一種檢測食品中狗源性成分的試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及食品檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及檢測食品中狗源性成分的試劑盒及 其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 動物源性食品在人們?nèi)粘Ｉ攀持械谋壤鸩皆龃?，各種冷鮮肉、精深加工的半成 品肉、熟肉制品等消費(fèi)比例逐年上升。但不同物種的肉品質(zhì)和價(jià)格存在很大差異，給摻雜摻 假創(chuàng)造了極大的利潤空間為了謀取經(jīng)濟(jì)利益，有些不法企業(yè)和商販在肉制品中使用低成本 肉代替高價(jià)位肉的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。這不僅嚴(yán)重侵害了消費(fèi)者的健康和權(quán)益，還會涉及宗教 信仰，導(dǎo)致民族問題，同時(shí)直接影響到國家的形象，社會的和諧發(fā)展以及政府的公信力。
[0003] 狗肉作為中華飲食中一種傳統(tǒng)肉食來源在近年來收到了很大的關(guān)注，一些寵物狗 被宰殺混入肉制品中，引起了社會的廣泛關(guān)注。因此，研宄出一種準(zhǔn)確、快速、可靠地鑒別一 種快速準(zhǔn)確的檢測狗源性成分的方法就非常有必要。
[0004] 隨著分子生物學(xué)方法在食品檢驗(yàn)中的應(yīng)用不斷深入，食品中動物源性成分的鑒別 技術(shù)也在不斷發(fā)展，鑒別精度和檢測靈敏度的不斷提高，目前已初步形成了以基因檢測為 基礎(chǔ)的方法體系。以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)為基礎(chǔ)的技術(shù)已成為食品中動物源性成分鑒定 的核心方法。物種特異性PCR根據(jù)不同物種基因序列的差異位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物，利用PCR 反應(yīng)實(shí)現(xiàn)動物源性成分特征基因片段的指數(shù)級擴(kuò)增，繼而通過電泳檢測鑒別可能的物種成 分。多重PCR能夠?qū)崿F(xiàn)混合物中多個(gè)物種同時(shí)檢測。近年來，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)是動物源 性成分檢測中研宄最多的方法，與普通PCR相比，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重現(xiàn)性好、有效 降低污染等優(yōu)點(diǎn)。
[0005] 哺乳動物線粒體DNA(mtDNA)在遺傳上相對獨(dú)立，具有基因組小、沒有重復(fù)序列、 生物個(gè)體內(nèi)無組織特異性、每個(gè)細(xì)胞中含有大量線粒體基因組等特點(diǎn)。因此，用mtDNA分子 標(biāo)記鑒別動物源性成分與核DNA分子標(biāo)記相比，具有靈敏度高、精確度好、DNA降解小等優(yōu) 勢。基于動物線粒體DNA的熒光PCR檢測技術(shù)在動物源性成分鑒別中具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0006] 目前，根據(jù)線粒體基因組DNA序列差異設(shè)計(jì)物種特異性引物，建立PCR與實(shí)時(shí)熒光 PCR方法已見大量報(bào)道，然而，針對狗源性成分檢測的熒光PCR方法尚未見報(bào)導(dǎo)。因此，建立 動物源性產(chǎn)品中狗源性成分實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法，對提高突發(fā)事件應(yīng)急處理能力，提升 食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測水平和監(jiān)管能力具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種檢測食品中狗源性成分的試劑盒及其應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明首先提供用于檢測食品中狗源性成分的引物對以及熒光探針，其核苷酸序 列分別如SEQ ID NO. 1-3所示。
[0009] 本發(fā)明提供了上述引物對和熒光探針在檢測食品中狗源性成分中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明提供了上述引物對和熒光探針在制備檢測食品中狗源性成分試劑盒中的 應(yīng)用。
[0011] 含有本發(fā)明引物對和熒光探針的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的試劑 盒可以是由多個(gè)隔斷所形成，以容納固定一個(gè)或多個(gè)如管或小瓶的容器。這些容器之一或 者多個(gè)可以裝有本發(fā)明的引物以及熒光探針，根據(jù)需要該引物和熒光探針可以是凍干形式 或溶于緩沖液中的狀態(tài)。另外，本發(fā)明的試劑盒中還可以包括用于熒光定量PCR反應(yīng)的一 種或多種酶/試劑，以及實(shí)施本發(fā)明所需要的其它成分及用具，例如DNA裂解液、熒光定量 反應(yīng)液、陰性模板、陽性模板，所述陰性模板為雙蒸水，所述陽性模板為狗基因組DNA。
