本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種人類多基因突變檢測試劑盒(高通量測序法)及其用途。
背景技術(shù)：
：肺癌是嚴(yán)重危害人類健康的常見惡性腫瘤之一，其中80％-85％為非小細(xì)胞肺癌(nonsmallcelllungcancer，nsclc)。隨著對腫瘤發(fā)病機(jī)制及其生物學(xué)行為研究的不斷深入，靶向治療成為研究熱點，包括egfr、kras、alk等多個基因靶點。表皮生長因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor，egfr)是目前腫瘤治療的重要靶點。egfr基因位于人第7號染色體短臂(7p12)，長約118kb，由28個外顯子組成，其轉(zhuǎn)錄編碼的跨細(xì)胞膜糖蛋白的胞內(nèi)區(qū)具有酪氨酸激酶(tyrosinekinase，tk)活性，可通過2條途徑將信號傳遞至細(xì)胞核，一條是ras->raf->mapk，一條是pi3k->pkc->ikk途徑，進(jìn)而調(diào)節(jié)核內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄水平，影響細(xì)胞的增殖、遷移、分化、血管新生。egfr信號傳導(dǎo)的異常是導(dǎo)致多種腫瘤發(fā)生的原因。egfr基因突變主要發(fā)生在胞內(nèi)tk區(qū)域的4個外顯子上(18-21外顯子)，研究表明，其中18、19、21外顯子發(fā)生突變的肺癌患者服用酪氨酸激酶抑制劑(tyrosinekinaseinhibitors,tkis)類藥物的療效較好，20外顯子發(fā)生的突變常與一代、二代egfr-tkis耐藥相關(guān)，但是對3代egfr-tkis類藥物敏感。中國肺癌患者中，egfr突變率約為30％-50％，其中18外顯子上的點突變約占egfr突變類型的5％左右，19外顯子上發(fā)生的多種缺失突變約占egfr突變類型的45％左右，20外顯子上發(fā)生的t790m點突變約占egfr突變類型的5％左右，21外顯子上發(fā)生的l858r、l861q點突變約占egfr突變類型的40％-45％。kras基因(kirsten-rousaviansarcoma)是ras基因家族成員，位于12號染色體的12p12.1位置，編碼產(chǎn)物為21kd的kras蛋白，參與egfr信號傳導(dǎo)過程。kras基因突變可導(dǎo)致ras異常活化，誘發(fā)腫瘤。多個臨床研究結(jié)果提示，kras基因第2號外顯子第12、13位密碼子的突變狀態(tài)與患者服用egfr-tkis類藥物的療效密切相關(guān)，攜帶kras突變的患者對上述藥物的療效明顯降低。在中國肺癌患者中，kras基因突變率約為2％-10％。棘皮動物微管相關(guān)蛋白樣4-間變性淋巴瘤激酶(echinodermmicrotubuleassociatedproteinlike4-anaplasticlymphomakinase，eml4-alk)基因的融合是非小細(xì)胞肺癌中多見的融合類型，發(fā)生率為3％-5％，多見于非(輕度)吸煙肺癌患者中。eml4-alk融合導(dǎo)致編碼跨膜酪氨酸激酶受體的alk基因持續(xù)表達(dá)，從而激活alk酪氨酸激酶區(qū)及下游pi3k/akt及mapk等信號通路，引起肺癌的發(fā)生。臨床研究表明，alk激酶抑制劑通過競爭性結(jié)合于alk激酶區(qū)域，阻斷了alk下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而使具有eml4-alk的患者從alk激酶抑制劑的治療中獲益?，F(xiàn)行肺癌基因突變檢測方法有：(1)sanger測序方法概念：sanger法是根據(jù)核苷酸在某一固定的點開始，隨機(jī)在某一個特定的堿基處終止，并且在每個堿基后面進(jìn)行熒光標(biāo)記，產(chǎn)生以a、t、c、g結(jié)束的四組不同長度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的page膠上電泳進(jìn)行檢測，從而獲得可見的dna堿基序列。測序原理：利用一種dna聚合酶來延伸結(jié)合在待定序列模板上的引物。直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測定由一套四個單獨的反應(yīng)構(gòu)成，每個反應(yīng)含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dntp)，并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddntp)。由于ddntp缺乏延伸所需要的3-oh基團(tuán)，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在g、a、t或c處終止。終止點由反應(yīng)中相應(yīng)的雙脫氧而定。每一種dntps和ddntps的相對濃度可以調(diào)整，使反應(yīng)得到一組長幾百至幾千堿基的鏈終止產(chǎn)物。