基于lspr檢測(cè)精子頂體酶活性的方法、試劑盒及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種基于LSPR檢測(cè)精子頂體酶活性的方法、試劑盒及其應(yīng)用。其中，該試劑盒包含：功能化納米金標(biāo)記精子頂體酶底物，包含納米金以及通過(guò)化學(xué)鍵合和/或物理吸附方式固定在納米金表面的精子頂體酶底物；以及，適于使所述精子頂體酶底物與精子頂體酶專一結(jié)合并進(jìn)行反應(yīng)的緩沖液。藉由本發(fā)明的試劑盒及檢測(cè)方法，能快速(約3分鐘左右)、可靠、靈敏且低成本的檢測(cè)精子頂體酶的活性。
【專利說(shuō)明】
基于LSPR檢測(cè)精子頂體酶活性的方法、試劑盒及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種精子頂體酶的活性評(píng)價(jià)方法，特別是一種基于納米金顆粒表面等離子共振(LSPR)檢測(cè)精子頂體酶活性的方法、試劑盒及其應(yīng)用，屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]頂體酶活性可反映精子質(zhì)量，頂體酶活力不足可能導(dǎo)致不育，是評(píng)價(jià)精子功能和生育力強(qiáng)弱的重要指標(biāo)，結(jié)合精液常規(guī)分析、精子形態(tài)染色等常規(guī)指標(biāo)，能更全面反映精子質(zhì)量。
[0003]頂體酶的檢測(cè)早期多利用頂體酶抗體進(jìn)行放射免疫法或熒光免疫法檢測(cè)，通過(guò)觀察精子頂體內(nèi)頂體酶的數(shù)量判斷精子受精能力。后來(lái)Kennedy等人首先報(bào)道了計(jì)算頂體酶水解底物效率的方法判斷精子頂體酶的活性，此方法首先將精子裂解，再將裂解液置于加入酶水解底物的檢測(cè)管中，通過(guò)觀察底物水解后的顯色深淺，計(jì)算吸光值檢測(cè)頂體酶的水解活力。此方法得出指標(biāo)更能反應(yīng)精子頂體酶的生理功能，現(xiàn)已成為標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法。
[0004]近年來(lái)又有學(xué)者根據(jù)精子頂體反應(yīng)更深入的認(rèn)識(shí)提出，精子頂體酶的活性應(yīng)由發(fā)生頂體反應(yīng)的精子判斷才更符合精子受精的實(shí)際生理過(guò)程。目前已有報(bào)道先進(jìn)性誘導(dǎo)頂體反應(yīng)，然后檢測(cè)發(fā)生頂體反應(yīng)后釋放出的頂體酶的活性，以此標(biāo)示整個(gè)精液樣本中精子群體的頂體酶活性。然而，目前的檢測(cè)方法需要借助復(fù)雜的儀器，檢測(cè)花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的主要目的在于提供一種基于納米金局域表面等離子共振檢測(cè)精子頂體酶活性的方法，其能實(shí)現(xiàn)對(duì)精子頂體酶快速、靈敏、實(shí)時(shí)檢測(cè)，從而克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0006]本發(fā)明的另一重要目的在于提供一種基于納米金局域表面等離子共振檢測(cè)精子頂體酶活性的試劑盒。
[0007]本發(fā)明的又一目的在于提供所述檢測(cè)方法及試劑盒的應(yīng)用。
[0008]為實(shí)現(xiàn)前述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案包括:
[0009]—種基于LSPR檢測(cè)精子頂體酶活性的試劑盒，其包含:
[0010]功能化納米金標(biāo)記精子頂體酶底物，包含納米金以及通過(guò)化學(xué)鍵合和/或物理吸附方式固定在納米金表面的精子頂體酶底物；
[0011]以及，適于使所述精子頂體酶底物與精子頂體酶專一結(jié)合并進(jìn)行反應(yīng)的緩沖液。
[0012]進(jìn)一步的，所述試劑盒還包含記載有所述試劑盒的使用方法的說(shuō)明書(shū)，所述使用方法包括:
[0013]測(cè)定主要由所述緩沖液和均勻分散在所述緩沖液內(nèi)的功能化納米金標(biāo)記精子頂體酶底物組成的混合溶液在300-1000nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收光譜，并記錄吸收峰對(duì)應(yīng)的吸收波長(zhǎng)入。；
