酶標(biāo)記物。
其中所述的單克隆抗體通常為鼠源抗體，生物素是一種維生素H，親和素是一種存在于卵清中的堿性糖蛋白，一個(gè)親和素分子可與4個(gè)生物素分子穩(wěn)定結(jié)合。親和素與生物素可與蛋白質(zhì)(包括抗原、抗體、酶等)分子結(jié)合而不影響親和素與生物素的生物活性，是理想的標(biāo)記劑。一個(gè)抗原分子可偶聯(lián)數(shù)十個(gè)生物素和親和素分子，而親和素或生物素分子又可與酶結(jié)合，從而組成一個(gè)分子放大系統(tǒng)，顯著提高檢測(cè)的靈敏度。
在上述的動(dòng)物源性食品獸藥殘留物檢測(cè)試劑盒中，所述的親和素標(biāo)記酶親和素標(biāo)記的辣根過氧化氫酶。
為了更方便現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大量樣本篩查，在動(dòng)物源性食品獸藥殘留物檢測(cè)試劑盒中，所述的試劑盒還包括動(dòng)物源性食品獸藥殘留物的標(biāo)準(zhǔn)溶液、生物素化抗原稀釋液、顯色劑、終止液、濃縮洗滌液。
在上述的動(dòng)物源性食品獸藥殘留物檢測(cè)試劑盒中，所述的生物素化抗原稀釋液為含聚乙二醇2萬的磷酸鹽緩沖液。
在上述的動(dòng)物源性食品獸藥殘留物檢測(cè)試劑盒中，所述的顯色劑由顯色劑A和顯色劑B組成，所述的顯色劑A為含無水乙醇、過氧化脲的檸檬酸鹽緩沖液，所述的顯色劑B為含四甲基聯(lián)苯胺檸檬酸鹽緩沖液。
在上述的動(dòng)物源性食品獸藥殘留物檢測(cè)試劑盒中，所述的終止液為2M H2SO4。
在上述的動(dòng)物源性食品獸藥殘留物檢測(cè)試劑盒中，所述的濃縮洗滌液為1％吐溫的磷酸鹽緩沖液。
一種動(dòng)物源性食品獸藥殘留物檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法包括以下步驟
1、在預(yù)包被板上或稱微孔條上預(yù)包被用該試劑盒檢測(cè)的一種動(dòng)物源性食品獸藥殘留物所對(duì)應(yīng)的單克隆抗體；2、相對(duì)應(yīng)動(dòng)物源性食品獸藥殘留物的標(biāo)準(zhǔn)品或樣本中的殘留物及相對(duì)應(yīng)的生物素化抗原，二者與抗體競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，形成抗體—生物素化抗原復(fù)合物；3、加入酶標(biāo)記的親和素，形成抗體—生物化抗原—親和素的復(fù)合物；4、TMB底物顯色。樣本的吸光值與其所含殘留物鏈霉素的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，即可得出相應(yīng)殘留物鏈霉素的含量。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1、適用范圍較廣適用于水產(chǎn)品、蜂蜜、飼料、牛奶及制品、動(dòng)物尿液、肌肉、組織等各種動(dòng)物源性食品獸藥殘留物殘留量的檢測(cè)。
2、本發(fā)明與儀器分析方法相比較具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、抗干擾性強(qiáng)和靈敏度高等特點(diǎn)，操作時(shí)間僅須1.5小時(shí)，檢測(cè)下限達(dá)到0.05ppb以下，能最大限度地減少操作誤差和工作強(qiáng)度。
3、本發(fā)明采用獨(dú)特的生物素—親和素放大系統(tǒng)，具有比傳統(tǒng)的二抗酶技術(shù)方法更加靈敏、更加穩(wěn)定、抗干擾性強(qiáng)的特點(diǎn)。若用于蜂蜜加工廠原料驗(yàn)收時(shí)的快速篩選檢測(cè)，可將蜂蜜直接稀釋后檢測(cè)，節(jié)省大量的樣本前處理時(shí)間和費(fèi)用。


圖1為本發(fā)明的動(dòng)物源性食品獸藥殘留物檢測(cè)試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2是本動(dòng)物源性食品獸藥殘留物檢測(cè)試劑盒中96孔鏈霉素單克隆抗體預(yù)包被板的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施例方式