它們具有共同的起始點，但終止在不同的的核苷酸上，可通過高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理后可用x-光膠片放射自顯影或非同位素標(biāo)記進(jìn)行檢測。sanger法優(yōu)缺點優(yōu)點：方法簡便，操作簡單。缺點：dna模板的組成或二級結(jié)構(gòu)有時引起dna聚合酶不正常終止。(2)arms-pcr方法概念：突變擴(kuò)增系統(tǒng)(amplificationrefractorymutationsystem,arms)又稱等位基因特異性擴(kuò)增法(allelespecificamplification,asa)，是newton等首先建立用來檢測已知突變的方法。arms-pcr原理：taqdna聚合酶缺少3’-5’外切酶活性，在一定條件下pcr引物3’末端的錯配導(dǎo)致產(chǎn)物的急劇減少，針對不同的已知突變，設(shè)計適當(dāng)?shù)囊锟梢酝ㄟ^pcr方法直接達(dá)到區(qū)分突變型和野生型基因的目的。arms-pcr優(yōu)缺點優(yōu)點：靈敏度高，數(shù)據(jù)分析要求低。缺點：覆蓋度小，試劑成本高。關(guān)于肺癌的遺傳機(jī)制很復(fù)雜，其中既有dna突變，也有rna融合?，F(xiàn)有技術(shù)單獨檢測dna突變或rna融合，存在局限性。dna突變和rna融合檢測的結(jié)合，又會增加經(jīng)濟(jì)及時間成本。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有技術(shù)中所存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種人類多基因突變檢測試劑盒(高通量測序法)及其用途。為了實現(xiàn)上述目的以及其他相關(guān)目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：本發(fā)明的第一方面，提供一種人類多基因突變檢測試劑盒(高通量測序法)，所述試劑盒中包括dnapcr引物和rnapcr引物，所述dnapcr引物包括kras基因突變檢測引物對、egfr基因突變檢測引物對，所述rnapcr引物包括alk基因融合檢測引物對。優(yōu)選地，所述kras基因突變檢測引物對的檢測位點包括：c.35g>ap.g12d；c.35g>cp.g12a；c.35g>tp.g12v；c.34g>ap.g12s；c.34g>cp.g12r；c.34g>tp.g12c；c.38g>ap.g13d；所述egfr基因突變檢測引物對的檢測位點包括：c.2573t>gp.l858r；c.2582t>ap.l861q；c.2235_2249delp.e746_a750del；c.2236_2250delp.e746_a750del；c.2156g>cp.g719a；c.2369c>tp.t790m；所述alk基因融合檢測引物對的檢測位點包括eml4(13)-alk(20)。優(yōu)選地，所述kras基因突變檢測引物對包括核苷酸序列如seqidno.1所示的正向引物和核苷酸序列如seqidno.2所示的反向引物。所述kras基因突變檢測引物對的檢測位點包括：c.35g>ap.g12d；c.35g>cp.g12a；c.35g>tp.g12v；c.34g>ap.g12s；c.34g>cp.g12r；c.34g>tp.g12c；c.38g>ap.g13d。優(yōu)選地，所述egfr基因突變檢測引物對包括第一檢測引物對、第二檢測引物對、第三檢測引物對和第四檢測引物對，所述第一檢測引物對包括核苷酸序列如seqidno.3所示的正向引物和核苷酸序列如seqidno.4所示的反向引物，所述第二檢測引物對包括核苷酸序列如seqidno.5所示的正向引物和核苷酸序列如seqidno.6所示的反向引物，所述第三檢測引物對包括核苷酸序列如seqidno.7所示的正向引物和核苷酸序列如seqidno.8所示的反向引物，所述第四檢測引物對包括核苷酸序列如seqidno.9所示的正向引物和核苷酸序列如seqidno.10所示的反向引物。所述第一檢測引物對的檢測位點包括c.2573t>gp.l858r和c.2582t>ap.l861q；所述第二檢測引物對的檢測位點包括c.2235_2249delp.e746_a750del、c.2236_2250delp.e746_a750del。所述第三檢測引物對的檢測位點包括c.2156g>cp.g719a。所述第四檢測引物對的檢測位包括c.2369c>tp.t790m。優(yōu)選地，所述alk基因融合檢測引物對包括核苷酸序列如seqidno.11所示的正向引物和核苷酸序列如seqidno.12所示的反向引物。所述alk基因融合檢測引物對的檢測位點包括eml4-alk。本發(fā)明的試劑盒可同時檢測dna突變和rna融合，檢測引物對的設(shè)計是本發(fā)明試劑盒的關(guān)鍵。本發(fā)明的試劑盒是基于iontorrent平臺的高通量測序技術(shù)來進(jìn)行檢測的，所以試劑盒中還包括一些基于iontorrent平臺的高通量測序所需要的常規(guī)試劑，如：文庫引物混合液、hifipcr混合液、fupa試劑、連接緩沖液、dna連接酶、hifi酶混合液、洗脫緩沖液、接頭、標(biāo)簽n(n＝1，2…96)等等。