[0012] 進(jìn)一步地，本發(fā)明的試劑盒其20 UL工作體系為：
[0013] 試劑 體積JiL濃度 GoTaqR qPC'R Master Mix 10.0 2 χ 上游引物 0.5 10 μΜ 下游引物 05 10 μΜ 探針 1.0 10 μΜ DNA 模板 1.0 0.1 pg'μ? ~ 0.5 叫/uL. 去離子水 7.0
[0014] 本發(fā)明試劑盒的工作程序?yàn)椋侯A(yù)變性95°C IOmin ;再經(jīng)95°C變性15s，60°C退火 lmin，40個(gè)循環(huán)。
[0015] 本發(fā)明每次檢測標(biāo)本時(shí)須設(shè)立陰性對照和陽性對照，在檢測中兩種對照為有效擴(kuò) 增時(shí)，樣本結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：
[0016] Ct值〈35. 0時(shí)樣品結(jié)果為陽性；
[0017] Ct值彡35. 0的樣品結(jié)果為陰性。
[0018] 本發(fā)明提供了一種檢測食品中狗源性成分的方法，該方法以蛋白酶K消化法提取 的食品中DNA，以其為模板，利用本發(fā)明提供的引物對和熒光探針進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增， 根據(jù)Ct值判定結(jié)果。
[0019] 含有本發(fā)明引物對和探針的診斷試劑也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0020] 本發(fā)明試劑盒特異性好，檢測方法快速簡單，準(zhǔn)確性高，靈敏度好，為食品中狗源 性成分的檢測提供了新的方法。本發(fā)明所述的熒光RCR技術(shù)可以準(zhǔn)確快速的實(shí)現(xiàn)對食品中 狗源性成分的鑒別檢測，可在Ih?2h內(nèi)完成，具有快速、特異、敏感、高通量等優(yōu)點(diǎn)，最低檢 測限約為l〇〇fg，具有良好的檢測食品中源性成分的能力，能有效抵御肉制品摻假，加大對 消費(fèi)者利益的保護(hù)力度。
【附圖說明】
[0021] 圖1為本發(fā)明檢測食品中狗源性成分的熒光定量PCR方法的特異性驗(yàn)證結(jié)果，應(yīng) 用本發(fā)明的方法僅對狗DNA有陽性擴(kuò)增，其他24個(gè)物種的DNA檢測均為陰性。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神 和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0023] 若未特別指明，實(shí)施例中所用的化學(xué)試劑均為常規(guī)市售試劑，實(shí)施例中所用的技 術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0024] 實(shí)施例1引物的設(shè)計(jì)
[0025] 經(jīng)大量比對GenBank中狗的ND 2基因，選取ND 2基因高度保守且具有物種特異 性基因序列為模板，設(shè)計(jì)狗ND 2特異性上下游引物和Taqman探針，上下游引物長度分別為 19bp和25bp的核苷酸，探針長度為28bp的核苷酸，并在5'端標(biāo)記上FAM熒光基團(tuán)，3'端 標(biāo)記上TAMRA淬滅基團(tuán)，序列如下：
[0026] 上游引物：5'-CTCCGGCCAATGGGTAATC-3' (SEQ ID NO. 1)
[0027] 下游引物：5'-GAAGTGGAATGGAGATAGGCCTAGT-3' (SEQ ID NO. 2)
[0028] 熒光探針：5'-FAM-TCAAACCCCATCGCATCCATCATGATAA-TAMRA-3' (SEQ ID NO. 3)
[0029] 實(shí)施例2熒光定量PCR檢測方法的建立
[0030] 1、提取樣品DNA
[0031] (1)取狗肉樣本0. 2g，盡量剪碎。置于I. 5ml離心管中加入Iml的細(xì)胞裂解緩沖 液，20 μ 1蛋白酶Κ(500 μ g/ml)，混勻。在65°C恒溫水浴鍋中水浴30min，間歇振蕩離心管 數(shù)次。于臺式離心機(jī)以12, OOOrpm離心5min，取上清液入另一離心管中。
[0032] (2)加入等體積的苯酷：氯仿混合液（I: 1)，振蕩混勾，12, OOOrpm離心lOmin。
[0033] (3)取上清液至另一管，加入等體積的氯仿，振蕩混勾，12, OOOrpm離心lOmin。
[0034] (4)取上清液至另一管，加入1/10體積的3mol/L乙酸鈉和2倍體積的無水乙醇， 混勾后室溫沉淀l〇min，12, OOOrpm離心10min。
[0035] (5)棄上清，用Iml 75%乙醇洗絳沉淀，12, OOOrpm離心5min。
[0036] (6)重復(fù)步驟5。
[0037] (7)棄上清，將沉淀至室溫干燥5min。
[0038] (8)加50 μ I TE或dd H2O溶解沉淀，然后置于4°C或-20 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0039] 2、采用實(shí)施例1的引物和探針，上述提取得到的狗DNA為模板，以狗基因組DNA為 陽性對照，以無核酸雙蒸水為陰性對照，建立熒光定量PCR檢測體系。
[0040] 其20 μ L總工作體系為：