以下接合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例一、鏈霉素殘留物檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法實(shí)施例1生物素化鏈霉素抗原及鏈霉素單克隆抗體的制備(1)生物素化鏈霉素抗原的合成抗原(抗體)在堿性(碳緩PH9.6)條件下透析八小時(shí)以上，再加入活化生物素與之合成反應(yīng)，最后在中性(一般磷酸鹽緩沖液PH7.5)透析，除去多余的活化生物素。
(2)鏈霉素單克隆抗體制備免疫小鼠二周以上，取小鼠脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，進(jìn)行細(xì)胞株克隆篩選，挑選出最佳分泌抗體的細(xì)胞株。以上單抗克隆抗體細(xì)胞株、注入小鼠腹腔即可獲得單克隆抗體腹水。此細(xì)胞株不用時(shí)凍存，用時(shí)進(jìn)行復(fù)蘇、培養(yǎng)。
所用單抗都需要經(jīng)過鹽析、分子篩以及親合層析進(jìn)行純化提取。
實(shí)施例2(1)鏈霉素殘留物檢測(cè)試劑盒的結(jié)構(gòu)試劑盒的結(jié)構(gòu)如圖1和圖2所示，主要有盒體1、96孔鏈霉素單克隆抗體預(yù)包被板2、6瓶鏈霉素系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品3、生物素化鏈霉素抗原工作液4、生物素化抗原稀釋液5、親和素酶標(biāo)記物工作液6、底物顯色劑A液7、底物顯色劑B液8、終止液9、濃縮洗滌液10和泡沫托架，泡沫托架上設(shè)有凹孔，上述3-10安放在泡沫托架的凹孔內(nèi)，泡沫托架及包被板2安放在盒體1內(nèi)，其中96孔鏈霉素單克隆抗體預(yù)包被板2由微孔條組成。
(2)所用試劑的配制a.鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液鏈霉素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液6瓶，1～3ml/瓶
b.生物素化鏈霉素抗原工作液，50％的甘油溶液；C.生物素化抗原稀釋液，含聚乙二醇2萬的磷酸鹽緩沖液；d.親和素酶標(biāo)記物工作液，含牛血白蛋白的磷酸鹽緩沖液；e.底物顯色劑A液，含無水乙醇過氧化脲的檸檬酸鹽緩沖液；f.底物顯色劑B液，含四甲基聯(lián)苯胺檸檬酸鹽緩沖液；g.終止液，2M H2SO4；h.濃縮洗滌液，1％吐溫的磷酸鹽緩沖液i.正己烷；j.PBST緩沖液配制(提取用)1.15g Na2HPO40.2g kH2PO40.2gKCl 9g NaCl；0.5ml Tween-20加蒸餾水或去離子水1000ml為PBST緩沖液。
k.提取緩沖液1g庚烷-磺酸鈉鹽(M＝202.2)，1.5gNa2HPO4·12H2O。加入蒸餾水至100ml，加入0.75ml濃磷酸調(diào)PH至2.0。
(3)96孔鏈霉素單克隆抗體預(yù)包被板的制備含單抗的磷酸鹽緩沖液(PH9.6)，包被24小時(shí)以上，加入封閉液(含牛血白蛋白的磷酸鹽緩沖液)封閉、凍干、真空包裝。
(4)所用的儀器——酶標(biāo)儀，——均質(zhì)器，——振蕩器，——離心機(jī)，——微量加樣器單道20ul-200ul、200ul-1000ul、多道250ul。
實(shí)施例3、樣品的前處理(1)牛奶樣品取牛奶2ml，將其置5000rpm離心10min，去除上層脂肪；取下層50ul，用PBS緩沖液按1∶40倍稀釋。(1950ulPBS緩沖液加50ul牛奶)樣品稀釋倍數(shù)40倍。
(2)雞肉樣品2g去除脂肪的粉碎樣品與8ml PBST緩沖液混合5min，加入正己烷5ml充分上下混合10min靜置1h。室溫離心15mim，10000rpm；用移液器取中間層1ml，加入1ml正己烷，充分振蕩5min；室溫離心15min，4000rpm；去除上層，取下層以1∶10倍稀釋(450ul PBS緩沖液加50ul上清)；樣品稀釋倍數(shù)40倍。
(3)肝臟樣品5.0g去除脂肪的粉碎樣品與20ml PBST緩沖液混合30min；室溫離心10min，10000rpm；2ml上清與3ml正己烷混合振蕩5min；室溫離心10min，4000rpm；去除上層脂肪層，用稀釋后的PBS緩沖液以1∶10稀釋(900ul稀釋液加100ul上清)；取60ul水相進(jìn)行分析；樣品稀釋倍數(shù)40倍。