進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液。進(jìn)一步地，所述試劑盒中還含有陽性對照。例如：dna陽性對照、rna陽性對照。進(jìn)一步地，所述試劑盒中還含有陰性對照。例如：陰性對照。本發(fā)明的一種具體實施方式中，列舉了試劑盒中的主要組成成分及其規(guī)格為：本發(fā)明的第二方面，提供了前述試劑盒的使用方法，包括步驟：(1)獲取樣本核酸，所述核酸是dna或rna，若核酸為rna則先將其進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cdna；(2)制備基因文庫：1)多重pcr：將步驟(1)所獲得的dna采用包括dnapcr引物混合液的pcr反應(yīng)體系進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得dnapcr擴(kuò)增產(chǎn)物；將步驟(1)所獲得的cdna采用包括rnapcr引物混合液的pcr反應(yīng)體系進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得cdnapcr擴(kuò)增產(chǎn)物；2)消化部分引物序列：將步驟1)所獲得的dnapcr擴(kuò)增產(chǎn)物和cdnapcr擴(kuò)增產(chǎn)物，采用fupa試劑消化，獲得消化后的目標(biāo)產(chǎn)物；3)連接接頭和標(biāo)簽：接下來將經(jīng)過fupa試劑消化的目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行連接接頭和標(biāo)簽；4)片段篩選：接下來采用磁珠進(jìn)行純化做核酸片段篩選得到片段集中的dna，將hifi酶混合液和文庫引物混合液混合均勻，進(jìn)行洗脫；5)文庫擴(kuò)增：接下來將連接了接頭和標(biāo)簽的dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增；6)文庫片段選擇：將pcr擴(kuò)增后的產(chǎn)物采用磁珠進(jìn)行純化做核酸片段篩，獲得基因文庫。本發(fā)明的第三方面，提供前述試劑盒在制備肺癌基因突變與融合檢測產(chǎn)品中的用途。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明的人類多基因突變檢測試劑盒(高通量測序法)，能夠同時檢測dna突變和rna融合，靈敏度高，檢測限低，特異性高，重復(fù)性好，準(zhǔn)確率及陽性符合率均高達(dá)100％。具體實施方式高通量測序方法高通量測序技術(shù)(high-throughputsequencing)又稱“下一代”測序技術(shù)("next-generation"sequencingtechnology)，以能一次并行對幾十萬到幾百萬條dna分子進(jìn)行序列測定和一般讀長較短等特征標(biāo)志?；蛲蛔僩enemutation即基因組dna分子發(fā)生的突然的、可遺傳的變異現(xiàn)象。基因融合rnafusion是指兩個或多個基因的編碼區(qū)首尾相連，置于同一套調(diào)控序列(包括啟動子、增強(qiáng)子、核糖體結(jié)合序列、終止子等)控制之下，構(gòu)成的嵌合基因。在進(jìn)一步描述本發(fā)明具體實施方式之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下述特定的具體實施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體實施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。下列實施例中未注明具體條件的試驗方法，通常按照常規(guī)條件，或者按照各制造商所建議的條件。當(dāng)實施例給出數(shù)值范圍時，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本
技術(shù)領(lǐng)域：
技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員對現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實現(xiàn)本發(fā)明。除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本
技術(shù)領(lǐng)域：