[0014]在所述混合溶液中加入不同濃度Cn的精子頂體酶溶液，并分別測(cè)定在加入不同濃度的精子頂體酶標(biāo)準(zhǔn)溶液之后所獲的不同混合反應(yīng)體系在300-1000nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收光譜，記錄吸收峰對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)λ n和吸收峰值A(chǔ)n，波長(zhǎng)偏移值記為△ λη= λ η-λ。，吸收峰偏移值記為AAn= Αη_Α。，探知(；與Δ λ?；颚?An成正比，并由此建立精子頂體酶溶液濃度與波長(zhǎng)偏移值或吸收峰偏移值的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，其中η為大于或等于2的自然數(shù)；
[0015]以及，在所述混合溶液中加入未知濃度Cx的精子頂體酶溶液，并測(cè)定由此形成的混合反應(yīng)體系在300_1000nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收波長(zhǎng)λ x，波長(zhǎng)偏移值Δ λχ= λ χ-λ。或吸收峰偏移值A(chǔ)Ax= A Χ-Α。，并依據(jù)所述標(biāo)準(zhǔn)工作曲線而計(jì)算出Cx。
[0016]作為較佳實(shí)施方案之一，所述使用方法還可包括:控制所述混合溶液在300-1000nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收峰的峰值在0.6-0.8之間。
[0017]—種精子頂體酶活性的檢測(cè)裝置，其包含所述的試劑盒。
[0018]一種基于LSPR檢測(cè)精子頂體酶活性的檢測(cè)方法，其包含:
[0019]提供功能化納米金標(biāo)記精子頂體酶底物以及適于使所述精子頂體酶底物與精子頂體酶專一結(jié)合并進(jìn)行反應(yīng)的緩沖液，所述功能化納米金標(biāo)記精子頂體酶底物包含納米金以及通過(guò)化學(xué)鍵合和/或物理吸附方式固定在納米金表面的精子頂體酶底物；
[0020]測(cè)定主要由所述緩沖液和均勻分散在所述緩沖液內(nèi)的功能化納米金標(biāo)記精子頂體酶底物組成的混合溶液在300-1000nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收光譜，并記錄吸收峰對(duì)應(yīng)的吸收波長(zhǎng)入。；
[0021]在所述混合溶液中加入不同濃度Cn的精子頂體酶溶液，并分別測(cè)定在加入不同濃度的精子頂體酶標(biāo)準(zhǔn)溶液之后所獲的不同混合反應(yīng)體系在300-1000nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收光譜，記錄吸收峰對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)λ n和吸收峰值A(chǔ)n，波長(zhǎng)偏移值記為△ λη= λ η-λ。，吸收峰偏移值記為AAn= Αη_Α。，探知(；與Δ λ?；颚?An成正比，并由此建立精子頂體酶溶液濃度與波長(zhǎng)偏移值或吸收峰偏移值的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，其中η為大于或等于2的自然數(shù)；
[0022]以及，在所述混合溶液中加入未知濃度Cx的精子頂體酶溶液，并測(cè)定由此形成的混合反應(yīng)體系在300_1000nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收波長(zhǎng)λ x，波長(zhǎng)偏移值Δ λχ= λ χ-λ?；蛭辗迤浦礎(chǔ)Ax= A Χ-Α。，并依據(jù)所述標(biāo)準(zhǔn)工作曲線而計(jì)算出Cx。
[0023]作為較佳實(shí)施方案之一，所述檢測(cè)方法還可包括:控制所述混合溶液在300-1000nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收峰的峰值在0.6-0.8之間。
[0024]在本發(fā)明的一實(shí)施方案之中，所述精子頂體酶底物通過(guò)與修飾在納米金表面的選定官能團(tuán)發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)而固定連接到所述納米金表面。