(4)血清樣品取離心后的血清樣品20ul，用PBS緩沖液按1∶200稀釋(3980ul PBS緩沖液加20ul血清)；樣品稀釋倍數(shù)200倍；(5)蜂蜜產(chǎn)品樣品實(shí)施例4、檢測(cè)樣品中的殘留的鏈霉素(1)稱取稱量1g樣品加入提取緩沖液至10ml；振蕩10min完全溶解，室溫離心10min/4000rpm直至清亮；用RIDA C18柱(純化提取物(2)用2ml甲醇(100％)洗柱子，流速為60d/min；——用2ml水洗柱子，流速為60d/min；上樣，取2ml樣本，流速為15d/min；用氮?dú)饣蚩諝獯蹈芍樱?min。(除去柱中水份)；用1ml甲醇(100％)洗脫樣品，流速為15d/min；在40-50℃，弱空氣或氮?dú)饬飨峦耆舭l(fā)溶劑；用2ml稀釋后的PBS緩沖液溶解干燥的殘留物，取60ul進(jìn)行分析；稀釋倍數(shù)10倍；檢測(cè)下限3ppb。其中以上所有試劑和樣品處理必須室溫下進(jìn)行
(3)樣品檢測(cè)所有試劑及標(biāo)本在檢測(cè)實(shí)驗(yàn)前必須置室溫(20℃±5℃左右)，將試劑盒打開，平衡1小時(shí)以上；取出框架及需要數(shù)量的微孔條，將不用的微孔條放入自封袋，保存于(2-8℃)；根據(jù)所需用量將生物素化抗原用稀釋液1∶20稀釋(1份加19份稀釋液)，僅供現(xiàn)檢測(cè)用。(未經(jīng)稀釋的生物素化抗原于-20℃保存)；加樣設(shè)空白孔一孔，加PBS或生理鹽水100ul；將標(biāo)準(zhǔn)溶液及待測(cè)樣品進(jìn)行雙孔平行加樣50ul，同時(shí)加入生物素化鏈霉素抗原50ul；封板振蕩混勻1分鐘，置入37℃恒溫培養(yǎng)箱或37℃恒溫水浴箱溫育30分鐘；洗板機(jī)洗板5次。手工洗板3次將孔內(nèi)液體甩掉，用吸水紙扣干，加入洗液250ul/孔，靜置1分鐘，再甩掉液體，扣干。重復(fù)操作3次；每孔加入酶標(biāo)記親和素溶液100ul(空白孔加入PBS或生理鹽水100ul)，封板置入37℃恒溫培養(yǎng)箱或37℃恒溫水浴箱溫育30分鐘；洗板機(jī)洗板5次，手工洗板3次，每次間隔1分鐘；加入顯色劑A、顯色劑B各50ml，封板混勻15秒，37℃恒溫培養(yǎng)箱或37℃恒溫水浴箱溫育15分鐘；每孔加入終止液50ul，輕輕振蕩混勻，讀取450nm吸光值(以空白孔作零吸光值，建議用雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè)，在加入終止液15分鐘內(nèi)讀完數(shù)據(jù))。
本實(shí)施例中所用的試劑按照實(shí)施例2中的試劑配制方法進(jìn)行配制。
所獲得的標(biāo)準(zhǔn)和樣品吸光度值的平均值除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值再乘以100。因此0標(biāo)準(zhǔn)等于100％并且以百分比給出吸光值度值。

計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)值繪成為一個(gè)對(duì)應(yīng)鏈霉素濃度(ug/kg)的半對(duì)數(shù)坐標(biāo)系統(tǒng)曲線圖，校正曲線在0.3～24.3ug/kg(ppb)范圍內(nèi)應(yīng)當(dāng)成為線性。相對(duì)應(yīng)每一個(gè)樣品的濃度(ug/kg)可以從校正曲線上讀出。
本發(fā)明的鏈霉素試劑盒在使用過程中注意的事項(xiàng)1、室溫低于20℃或試劑及標(biāo)本沒有回到室溫(25℃左右)會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)伴隨著出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象，所以洗板拍干后立即進(jìn)行下一步操作。
3、混合要均勻，洗板要徹底，否則會(huì)出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。