常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組dna技術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻(xiàn)中已有完善說明，具體可參見sambrook等molecularcloning：alaboratorymanual，secondedition，coldspringharborlaboratorypress，1989andthirdedition，2001；ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，newyork，1987andperiodicupdates；theseriesmethodsinenzymology，academicpress，sandiego；wolffe，chromatinstructureandfunction，thirdedition，academicpress，sandiego，1998；methodsinenzymology，vol.304，chromatin(p.m.wassarmananda.p.wolffe，eds.)，academicpress，sandiego，1999；和methodsinmolecularbiology，vol.119，chromatinprotocols(p.b.becker，ed.)humanapress，totowa，1999等。實施例1試劑盒的組成及制備本發(fā)明的人類多基因突變檢測試劑盒(高通量測序法)中包括dnapcr引物混合液和rnapcr引物混合液，如下表1-1所示，所述dnapcr引物包括kras基因突變檢測引物對、egfr基因突變檢測引物對，所述rnapcr引物包括alk基因融合檢測引物對，所述kras基因突變檢測引物對包括核苷酸序列如seqidno.1所示的正向引物和核苷酸序列如seqidno.2所示的反向引物，所述egfr基因突變檢測引物對包括第一檢測引物對、第二檢測引物對、第三檢測引物對和第四檢測引物對，所述第一檢測引物對包括核苷酸序列如seqidno.3所示的正向引物和核苷酸序列如seqidno.4所示的反向引物，所述第二檢測引物對包括核苷酸序列如seqidno.5所示的正向引物和核苷酸序列如seqidno.6所示的反向引物，所述第三檢測引物對包括核苷酸序列如seqidno.7所示的正向引物和核苷酸序列如seqidno.8所示的反向引物，所述第四檢測引物對包括核苷酸序列如seqidno.9所示的正向引物和核苷酸序列如seqidno.10所示的反向引物，所述alk基因融合檢測引物對包括核苷酸序列如seqidno.11所示的正向引物和核苷酸序列如seqidno.12所示的反向引物。本發(fā)明的試劑盒是基于iontorrent平臺的高通量測序技術(shù)來進(jìn)行檢測的，所以試劑盒中還包括一些基于iontorrent平臺的高通量測序所需要的常規(guī)試劑，如：文庫引物混合液、hifipcr混合液、fupa試劑、連接緩沖液、dna連接酶、hifi酶混合液、洗脫緩沖液、接頭、標(biāo)簽n(n＝1，2…96)等等。進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液。進(jìn)一步地，所述試劑盒中還含有陽性對照。例如：dna陽性對照、rna陽性對照。進(jìn)一步地，所述試劑盒中還含有陰性對照。例如：陰性對照?？刹捎帽景l(fā)明試劑盒中的包括dnapcr引物和rnapcr引物，對樣本中的dna檢測位點和rna檢測位點進(jìn)行擴(kuò)增，然后采用iontorrent平臺對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測序。表1-1實施例2試劑盒及其使用性能評估試驗一、試劑盒的組成：本實施例提供本發(fā)明試劑盒的一種具體的實施方式，在該具體的實施方法中，本發(fā)明的人類多基因突變檢測試劑盒(高通量測序法)的主要組成成分如下表1-2所示，但是并不局限于此，只要人類多基因突變檢測試劑盒(高通量測序法)中包括表1-1中所示的dnapcr引物和rnapcr引物即可：表1-2主要組成成分規(guī)格文庫引物混合液192μl/管，1管hifipcr混合液384μl/管，1管fupa試劑192μl/管，1管連接緩沖液384μl/管，1管dna連接酶192μl/管，1管hifi酶混合液1600μl/管，3管dnapcr引物混合液192μl/管，1管rnapcr引物混合液192μl/管，1管洗脫緩沖液12ml/管，1管逆轉(zhuǎn)錄酶48μl/管，1管逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液96μl/管，1管接頭192μl/管，1管標(biāo)簽n(n＝1，2…96)2μl/管，96管dna陽性對照8μl/管，1管陰性對照16μl/管，1管rna陽性對照50ng/管，2管文庫純化磁珠960μl/管，16管其中，上表1-2中的dnapcr引物混合液為將dnapcr引物溶于lowte中獲得，rnapcr引物混合液為將rnapcr引物溶于lowte中獲得。所述dnapcr引物混合液和所述rnapcr引物混合液用于目的片段擴(kuò)增。采用nanodrop檢測dnapcr引物混合液及rnapcr引物混合液的濃度，結(jié)果dnapcr引物混合液中各dnapcr引物的濃度≥4000ng/ul，rnapcr引物混合液中rnapcr引物的濃度濃度≥1000ng/ul，均符合使用要求。qpcr檢測結(jié)果，每個qpcr孔中ct值＜35，表示dnapcr引物混合液和rnapcr引物混合液中含有目標(biāo)引物。上表1-2中，所述文庫引物混合液用于對連接了接頭和標(biāo)簽的dna進(jìn)行文庫擴(kuò)增。所述文庫引物混合液可以是本領(lǐng)域的常規(guī)試劑，功能同ionlibraryamplificationprimermix。