[0025]其中，用于將納米金功能化從而提供與精子頂體酶底物偶聯(lián)的官能團(tuán)不限于某種特定的種類，本領(lǐng)域技術(shù)人員依據(jù)本說(shuō)明應(yīng)當(dāng)能夠很容易的理解，凡是能修飾在納米金表面并能與精子頂體酶底物作用的官能團(tuán)都是適用的，其中，所述官能團(tuán)末端的基團(tuán)可以是羧基、氨基或者其他活性基團(tuán)。
[0026]進(jìn)一步的，在本發(fā)明的一實(shí)施方案之中，所述功能化納米金標(biāo)記精子頂體酶底物的制備方法包括:
[0027]提供具有明顯紫外可見(jiàn)吸收光譜吸收峰的納米金，
[0028]通過(guò)化學(xué)或者物理方法在所述納米金表面修飾選定官能團(tuán)，
[0029]使所述精子頂體酶底物與所述選定官能團(tuán)進(jìn)行親合反應(yīng)而固定連接在所述納米金表面。
[0030]進(jìn)一步的，所述納米金的尺寸范圍為20m?150nm。
[0031]進(jìn)一步的，所述納米金包括納米金棒、納米金球或納米金立方塊，但不限于此。
[0032]優(yōu)選的，所述納米金棒的直徑約20nm，長(zhǎng)度為30nm?50nm，所述納米金球的粒徑約30?120nm，所述納米金立方塊的邊長(zhǎng)約1nm?lOOnm。
[0033]進(jìn)一步的，所述精子頂體酶底物可以是能與精子頂體酶反應(yīng)(例如水解)的任何合適種類，例如ZP3蛋白等。
[0034]進(jìn)一步的，所述緩沖液可以是PBS緩沖液等，其pH值優(yōu)選為7左右。
[0035]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果至少在于:
[0036](I)通過(guò)合理設(shè)計(jì)金納米的尺寸，納米金(例如金納米棒)的紫外可見(jiàn)吸收光譜在常規(guī)的紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)的測(cè)量范圍之內(nèi)，不需要使用特殊的紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)；
[0037](2)利用功能化物質(zhì)，特別是超支化高分子對(duì)納米金，例如金納米棒表面進(jìn)行修飾，可以為精子頂體酶底物提供結(jié)合位點(diǎn)，提高在納米金，例如金納米棒表面修飾精子頂體酶蛋白底物的密度，提高檢測(cè)精子頂體酶的檢測(cè)限和靈敏度(0.1?50ymol/L);
[0038](3)藉由本發(fā)明的試劑盒及檢測(cè)方法，能快速(3分鐘左右)、可靠、靈敏且低成本的檢測(cè)精子頂體酶的活性。
【附圖說(shuō)明】
[0039]圖1是本發(fā)明一典型實(shí)施方案之中在金納米棒表面修飾精子頂體酶底物的示意圖；
[0040]圖2是本發(fā)明一典型實(shí)施方案之中精子頂體酶底物修飾的納米金棒檢測(cè)精子頂體酶的示意圖；
[0041]圖3是本發(fā)明一典型實(shí)施方案之中制備的納米金棒的透射電鏡照片；
[0042]圖4是本發(fā)明一典型實(shí)施方案之中制備的納米金球的透射電鏡照片。
【具體實(shí)施方式】
[0043]如前所述，鑒于現(xiàn)有技術(shù)的諸多缺陷，本案發(fā)明人經(jīng)長(zhǎng)期研究和大量實(shí)踐，得以提出本發(fā)明的技術(shù)方案，即，一種基于納米金局域表面等離子共振(LSPR)檢測(cè)精子頂體酶活性的方法，其主要是通過(guò)在納米金表面修飾精子頂體酶底物，利用精子頂體酶水解頂體酶底物引起納米金的表面等離子共振信號(hào)的變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)精子頂體酶快速、靈敏、實(shí)時(shí)檢測(cè)。
[0044]進(jìn)一步的講，在本發(fā)明的一實(shí)施方案之中，一種基于LSPR檢測(cè)精子頂體酶活性的方法可以包含:
[0045](I)提供精子頂體酶底物修飾的納米金，包括:
[0046]納米金，主要利用其表面等離子共振信號(hào)受外界環(huán)境的介電常數(shù)的影響，可以監(jiān)測(cè)精子頂體酶與精子頂體酶底物作用過(guò)程中的變化；