4、反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
5、儲(chǔ)存條件試劑盒于2℃-8℃保存，將不用的微孔條放進(jìn)自封袋重新密封；由于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對(duì)光敏感，一定要避免直接暴露在強(qiáng)光下。
6、試劑變質(zhì)的現(xiàn)象顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.8個(gè)單位(A450＜0.8)時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。
7、加A、B液后一般顯色15min即可，若顏色較淺，可適當(dāng)延長(zhǎng)顯色時(shí)間，但不能超過20min。
8、不得使用失效期后的試劑盒組分，不同批次試劑盒組分不得混合使用。
9、各板孔最后均用于測(cè)定光學(xué)曲線，應(yīng)防止孔底內(nèi)外遭受污損。
實(shí)施例5、(1)氯霉素殘留物檢測(cè)試劑盒組成
a.氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液氯霉素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液6瓶，1～3ml/瓶b.生物素化氯霉素抗體工作液，c.生物素化抗體稀釋液，d.親和素酶標(biāo)記物工作液，e.底物顯色劑A液，f.底物顯色劑B液，g.終止液，h.濃縮洗滌液，(2)96孔預(yù)包被酶標(biāo)板以上物質(zhì)的制備方法同實(shí)施例2(3)所用儀器同實(shí)施例2、試劑試劑以下所有試劑均推薦使用分析純或優(yōu)級(jí)純；水為蒸餾水或去離子水。
——乙酸乙酯——乙腈——正己烷——亞硝基鐵氰化鈉——硫酸鋅實(shí)施例6、樣品的前處理將濃縮稀釋液用蒸餾水按1∶10稀釋，(用于抗體的稀釋和樣本提取后的稀釋)(a)組織(雞肉/肝、豬肉/肝、蝦、魚等)前處理方法用均質(zhì)器均質(zhì)組織樣品；稱3g±0.1g均質(zhì)后的樣品于離心管中，加入6ml乙酸乙酯，振蕩10min，室溫3000g以上，離心10min；取出4ml上層液體(約相當(dāng)于2g的樣品)在氮?dú)饬飨?0～60℃干燥；加入1ml正己烷溶解干燥的殘留物，再加1ml稀釋液強(qiáng)烈振蕩1min，室溫3000g以上，離心5min；去除上層正己烷相，取下層水相50μl進(jìn)行分析；樣品稀釋倍數(shù)0.5倍。
(b)血清血漿前處理方法取1ml血清或血漿至試管中，加2ml乙酸乙酯振蕩1min；靜置使水相與有機(jī)相分層或室溫3000g，離心5min；移取上層的乙酸乙酯至另一試管中，用氮?dú)饬?0℃水浴中吹干；殘留物用1ml稀釋液溶解；取50μl進(jìn)行分析；注樣本稀釋倍數(shù)為1倍。
(c)尿液前處理方法移取2ml尿液到離心管中，加pH4.8100mM醋酸鈉緩沖液0.5ml混合；加40ul葡萄糖苷酸酶(Merck，Art.No.4114)到稀釋的尿液中，在37℃水解至少2小時(shí)(或過夜)；該溶液恢復(fù)至室溫后加入8ml乙酸乙酯混合1min；室溫3000g離心10min，取出4ml上層液體(相當(dāng)于0.5ml尿樣)在氮?dú)庀?0～60℃干燥；用1ml稀釋液溶解干燥的殘留物取50μl進(jìn)行分析；注樣本稀釋倍數(shù)為1倍。
(d)蜂蜜前處理方法取2g蜂蜜，放入離心管中，用4ml去離子水溶解；加入4ml乙酸乙酯上下震蕩10min；室溫3000g以上離心10min；移取1ml上層乙酸乙酯(相當(dāng)于0.5g樣品)到另一離心管中，50～60℃氮?dú)饬飨抡舾?；殘留物用稀釋后?.5ml稀釋液溶解；取50ul進(jìn)行分析；樣品稀釋倍數(shù)為1倍。
(e)腸衣前處理方法稱1g±0.1g均質(zhì)后的樣品于離心管中，加入10ml乙酸乙酯，振蕩10min，室溫3000g以上，離心10min；取出5ml上層液體(相當(dāng)于0.5g的樣品)在氮?dú)饬飨?0～60℃干燥；加入1ml正己烷溶解干燥的殘留物，再加0.5ml稀釋液強(qiáng)烈振蕩1min，室溫3000g以上，離心5min；去除上層相，取下層水相50μl進(jìn)行分析；樣品稀釋倍數(shù)1倍。注干樣本需剪碎(長(zhǎng)度不超5mm)后再均質(zhì)，濕樣本需用去離子水漂洗20min以上(去除表面的鹽份)，瀝干后再進(jìn)行均質(zhì)。
