一種食品中小分子化合物elisa檢測試劑盒的評價(jià)方法
【專利摘要】本發(fā)明公布一種食品中農(nóng)獸藥殘留、添加劑等小分子化合物ELISA檢測試劑盒的評價(jià)方法。其特征在于：通過線性驗(yàn)證、選擇性驗(yàn)證、基體適用性試驗(yàn)、耐變性評價(jià)、批間變異與穩(wěn)定性評價(jià)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室內(nèi)實(shí)驗(yàn)；通過準(zhǔn)確度驗(yàn)證，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室間協(xié)同實(shí)驗(yàn)。其中，核心的基體適用性實(shí)驗(yàn)步驟包括：確定適用的基體范圍、準(zhǔn)確度驗(yàn)證、偏離計(jì)算、重復(fù)性評價(jià)、檢測限和定量限確證。該方法結(jié)合室內(nèi)驗(yàn)證與室間協(xié)同實(shí)驗(yàn)兩個(gè)單元，能對商品化ELISA檢測試劑盒進(jìn)行較為準(zhǔn)確的評價(jià)。
【專利說明】—種食品中小分子化合物ELISA檢測試劑盒的評價(jià)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種ELISA檢測試劑盒的評價(jià)技術(shù)，尤其涉及一種食品中農(nóng)獸藥殘留、添加劑等小分子化合物ELISA檢測試劑盒質(zhì)量評價(jià)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]試劑盒在分析檢測工作中主要是作為一種快速篩查的方法而存在，開始的時(shí)候是以傳統(tǒng)經(jīng)典方法的替代方法出現(xiàn)的，幾乎所有的試劑盒方法在發(fā)現(xiàn)問題時(shí)都需要以傳統(tǒng)的檢測方法作為最終確認(rèn)的依據(jù)(尤其是在食品理化及微生物檢測中更是如此)，因此，人們大多認(rèn)同試劑盒方法的一些方法學(xué)上的不穩(wěn)定性，比如假陽性率、假陰性率、定量精密度較差等等，并接受了這種可能的結(jié)果錯(cuò)誤。而恰恰是這種認(rèn)同使得人們忽視了對試劑盒方法進(jìn)行更為科學(xué)深入的方法學(xué)性能指標(biāo)探討，而這種忽視在一些敏感領(lǐng)域的分析中是十分危險(xiǎn)的。
[0003]目前，商品化試劑盒比較適合企業(yè)生產(chǎn)控制或執(zhí)法現(xiàn)場檢測，因其操作方便，結(jié)果可快速獲得。但試劑盒的生產(chǎn)、銷售及認(rèn)證認(rèn)可體制尚不完善，沒有相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)或質(zhì)量評價(jià)政策。且其靈敏度，穩(wěn)定性及假陰/陽性控制尚不能滿足檢測需要。一方面是試劑盒的發(fā)展向好，而另一方而試劑盒存在的問題也愈來愈突出，尤其是許多國產(chǎn)試劑盒存在的質(zhì)量問題限制了其發(fā)展。實(shí)驗(yàn)室檢測人員尤其是企業(yè)實(shí)驗(yàn)室人員希望國家對試劑盒生產(chǎn)廠家進(jìn)行管理，并對其產(chǎn)品進(jìn)行驗(yàn)證，使購買者有信心使用國產(chǎn)檢測試劑盒，
[0004]正是基于目前試劑盒產(chǎn)品的現(xiàn)狀，需要對試劑盒進(jìn)行規(guī)范管理，以保證市場上流通的試劑盒性能指標(biāo)滿足相關(guān)要求。
[0005]目前我國尚未有針對試劑盒的完整評價(jià)體系，食品安全領(lǐng)域是當(dāng)前問題最多、最受關(guān)注的領(lǐng)域，這個(gè)領(lǐng)域的檢測包括了物理、化學(xué)、微生物及分子生物學(xué)基礎(chǔ)理論，無論是按檢測原理、用途還是其它分類方式，涉及食品安全檢測項(xiàng)目的試劑盒的品種是最全最多的。因此，從該領(lǐng)域著手從事評價(jià)制度的研究，便于獲得基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)結(jié)果。
[0006]國外自20世紀(jì)80年代末起就開始了對試劑盒的評價(jià)工作，取得了相當(dāng)大的進(jìn)展，獲得了良好的效果。但出于種種原因，幾乎現(xiàn)所有的評價(jià)體系都存在一些缺陷。最為關(guān)鍵的就是由于試劑盒品種繁多，事實(shí)上“試劑盒”這個(gè)術(shù)語至今沒有規(guī)范的定義，在市場上銷售的稱之為“試劑盒”的產(chǎn)品各式各樣，而不同的試劑盒檢測原理差異懸殊，使得在構(gòu)建評價(jià)體系的技術(shù)法規(guī)時(shí)存在相當(dāng)大的技術(shù)難度，迄今為止，國內(nèi)尚未開展對試劑盒的管理規(guī)范工作，而國外官方僅采用直接注冊進(jìn)行管理，國際上最為成功的評定機(jī)構(gòu)之一 AFNOR僅對微生物檢測用試劑盒進(jìn)行評價(jià)，依據(jù)是IS016140《食品和動(dòng)物飼料的微生物學(xué)替代檢測方法驗(yàn)證準(zhǔn)則》，而另一影響廣泛的機(jī)構(gòu)AOAC更多地依靠技術(shù)專家的力量，以專家小組來決定需要驗(yàn)證的技術(shù)指標(biāo)。