上表1-2中的逆轉(zhuǎn)錄酶及逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液，為本領(lǐng)域常規(guī)使用的反轉(zhuǎn)錄試劑，只要能夠滿足對rna進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄的要求即可。以發(fā)生eml4(13)-alk(20)融合的rna作為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，檢測cdna擴(kuò)增情況，qpcr檢測反轉(zhuǎn)錄試劑性能。結(jié)果如表2顯示，所述逆轉(zhuǎn)錄酶及逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液符合使用要求。表2上表1-2中的陰性對照，亦即陰性質(zhì)控品，nanodrop檢測的濃度≥90ng/ul，純度：od260/280在1.6-2.0之間，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小在200bp以上，proton測序結(jié)果不存在本發(fā)明試劑盒要檢測的基因位點突變，符合作為陰性對照的要求。上表1-2中的rna陽性對照，亦即rna陽性質(zhì)控品，含有本發(fā)明試劑盒要檢測的基因融合位點，符合作為rna陽性對照的要求。上表1-2中的dna陽性對照，亦即dna陽性質(zhì)控品，含有本發(fā)明試劑盒要檢測的基因突變類型，符合作為dna陽性對照的要求。上表1-2中，hifipcr混合液和hifi酶混合液用于對常規(guī)模板和高難度模板進(jìn)行超高保真擴(kuò)增，hifipcr混合液，功能同ionampliseqtmhifimastermix，通過多重pcr獲得目標(biāo)產(chǎn)物；hifi酶混合液，功能同kapahifi高保真dna聚合酶。上表1-2中，fupa試劑用于對dna片段進(jìn)行消化，功能同fupareagent。二、上述試劑盒的使用方法，可包括如下步驟：(1)獲取樣本核酸，所述核酸是dna或rna，若核酸為rna則先將其進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cdna；(2)制備基因文庫：1)多重pcr：將步驟(1)所獲得的dna采用包括dnapcr引物混合液的pcr反應(yīng)體系進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得dnapcr擴(kuò)增產(chǎn)物；將步驟(1)所獲得的cdna采用包括rnapcr引物混合液的pcr反應(yīng)體系進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得cdnapcr擴(kuò)增產(chǎn)物；2)消化部分引物序列：將步驟1)所獲得的dnapcr擴(kuò)增產(chǎn)物和cdnapcr擴(kuò)增產(chǎn)物，采用fupa試劑消化，獲得消化后的目標(biāo)產(chǎn)物；3)連接接頭和標(biāo)簽：接下來將經(jīng)過fupa試劑消化的目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行連接接頭和標(biāo)簽；4)片段篩選：接下來采用磁珠進(jìn)行純化做核酸片段篩選得到片段集中的dna，將hifi酶混合液和文庫引物混合液混合均勻，進(jìn)行洗脫；5)文庫擴(kuò)增：接下來將連接了接頭和標(biāo)簽的dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增；6)文庫片段選擇：將pcr擴(kuò)增后的產(chǎn)物采用磁珠進(jìn)行純化做核酸片段篩，獲得基因文庫。然后可進(jìn)行文庫檢測：用q-pcr檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度，當(dāng)文庫濃度高于proton上機(jī)濃度(6pm)時，即可用于ionprotontm測序平臺。三、試劑盒的使用性能評估試驗：1、最低檢測限方案13份dna陽性參考品樣本，用野生型樣本將其突變頻率稀釋至檢測限附近，制備基因文庫，proton上機(jī)測序；1份rna陽性參考品樣本，用野生型樣本將其cp100k稀釋至檢測限附近，制備基因文庫，proton上機(jī)測序。判斷標(biāo)準(zhǔn)：高于檢測限的突變或融合應(yīng)全部檢測到。dnapcr引物的最低檢出限(為0.05)結(jié)果如表4所示：表4rnapcr引物的最低檢出限(為25)結(jié)果如表5所示：表5基因位點cp100k檢測結(jié)果alkeml4(13)-alk(20)162陽性2、重復(fù)性評估方案2.1dnapcr引物檢測：選取2種突變類型，即egfr(c.2236-2250del15p.e746_a750delelrea)以及egfr(c.2573t>gp.l858r)，無核酸酶水稀釋至相同濃度，等質(zhì)量混合參照建庫試劑盒成品檢。混合后的樣本，2個實驗操作人員連續(xù)10天，分別重復(fù)建庫10次，分別在2臺proton上機(jī)測序。判斷標(biāo)準(zhǔn)：測序結(jié)果中每個突變都應(yīng)檢測到。