[0047]修飾在納米金表面的官能團(tuán)，主要是在納米金棒表面提供大量的可以與精子頂體酶蛋白結(jié)合的位點(diǎn)，較為優(yōu)選的，可以采用兩親性超支化分子(例如，聚苯乙烯-b_聚丙烯酸，或者聚苯乙烯_b-聚乙烯醇)對(duì)納米金表面進(jìn)行官能化，其優(yōu)點(diǎn)在于:a、兩親性超支化高分子可以提高納米金在不同溶劑中的穩(wěn)定性，不會(huì)發(fā)生團(tuán)聚；b、超支化高分子的外圍可以暴露出更多的官能團(tuán)，便于進(jìn)一步修飾。
[0048]精子頂體酶底物(例如ZP3蛋白)，通過(guò)物理方式或與納米金表面的官能團(tuán)反應(yīng)，尤其優(yōu)選是后一種方式而固定在納米金的表面。
[0049](2)納米金的等離子共振信號(hào)的檢測(cè):精子頂體酶水解精子頂體酶底物(例如ZP3蛋白)后，引起納米金(例如金納米棒)周圍環(huán)境的介電常數(shù)發(fā)生變化，通過(guò)紫外可見(jiàn)吸收光譜可以清楚的檢測(cè)出這一變化。
[0050]在一更為具體的實(shí)施方案之中，一種基于LSPR檢測(cè)精子頂體酶活性的方法具體包括:
[0051]a.制備納米金；
[0052]b.納米金表面功能化。通過(guò)化學(xué)或者物理方法在納米金外修飾上官能團(tuán)；
[0053]c.功能化納米金標(biāo)記精子頂體酶底物。精子頂體酶底物通過(guò)與步驟(2)中修飾的官能團(tuán)反應(yīng)或者物理吸附作用固定在納米金表面。
[0054]d.納米金/精子頂體酶底物雜化體系檢測(cè)頂體酶。測(cè)定被精子頂體酶底物修飾的納米金的紫外可見(jiàn)吸收光譜，其紫外可見(jiàn)吸收峰對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)記為Aa，加入精子頂體酶后，精子頂體酶底物被精子頂體酶部分水解，測(cè)定部分水解的精子頂體酶底物修飾的納米金的紫外可見(jiàn)吸收光譜，其縱向吸收峰對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)為Ab，吸收峰波長(zhǎng)的差值記為△ λ =Aa-Ab,精子頂體酶的濃度c與Δ λ成正比。
[0055]e.定量檢測(cè)設(shè)備的制備及評(píng)價(jià)。
[0056]其中，納米金的形貌包括納米金棒、納米金球、納米金立方塊等。
[0057]其中，納米金(例如金納米棒)的功能化不限于某種特定的反應(yīng)和方法，凡是能在納米金表面修飾上能與精子頂體酶底物作用官能團(tuán)的適用方法都是可行的。
[0058]進(jìn)一步的，所述精子頂體酶底物的主要特點(diǎn)是能與精子頂體酶專一結(jié)合。任意一種精子頂體酶底物都可以作為被納米金標(biāo)記的底物。
[0059]前述的本發(fā)明實(shí)施方案之中，主要是利用納米金的表面等離子共振的變化與精子頂體酶的濃度成正比進(jìn)行檢測(cè)的。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知悉，利用等離子共振變化的其他參數(shù)如納米金吸收峰的強(qiáng)度的也可以用來(lái)檢測(cè)精子頂體酶濃度。
[0060]此外，適合利用本發(fā)明的試劑盒和檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)的精子頂體酶應(yīng)當(dāng)不限于人類的精子，而還可以是一般性哺乳動(dòng)物如豬、狗、馬等動(dòng)物的精子頂體酶。
[0061]又，在本發(fā)明的一典型實(shí)施案例中，本發(fā)明的技術(shù)方案可通過(guò)如下方式實(shí)現(xiàn):
[0062](I).制備納米金棒:納米金棒的制備主要分為兩個(gè)步驟:種子溶液制備和金種生長(zhǎng)。
[0063]i)種子溶液制備:將5mL 0.5mM HAucl4溶液和5mL 0.2M CTAB溶液混合，在劇烈攪拌條件下(1200r/min)將0.6mL新配置的0.0lM硼氫化鈉(NaBH4)溶液稀釋到ImL然后加入到上述混合溶液中，攪拌2min后停止，所得溶液作為生長(zhǎng)金納米棒的種子；
[0064]ii)種子生長(zhǎng):在25°C條件下將5mL 0.2M CTAB溶液和0.2mL 4mM △8勵(lì)3混合，再加入5.0mL ImM HAuCl4溶液，攪拌混合均勻后加入70 μ L 0.0788Μ抗壞血酸；最后取12 μ L種子溶液加入到生長(zhǎng)液中，在30°C下靜置6h即可。制備的金納米棒在8000r/min條件下離心1min,以去除金納米棒表面的CTAB。
[0065](2)在納米金棒表面修飾末端為羥基的超支化高分子的技術(shù)路線(圖1)如下:
[0066]a)首先納米金棒與2，2’-二硫代雙[1_ (2_溴_2_甲基-丙酰氧基)]乙烷(DTBE)通過(guò)硫金鍵(S-Au)反應(yīng)吸附在金納米棒周圍，大分子引發(fā)劑引發(fā)苯乙烯(PS)單體聚合反應(yīng)生成聚苯乙烯。將1mg DTBE溶解在10mL DMF中，在劇烈攪拌條件下加入ImL上述去除CTAB的金納米棒溶液，再加入30mg苯乙烯在40°C下攪拌12h。
[0067]b)進(jìn)一步引發(fā)2-((溴丁酰)氧基)乙基丙烯酸酯(BBEA)進(jìn)行自縮合乙烯基聚合反應(yīng)(SCVP)，在金表面修飾上超支化的高分子聚合物。再添加15mg丙稀酸單體(AA)單體進(jìn)行聚合，在金納米棒外圍修飾上大量的羧基。
[0068](3)精子頂體酶底物修飾的:將96mg EDC和29mg NHS溶于1mL去離子水，3mL外圍含有大量羧基的納米金棒在5000r/min條件下離心1min濃縮到500 μ L后在快速攪拌條件下加入到上述溶液中，利用PBS緩沖液調(diào)pH到7.1，然后加入400 μ L 2mg/mL精子頂體酶底物ZP3蛋白，在25°C下培育lh。反應(yīng)液在lOOOOr/min條件下離心，除去沒(méi)有偶聯(lián)到金納米棒表面的抗體。
[0069](4)納米金棒-精子頂體酶底物雜化體系檢測(cè)頂體酶。首先建立一條工作曲線，取適量精子頂體酶修飾的金納米棒溶液于石英比色皿中，控制上述溶液的濃度以保證金納米棒縱向吸收峰的峰值在0.6-0.8之間為宜，在300-1000nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定精子頂體酶修飾的金納米棒的吸收光譜，其縱向吸收峰對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)記為λ。，在上述溶液中加入含有不同濃度Cn的精子頂體酶的溶液，分別測(cè)定加入不同濃度的精子頂體酶的紫外可見(jiàn)吸收光譜λ η，波長(zhǎng)偏移值記為A λη= λ η-λ。，建立(；和Δ λ η之間的關(guān)系。對(duì)于未知濃度c的精子頂體酶，可以利用測(cè)定的A λ進(jìn)行計(jì)算。
[0070]以下結(jié)合若干較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的解釋說(shuō)明，但其中的實(shí)驗(yàn)條件和設(shè)定參數(shù)不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明基本技術(shù)方案的局限。并且本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
[0071]實(shí)施例1:使用精子頂體酶底物修飾的金納米棒檢測(cè)精子頂體酶
[0072]1.制備納米金棒:納米金棒的制備主要分為兩個(gè)步驟:種子溶液制備和金種生長(zhǎng)。I)種子溶液制備:將5mL 0.5mM HAucl4溶液和5mL 0.2M CTAB溶液混合，在劇烈攪拌條件下(1200r/min)將0.6mL新配置的0.0lM硼氫化鈉(NaBH4)溶液稀釋到ImL然后加入到上述混合溶液中，攪拌2min后停止，所得溶液作為生長(zhǎng)金納米棒的種子；2)種子生長(zhǎng):在25°C條件下將5mL 0.2M CTAB溶液和0.2mL 4mM厶8勵(lì)3混合，再加入5.0mL ImM HAuCl4S液，攪拌混合均勻后加入70 μ L 0.0788Μ抗壞血酸；最后取12 μ L種子溶液加入到生長(zhǎng)液中，在30°C下靜置6h即可。制備的金納米棒在8000r/min條件下離心lOmin，以去除金納米棒表面的CTAB。制備的納米金棒的TEM如圖3所示。
[0073]2.在納米金棒表面修飾末端為羥基的超支化高分子的技術(shù)路線(參閱圖1)如下:
[0074]a)首先納米金棒與2，2’-二硫代雙[1_ (2_溴_2_甲基-丙酰氧基)]乙烷(DTBE)通過(guò)硫金鍵(S-Au)反應(yīng)吸附在金納米棒周圍，大分子引發(fā)劑引發(fā)苯乙烯(PS)單體聚合反應(yīng)生成聚苯乙烯。將1mg DTBE溶解在10mL DMF中，在劇烈攪拌條件下加入ImL上述去除CTAB的金納米棒溶液，再加入30mg苯乙烯在40°C下攪拌12h。b)進(jìn)一步引發(fā)2 -((溴丁酰)氧基)乙基丙烯酸酯(BBEA)進(jìn)行自縮合乙烯基聚合反應(yīng)(SCVP)，在金表面修飾上超支化的高分子聚合物。添加15mg丙稀酸單體(AA)單體進(jìn)行聚合，在金納米棒外圍修飾上大量的羧基。