[0007]鑒于目前國內(nèi)外對可供借鑒的成熟的評價(jià)制度方案不多，而試劑盒本身的性質(zhì)也使其不能直接照搬其他產(chǎn)品的評價(jià)方案和技術(shù)，同時(shí)，各種復(fù)雜的食品基質(zhì)會引起諸多干擾因素，因此如何準(zhǔn)確評價(jià)食品中小分子化合物ELISA檢測試劑盒的評價(jià)有相當(dāng)大的技術(shù)難度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一種食品中農(nóng)獸藥殘留、添加劑等小分子化合物ELISA檢測試劑盒的評價(jià)方法，以對待評價(jià)的商品化ELISA試劑盒作為更為準(zhǔn)確的評價(jià)。
[0009]本發(fā)明的評價(jià)方法，其特征在于包括:通過結(jié)合室內(nèi)驗(yàn)證與室間協(xié)同實(shí)驗(yàn)兩個(gè)評價(jià)單元，根據(jù)待評價(jià)試劑盒說明書提取特征參數(shù)設(shè)計(jì)評價(jià)指標(biāo)，構(gòu)架評價(jià)單元內(nèi)各評價(jià)指標(biāo)的計(jì)算模型，對食品中小分子化合物ELISA商品化試劑盒進(jìn)行較為準(zhǔn)確的評價(jià)。
[0010]實(shí)驗(yàn)室內(nèi)測試實(shí)驗(yàn)，包括:
[0011]線性驗(yàn)證，用于尋找非隨機(jī)模型，消除或降低潛在的關(guān)鍵變異；
[0012]選擇性驗(yàn)證，用于評價(jià)同類藥物的交叉反應(yīng)以及不同基體的交叉反應(yīng)；
[0013]基體適用性試驗(yàn)，用于評價(jià)對于不同食品基質(zhì)，待評價(jià)試劑盒的準(zhǔn)確度、重現(xiàn)性、檢測限、定量限；
[0014]耐變性試驗(yàn)，包括確定測試樣品和數(shù)量，選擇需要評價(jià)的耐變因素。用于評價(jià)可能影響檢測結(jié)果的因素；
[0015]批間變異與穩(wěn)定性，用于評價(jià)待評價(jià)試劑盒的產(chǎn)品穩(wěn)定性。
[0016]其中，核心的基體適用性試驗(yàn)步驟包括:確定適用的基體范圍、準(zhǔn)確度驗(yàn)證、偏離計(jì)算、重復(fù)性評價(jià)、檢測限和定量限確證。
[0017]實(shí)驗(yàn)室間協(xié)同實(shí)驗(yàn)，包括:
[0018]準(zhǔn)確度驗(yàn)證，用于評價(jià)在不同實(shí)驗(yàn)室、不同操作人員情況下，待評價(jià)試劑盒的準(zhǔn)確度。
[0019]采用該評價(jià)方法，能夠?qū)Υu價(jià)的商品化ELISA檢測試劑盒作出較為準(zhǔn)確的評價(jià)。
【具體實(shí)施方式】
[0020]本發(fā)明的評價(jià)步驟如下:
[0021](一)室內(nèi)驗(yàn)證單元
[0022]1、線性驗(yàn)證
[0023]用試劑盒提供的樣品稀釋液分別配制包括Oyg / L在內(nèi)的6個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度水平涵蓋試劑盒說明書提供的線性范圍，每個(gè)濃度水平分3天、每天2平行共檢測6平行，以響應(yīng)信號對濃度作圖，列出回歸方程，并進(jìn)行回歸分析。計(jì)算差值(實(shí)際信號響應(yīng)值與曲線圖示值之間的差)，并以差值(Y軸)對濃度(X軸)做圖，尋找非隨機(jī)模型；如果發(fā)現(xiàn)存在潛在的關(guān)鍵變異，需要建立模型以降低或消除，直到僅余隨機(jī)噪音值。其中，測試數(shù)量:
[0024]6個(gè)濃度水平X 2平行X 3次重復(fù)(3天)=36個(gè)(0D值)
[0025]2、選擇性驗(yàn)證
[0026]2.1同類藥物的選擇性
[0027]配制5個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度水平涵蓋且大于試劑盒說明書提供的線性范圍。對照組為不加任何藥物的空白溶液(試劑盒中提供的樣品稀釋液)，其信號響應(yīng)值(三次測定平均值)記為B。，不同濃度的三聚氰胺所得的信號響應(yīng)值(三次測定平均值)為B，以藥物濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)，B / BciXlOO1^為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得直線回歸方程和IC5(I(50%抑制濃度)值。同樣方法配制至少五種同類類似物的標(biāo)準(zhǔn)溶液并按上述步驟測定其標(biāo)準(zhǔn)曲線和IC5tl值。各藥物的交叉反應(yīng)率計(jì)算公式如下:
[0028]交叉反應(yīng)率=IC5tl (待測目標(biāo)物)/ IC50 (同類類似物)X 100 %