(f)牛奶和奶粉前處理方法需配制的液體C液0.36M亞硝基鐵氰化鈉(Na2Fe(CN)5·NO·2H2O)稱取10.7g亞硝基鐵氰化鈉，溶于100ml去離子水中。
D液1M硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)稱取28.8g硫酸鋅，溶于100ml去離子水中。
牛奶樣品處理方法一牛奶樣品，10℃3000g以上離心10min，吸除上層脂肪；取5ml去除脂肪奶樣至離心管中，加入150ul C液出現(xiàn)沉淀，短暫振蕩后加入150ul D液混合；15℃3000g以上離心10min，移取上層液；用稀釋液以等體積稀釋上層液；取50ul進(jìn)行分析；注意如果離心后仍然渾濁，再重復(fù)沉淀過程。稀釋倍數(shù)為2.1倍。
牛奶樣品處理方法二取5ml去除脂肪奶樣至離心管中；加入250ul C液和250ul D液徹底混合，4-12℃3000g以上離心10min。如果沒有冷凍離心機(jī)，請(qǐng)預(yù)先將樣品冷卻到8℃；轉(zhuǎn)移出2.2ml上層液(相當(dāng)于2ml奶樣)至一個(gè)新的離心管中，加入4ml乙酸乙酯上下振蕩10min；室溫(20-25℃)3000g以上離心10min；轉(zhuǎn)移出2ml乙酸乙酯上層液體(相當(dāng)于1ml奶樣)，60℃氮?dú)饬飨峦耆稍?；?.5ml稀釋液溶解干燥的殘留物；取50ul進(jìn)行分析；稀釋倍數(shù)為0.5倍。
奶粉樣品處理方法稱2g奶粉至離心管中，加入10ml去離子水，振蕩溶解；加1ml C液和1ml D液徹底混合。4-12℃3000g以上離10min。若無冷凍離心機(jī)，請(qǐng)預(yù)先將樣品冷卻到8℃；轉(zhuǎn)移出3.6ml上層液(相當(dāng)于0.6g奶粉)至一個(gè)新的離心管中，加入6ml乙酸乙酯上下來回振蕩10min；室溫(20-25℃)3000g以上離心10min；轉(zhuǎn)移出4ml乙酸乙酯上層液體(相當(dāng)于0.4g奶粉)，60℃氮?dú)饬飨峦耆稍?；?.4ml稀釋液溶解干燥的殘留物；取50ul進(jìn)行分析；稀釋倍數(shù)為1倍。
蛋類前處理方法用均質(zhì)器低速均質(zhì)樣品(蛋黃或全蛋)；稱取3g均質(zhì)過的樣品，與9ml乙腈-水溶液(84+16；V+V)振蕩提取10min，15℃3000g以上離10min；取3ml上層液與3ml蒸餾水混合，加入4.5ml乙酸乙酯混合5min，15℃3000g以上離心10min；將上層有機(jī)相轉(zhuǎn)移到試管中用氮?dú)獯蹈?；加?ml正己烷溶解殘留物后，用2ml稀釋液反萃取混合1min，離心去除正己烷相；取50ul下層相進(jìn)行分析；注樣本稀釋倍數(shù)為2。
樣本定量檢測(cè)下限雞肉/雞肝、豬肉/豬肝、蝦、魚----------0.05ppb蜂蜜----------------------------------0.15ppb尿液、血清----------------------------0.1ppb腸衣----------------------------------0.1ppb牛奶----------------------------------0.05ppb蛋類----------------------------------0.1ppb實(shí)施例7、檢測(cè)樣品中的殘留的氯霉素1、所有試劑及標(biāo)本在檢測(cè)實(shí)驗(yàn)前必須置室溫(20℃±5℃左右)，將試劑盒打開，平衡1小時(shí)以上。
2、取出框架及需要數(shù)量的微孔條，將不用的微孔條放入自封袋，保存于(2-8℃)。
3、根據(jù)所需用量將生物素化抗體用生物素化抗體稀釋液1∶20稀釋(1份加19份稀釋液)，僅供現(xiàn)檢測(cè)用。(未經(jīng)稀釋的生物素化抗體于-20℃保存)。
4、加樣設(shè)空白孔一孔，加PBS或生理鹽水100ul；將標(biāo)準(zhǔn)溶液及待測(cè)樣品進(jìn)行雙孔平行加樣50ul，同時(shí)加入生物素化氯霉素抗體50ul；封板振蕩混勻1分鐘，置入37℃恒溫培養(yǎng)箱或37℃恒溫水浴箱溫育30分鐘。