[0041] 試劑 體積μ?濃度 GoTaqu qPCR Master Mix 10.0 2 x 上游引物 0.5 10 μΜ 下游引物 0.5 10 μΜ 探針 1.0 10 μΜ DNA 模板 1,0 0.1 pg /pL ~ 0.5 pg /叫 去離子水 7.0
[0042] 其工作程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性10min，l個(gè)循環(huán)；95°C變性15sec，60°C退火lmin，40 個(gè)循環(huán)。
[0043] 擴(kuò)增結(jié)束后，扣除本底熒光信號后取同一閾值分析數(shù)據(jù)，確定各樣本的Ct值。
[0044] 每次檢測標(biāo)本時(shí)須設(shè)立陰性對照和陽性對照，在檢測中兩種對照為有效擴(kuò)增時(shí)， 樣本結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：
[0045] Ct值〈35. 0時(shí)樣品結(jié)果為陽性；
[0046] Ct值彡35. 0的樣品結(jié)果為陰性。
[0047] 實(shí)施例3特異性試驗(yàn)
[0048] 為驗(yàn)證本試劑盒的特異性，以家犬基因組DNA為陽性對照，以豬，牛，綿羊，山羊， 雞，鴨，鶴子，火雞，鶴鶴，能鳥，灰雁，貓，小鼠，狍子，馬，驢，狐貍，駱蛇，三文魚J盧魚，鯽魚， 梅花鹿，虹鱒魚，草魚。共24個(gè)物種為陰性對照，以dd H2O為空白對照，采用實(shí)施例2建立 熒光定量PCR檢測體系對上述25個(gè)物種進(jìn)行檢測。擴(kuò)增結(jié)束后，扣除本底熒光信號后取同 一閾值分析數(shù)據(jù)，確定各樣本的Ct值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1，表1，狗的Ct值為11. 19,顯示為陽 性結(jié)果，其余24個(gè)物種的CT值均大于35,顯示為陰性結(jié)果。說明該實(shí)驗(yàn)證明本試劑盒具有 良好的物種特異性。
[0049] 表1本發(fā)明方法對25種動物DNA的檢測結(jié)果
[0050]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 檢測食品中狗源性成分的引物對，其特征在于，所述引物對的核苷酸序列如SEQID NO. 1-2 所示。
2. 與權(quán)利要求1所述的引物對配合使用的熒光探針，其特征在于，熒光探針的核苷酸 序列如SEQIDNO. 3所示。
3. 權(quán)利要求1所述的引物對和權(quán)利要求2所述的熒光探針在檢測食品中狗源性成分中 的應(yīng)用。
4. 權(quán)利要求1所述的引物對和權(quán)利要求2所述的熒光探針在制備檢測食品中狗源性成 分試劑盒中的應(yīng)用。
5. -種檢測食品中狗源性成分試劑盒，其特征在于，含有權(quán)利要求1所述的引物對和 權(quán)利要求2所述的熒光探針。
6. 如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，還包括：DNA裂解液、熒光定量反應(yīng)液、陰 性模板、陽性模板，所述陰性模板為雙蒸水，所述陽性模板為狗基因組DNA。
7. 如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，其20yLPCR反應(yīng)體系為：
8. 如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，其工作程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性lOmin;95°C 變性15s，60°C退火lmin，40個(gè)循環(huán)。
9. 一種檢測食品中狗源性成分的方法，其特征在于，該方法以蛋白酶K消化法提取的 食品中DNA，以其為模板，利用權(quán)利要求1所述的引物對和權(quán)利要求2所述的熒光探針進(jìn)行 熒光定量PCR擴(kuò)增，根據(jù)Ct值判定結(jié)果。
10. 含有權(quán)利要求1所述的引物對和權(quán)利要求2所述的熒光探針的診斷試劑。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測食品中狗源性成分的試劑盒及其應(yīng)用，屬于食品檢測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒采用SEQ？ID？NO.1-2所示的引物和SEQ？ID？NO.3所示的熒光探針對待測食品進(jìn)行熒光定量PCR檢測，根據(jù)Ct值判斷食品中是否含有狗源性成分。本發(fā)明試劑盒具有檢測準(zhǔn)確，靈敏度高、特異性強(qiáng)，簡便快速的優(yōu)點(diǎn)，最低檢測限為100fg，具有良好的檢測食品中狗源性成分的能力，能有效抵御肉制品摻假，加大對消費(fèi)者利益的保護(hù)力度。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-68
【公開號】CN104561328
【申請?zhí)枴緾N201510024486
【發(fā)明人】楊昕霆, 薛晨玉, 趙琳娜, 王丹, 黃華, 暴瑞玲, 胡智愷, 宋麗萍, 毛婷, 杜建平
【申請人】北京市食品安全監(jiān)控和風(fēng)險(xiǎn)評估中心
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2015年1月16日