dnapcr引物的重復(fù)性：表62.2rnapcr引物檢測：選取突變類型eml4(13)-alk(20)，2個實驗操作人員連續(xù)10天，分別重復(fù)建庫10次，分別在2臺proton上機(jī)測序。判斷標(biāo)準(zhǔn)：測序結(jié)果中每個突變都應(yīng)檢測到。rnapcr引物重復(fù)性：表73、陰陽質(zhì)控品：dna和rna陰陽質(zhì)控品各檢測一次，一次proton上機(jī)測序判斷標(biāo)準(zhǔn)：測序結(jié)果與原有結(jié)果一致。結(jié)果：測序結(jié)果均與原有結(jié)果一致。4、特異性：10份dna陰性樣本和10份rna陰性樣本，按照sop分別建庫一次，一次proton上機(jī)測序。判斷標(biāo)準(zhǔn)：要求測序結(jié)果均為陰性。結(jié)果：測序結(jié)果均為陰性。5、陽性符合率：13份dna陽性樣本和1份rna陽性樣本，按照sop分別建庫一次，一次proton上機(jī)測序。判斷標(biāo)準(zhǔn)：要求測序結(jié)果均為陽性。dnapcr引物陽性符合率為100％：表8rnapcr引物陽性符合率為100％：表9綜上所述，本發(fā)明的人類多基因突變檢測試劑盒(高通量測序法)靈敏度高，特異性高，重復(fù)性好，準(zhǔn)確率及陽性符合率均高達(dá)100％。以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實施例，并非對本發(fā)明任何形式上和實質(zhì)上的限制，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還將可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，當(dāng)可利用以上所揭示的技術(shù)內(nèi)容而做出的些許更動、修飾與演變的等同變化，均為本發(fā)明的等效實施例；同時，凡依據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)技術(shù)對上述實施例所作的任何等同變化的更動、修飾與演變，均仍屬于本發(fā)明的技術(shù)方案的范圍內(nèi)。sequencelisting<110>上海鹍遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司<120>人類多基因突變檢測試劑盒（高通量測序法）<130>172305<160>12<170>patentinversion3.3<210>1<211>29<212>dna<213>artificial<220><223>kras基因突變檢測正向引物<400>1tacctctattgttggatcatattcgtcca29<210>2<211>30<212>dna<213>artificial<220><223>kras基因突變檢測反向引物<400>2tattataaggcctgctgaaaatgactgaat30<210>3<211>22<212>dna<213>artificial<220><223>egfr基因突變檢測第一檢測引物對正向引物<400>3gccaggaacgtactggtgaaaa22<210>4<211>24<212>dna<213>artificial<220><223>egfr基因突變檢測第一檢測引物對反向引物<400>4tgacctaaagccacctccttactt24<210>5<211>26<212>dna<213>artificial<220><223>egfr基因突變檢測第二檢測引物對正向引物<400>5taacgtcttccttctctctctgtcat26<210>6<211>25<212>dna<213>artificial<220><223>egfr基因突變檢測第二檢測引物對反向引物<400>6agcagaaactcacatcgaggatttc25<210>7<211>22<212>dna<213>artificial<220><223>egfr基因突變檢測第三檢測引物對正向引物<400>7tcttacacccagtggagaagct22<210>8<211>23<212>dna<213>artificial<220><223>egfr基因突變檢測第三檢測引物對反向引物<400>8tgtgccagggaccttaccttata23<210>9<211>19<212>dna<213>artificial<220><223>egfr基因突變檢測第三檢測引物對正向引物<400>9gaagcctacgtgatggcca19<210>10<211>22<212>dna<213>artificial<220><223>egfr基因突變檢測第三檢測引物對反向引物<400>10ttgtctttgtgttcccggacat22<210>11<211>27<212>dna<213>artificial<220><223>alk基因融合檢測引物對正向引物<400>11cctgggaaaggacctaaaggtgtatat27<210>12<211>22<212>dna<213>artificial<220><223>alk基因融合檢測引物對反向引物<400>12ccgaatgagggtgatgtttttc22當(dāng)前第1頁12