[0029]2.2基體的選擇性
[0030]配制5個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度水平與線性驗(yàn)證時(shí)使用的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度相同(不包括Oyg / L在內(nèi))。對照組為不加任何藥物的空白溶液，其信號響應(yīng)值(三次測定平均值)記為B。，不同濃度的三聚氰胺所得的信號響應(yīng)值(三次測定平均值)為B，以藥物濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)，B / BtlX 100%為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得直線回歸方程和IC5tl(50%抑制濃度)值。分別以不含待測目標(biāo)物的的其他適用基體按說明書所述步驟進(jìn)行樣品前處理，所得溶液用以配制待測目標(biāo)物基體標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度水平與線性驗(yàn)證時(shí)使用的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度相同(不包括O μ g/L在內(nèi))，并按上述步驟測定其標(biāo)準(zhǔn)曲線和IC5tl值。各基體間的交叉反應(yīng)率計(jì)算公式如下:
[0031]交叉反應(yīng)率=IC5tl(空白試劑配制的待測目標(biāo)物溶液)/ IC5tl (各基體配制的待測目標(biāo)物溶液)X100%。
[0032]3、基體試驗(yàn)
[0033]3.1基體適用性試 驗(yàn)
[0034]根據(jù)試劑盒使用說明書，任意選擇2種基質(zhì)。
[0035]3.2準(zhǔn)確度/回收率試驗(yàn)
[0036]選擇樣品基體時(shí)盡可能采用本身含有分析物的樣品基體，在不能獲得時(shí)，可選擇人工加標(biāo)方式進(jìn)行制備。分析物的濃度應(yīng)涵蓋試劑盒檢測方法給出的濃度范圍。在人工加標(biāo)時(shí)，對于液體樣品，選擇在大體積樣品中添加加標(biāo)液后混勻；對于濕潤的樣品，選擇在大量樣品中滴加加標(biāo)液，混勻并均質(zhì)；對于干樣，選擇在基體中添加干燥的加標(biāo)物，混勻。在加標(biāo)過程中應(yīng)保證樣品基體的完好，同時(shí)須保證基體未在加標(biāo)過程中被稀釋。
[0037]采用基體加標(biāo)進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，對6個(gè)濃度水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，濃度水平與線性驗(yàn)證時(shí)使用的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度相同(包括陰性樣品在內(nèi))。每個(gè)濃度水平8平行。
[0038]3.3 偏離
[0039]偏離指采用試劑盒方法進(jìn)行檢測的結(jié)果與真值之間的差異。
[0040]偏差=檢測濃度平均值-真值
[0041]相對偏差=偏差/真值
[0042]3.4重復(fù)性
[0043]同一操作人員在短時(shí)間內(nèi)用同樣儀器在同一實(shí)驗(yàn)室內(nèi)采用相同的方法進(jìn)行獨(dú)立檢測所得到的數(shù)據(jù)。根據(jù)3.2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算。
[0044]重復(fù)性以標(biāo)準(zhǔn)偏差Sr和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSDr表不。
[0045]3.5檢測限LOD和定量限LOQ
[0046]對于每種基體，以&對檢測結(jié)果的平均值作圖，公式見下:
[0047]LOD = — + 3(-S^，其中-為未加標(biāo)樣品重復(fù)測定值，Sb為截距，m為斜率，
l~1.65mXoL0Q=3XLOD
[0048]上述公式計(jì)算出的LOD值屬于理論值，尚需要以下方式進(jìn)行實(shí)際樣品驗(yàn)證:
[0049](I)LOD的試驗(yàn)驗(yàn)證
[0050]以理論LOD值濃度為基礎(chǔ)，制備20個(gè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或加標(biāo)樣品，當(dāng)檢出概率為95%時(shí)(即有19個(gè)樣品為陽性，I個(gè)樣品為陰性)，則該濃度為95%置信度時(shí)的L0D。對于禁用藥物而言，一般要求LOD的置信度為99%，L0D99%=L0D95%+1.64S，式中L0D95%為95%置信度時(shí)的檢出限，L0D99%為99%置信度時(shí)的檢出限，S為20個(gè)樣品測定濃度值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。