5、洗板機(jī)洗板5次。手工洗板將孔內(nèi)液體甩掉，用吸水紙扣干，加入洗液250ul/孔靜置1分鐘，再甩掉液體，扣干。重復(fù)此次操作3次。
6、每孔加入酶標(biāo)記親和素溶液100ul(空白孔加入PBS或生理鹽水100ul)，封板置入37℃恒溫培養(yǎng)箱或37℃恒溫水浴箱溫育30分鐘。
7、洗板機(jī)洗板5次，手工洗板3次，每次間隔1分鐘。
8、加入顯色劑A、顯色劑B各50ml，封板混勻15秒，37℃恒溫培養(yǎng)箱或37℃恒溫水浴箱溫育15分鐘。
9、每孔加入終止液50ul，輕輕振蕩混勻，讀取450nm吸光值(以空白孔作零吸光值，建議用雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè)，在加入終止液15分鐘內(nèi)讀完數(shù)據(jù))。
所獲得的標(biāo)準(zhǔn)和樣品吸光度(OD)值的平均值除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的OD值再乘以100。因此0標(biāo)準(zhǔn)等于100％并且以百分比給出OD值。
計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)值繪成一個(gè)對(duì)應(yīng)氯霉素濃度(ug/kg)的半對(duì)數(shù)坐標(biāo)系統(tǒng)曲線圖，校正曲線在0.05～4.05ug/kg(ppb)范圍內(nèi)應(yīng)當(dāng)成為線性。相對(duì)應(yīng)每一個(gè)樣品的濃度(ug/kg)可以從校正曲線上讀出。
本發(fā)明中所描述的具體實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明精神作舉例說明。本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)所描述的具體實(shí)施例做各種各樣的修改或補(bǔ)充或采用類似的方式替代，但并不會(huì)偏離本發(fā)明的精神或者超越所附權(quán)利要求書所定義的范圍。
盡管對(duì)本發(fā)明已作出了詳細(xì)的說明并引證了一些具體實(shí)例，但是對(duì)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來說，只要不離開本發(fā)明的精神和范圍可作各種變化或修正是顯然的。
權(quán)利要求
1.一種動(dòng)物源性食品獸藥殘留物檢測(cè)試劑盒，包括盒體，其特征在于，該試劑盒還包括生物素化用該試劑盒檢測(cè)的動(dòng)物源性食品獸藥殘留物所對(duì)應(yīng)的抗原或抗體及包被有相對(duì)應(yīng)的單克隆抗體的預(yù)包被板或酶標(biāo)板和親和素酶標(biāo)記物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動(dòng)物源性食品獸藥殘留物檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的單克隆抗體通常為鼠源抗體，生物素是一種維生素H，親和素是一種存在于卵清中的堿性糖蛋白，一個(gè)親和素分子可與4個(gè)生物素分子穩(wěn)定結(jié)合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動(dòng)物源性食品獸藥殘留物檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的親和素標(biāo)記酶親和素標(biāo)記的辣根過氧化氫酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的動(dòng)物源性食品獸藥殘留物檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還包括動(dòng)物源性食品獸藥殘留物的標(biāo)準(zhǔn)溶液、生物素化抗原稀釋液、顯色劑、終止液、濃縮洗滌液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動(dòng)物源性食品獸藥殘留物檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的生物素化抗原稀釋液為含聚乙二醇2萬的磷酸鹽緩沖液。