[0051](2) LOQ的試驗(yàn)驗(yàn)證
[0052]對于LOQ值不用計(jì)算，直接采用試劑盒說明書標(biāo)識的LOQ值進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證即可，SP制備20個(gè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或加標(biāo)樣品，經(jīng)樣品分析后，按照回歸方程計(jì)算出每個(gè)樣品的濃度值、平均濃度值、偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差，若在該濃度水平的檢測準(zhǔn)確度和精密度滿足試劑盒說明書的標(biāo)識值即可。
[0053]4.耐變性
[0054]耐變性評價(jià)由以下步驟組成:確定可能影響檢測結(jié)果的因素、對每一種因素稍作改變、采用合適的方法進(jìn)行耐變性檢驗(yàn)、若發(fā)現(xiàn)某種因素可顯著影響檢測結(jié)果，應(yīng)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)以確定該因素可接受的水平、在檢測方法中應(yīng)清楚說明可顯著影響檢測結(jié)果的因素。舉例如表1所示:
[0055](I)測試樣品和數(shù)量
[0056]選用I種測試基質(zhì)，添加濃度大于等于最低檢測限，每種測試條件8平行。
[0057](2)耐變因素選擇
[0058]確定需要評價(jià)的變量4個(gè)(A、B、C、D)，每個(gè)變量取兩個(gè)不同的水平(如A、a)。
[0059]表1耐變性試驗(yàn)方法
[0060]
【權(quán)利要求】
1.一種食品中農(nóng)獸藥殘留、添加劑等小分子化合物ELISA檢測試劑盒的評價(jià)方法，其特征在于:通過線性驗(yàn)證、選擇性驗(yàn)證、基質(zhì)適用性實(shí)驗(yàn)、耐變性考察、批間變異與穩(wěn)定性考察，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室內(nèi)測試實(shí)驗(yàn)；通過準(zhǔn)確度驗(yàn)證，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室間協(xié)同實(shí)驗(yàn)，以評價(jià)試劑盒的技術(shù)性能。 所述基質(zhì)適用性實(shí)驗(yàn)包括以下步驟: (1)確定適用的基質(zhì)范圍:任意選取兩種適用基質(zhì)； (2)準(zhǔn)確度驗(yàn)證:采用基質(zhì)加標(biāo)進(jìn)行準(zhǔn)確度檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)，配制包括陰性樣品在內(nèi)的6個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度水平涵蓋線性范圍，每個(gè)濃度水平做8次平行測定，以響應(yīng)信號對濃度作圖，列出回歸方程并進(jìn)行回歸分析； (3)偏離程度計(jì)算:用偏差表示偏離程度，計(jì)算公式為:偏差=檢測濃度平均值添加濃度值，相對偏差=偏差/添加濃度值； (4)重復(fù)性:根據(jù)準(zhǔn)確度試驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差； (5)檢測限和定量限計(jì)算:以標(biāo)準(zhǔn)偏差對檢測結(jié)果的平均值作圖，檢測限二土十3以)，其中-為未加標(biāo)樣品重復(fù)測定值，Sb為截距，m為斜率，定量限
I — 1.65/77X ο=3XLOD ； (6)檢測限的試驗(yàn)驗(yàn)證:向陰性試樣中添加如步驟(5)計(jì)算所得檢測限水平的待測小分子化合物，制備大于等于20個(gè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或加標(biāo)樣品，檢出概率=檢出樣品/制備樣品X 100%，當(dāng)檢出概率大于或等于95%時(shí)，表明待評價(jià)試劑盒在95%置信度下的檢測限滿足要求； (7)定量限的試驗(yàn)驗(yàn)證:定量限直接采用試劑盒說明書標(biāo)識的定量限進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證。
【文檔編號】G01N33/53GK103575873SQ201310385434
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年8月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月30日
【發(fā)明者】鄒明強(qiáng), 王燕飛, 薛強(qiáng) 申請人:中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院