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的動(dòng)物源性食品獸藥殘留物檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的顯色劑由顯色劑A和顯色劑B組成，所述的顯色劑A為含無水乙醇、過氧化脲的檸檬酸鹽緩沖液，所述的顯色劑B為含四甲基聯(lián)苯胺檸檬酸鹽緩沖液。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的動(dòng)物源性食品獸藥殘留物檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的終止液為2M H2SO4。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的動(dòng)物源性食品獸藥殘留物檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的濃縮洗滌液為1％吐溫的磷酸鹽緩沖液。
9.一種動(dòng)物源性食品獸藥殘留物檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法包括以下步驟(1)、在預(yù)包被板上或稱微孔條上預(yù)包被用該試劑盒檢測(cè)的一種動(dòng)物源性食品獸藥殘留物所對(duì)應(yīng)的單克隆抗體；(2)、相對(duì)應(yīng)動(dòng)物源性食品獸藥殘留物的標(biāo)準(zhǔn)品或樣本中的殘留物及相對(duì)應(yīng)的生物素化抗原，二者與抗體競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，形成抗體—生物素化抗原復(fù)合物；(3)、加入酶標(biāo)記的親和素，形成抗體—生物化抗原—親和素的復(fù)合物；(4)、TMB底物顯色樣本的吸光值與其所含殘留物鏈霉素的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，即可得出相應(yīng)殘留物鏈霉素的含量。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種動(dòng)物源性食品獸藥殘留物檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，涉及農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)分析技術(shù)領(lǐng)域。本試劑盒包括盒體，該試劑盒還包括生物素化用該試劑盒檢測(cè)的動(dòng)物源性食品獸藥殘留物所對(duì)應(yīng)的抗原或抗體及包被有相對(duì)應(yīng)的單克隆抗體的預(yù)包被板或酶標(biāo)板和親和素酶標(biāo)記物。本動(dòng)物源性食品獸藥殘留物檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法是通過加入酶標(biāo)記的親和素，形成抗體－生物化抗原－親和素的復(fù)合物，然后TMB底物顯色。樣本的吸光值與其所含殘留物鏈霉素的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，即可得出相應(yīng)殘留物鏈霉素的含量。本發(fā)明不僅適用范圍較廣，而且還具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、抗干擾性強(qiáng)和靈敏度高的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N21/78GK1811453SQ200610023659
公開日2006年8月2日 申請(qǐng)日期2006年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月26日
發(fā)明者王華全, 劉建中, 林榮業(yè) 申請(qǐng)人:臺(tái)州金芯生物工程有限公司