[0075]3.精子頂體酶底物修飾的:將96mg EDC和29mg NHS溶于1mL去離子水，3mL外圍含有大量羧基的納米金棒在5000r/min條件下離心1min濃縮到500 μ L后在快速攪拌條件下加入到上述溶液中，利用PBS緩沖液調(diào)pH到7.1，然后加入400 μ L 2mg/mL精子頂體酶底物ZP3蛋白，在25°C下培育lh。反應(yīng)液在lOOOOr/min條件下離心，除去沒(méi)有偶聯(lián)到金納米棒表面的抗體。
[0076]4.納米金棒-精子頂體酶底物雜化體系檢測(cè)頂體酶。首先建立一條工作曲線，取適量精子頂體酶修飾的金納米棒溶液于石英比色皿中，控制上述溶液的濃度以保證金納米棒縱向吸收峰的峰值在0.6-0.8之間為宜，在300-1000nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定精子頂體酶修飾的金納米棒的吸收光譜，其縱向吸收峰對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)記為λ。，在上述溶液中加入含有不同濃度Cn的精子頂體酶的溶液，分別測(cè)定加入不同濃度的精子頂體酶的紫外可見(jiàn)吸收光譜λ η，波長(zhǎng)偏移值記為A λη= λ η-λ。，建立(；和Δ λ η之間的關(guān)系。對(duì)于未知濃度c的精子頂體酶，可以利用測(cè)定的A λ進(jìn)行計(jì)算
[0077]5.參考所做的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，測(cè)定樣品中精子頂體酶的濃度為5 μΜ，檢測(cè)范圍為
0.01 μΜ ?50 μΜο
[0078]實(shí)施例2:使用精子頂體酶底物修飾的納米金球檢測(cè)精子頂體酶
[0079]1.制備納米金球:取10mL 2.5X10 4mol/L HAuCl4溶液加熱至100_150°C，加入1mL I %檸檬酸三鈉溶液，當(dāng)溶液的顏色完全變?yōu)橥该鞯木萍t色時(shí)，繼續(xù)回流1min后停止加熱，冷卻至室溫，4°C保存，得到的納米金球紫外光譜吸收波長(zhǎng)為526nm。納米金球的透射電鏡圖見(jiàn)圖4。
[0080]2.納米金顆粒的標(biāo)記:將1mg DTBE溶解在10mL DMF中，在劇烈攪拌條件下加入20mL上述納米近球溶液，在加入30mg苯乙烯在40°C下攪拌12h。然后加入40mg BBEA單體，引發(fā)聚合，形成超支化高分子，反應(yīng)一段時(shí)間后，添加15mg丙烯酸單體(AA)，從在金納米棒外圍修飾上大量的羧基。
[0081]3.精子頂體酶底物修飾的金納米:將96mg EDC和29mg NHS溶于1mL去離子水，1mL外圍含有大量羧基的納米金球在5000r/min條件下離心lOmin，濃縮到500 μ L后在快速攪拌條件下加入到上述溶液中，利用PBS緩沖液調(diào)pH到7.1，然后加入400 μ L 2mg/mL精子頂體酶底物ZP3蛋白，在25°C下培育lh。反應(yīng)液在10000r/min條件下離心lOmin，除去沒(méi)有偶聯(lián)到納米金球表面的抗體。
[0082]4.納米金球-精子頂體酶底物雜化體系檢測(cè)頂體酶。首先建立一條工作曲線，取1mL精子頂體酶修飾的納米金球溶液與石英比色皿中，控制上述溶液的濃度以保證納米金吸收峰的峰值在0.6-0.8之間為宜，在300-1000nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定精子頂體酶修飾的納米金球的吸收光譜，其吸收峰對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)記為λ。，在上述溶液中加入含有不同濃度Cn的精子頂體酶的溶液，分別測(cè)定加入不同濃度的精子頂體酶的紫外可見(jiàn)吸收光譜λ η，波長(zhǎng)偏移值記為A λη= λ η-λ。，建立(；和Δ λ η之間的關(guān)系。對(duì)于未知濃度的精子頂體酶c，可以利用測(cè)定的△ λ進(jìn)行計(jì)算。
[0083]5.參考所做的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，測(cè)定樣品中精子頂體酶的濃度為7 μΜ，檢測(cè)范圍為
0.01 μΜ ?30 μΜο
[0084]最后，還需要說(shuō)明的是，術(shù)語(yǔ)“包括”、“包含”或者其任何其他變體意在涵蓋非排他性的包含，從而使得包括一系列要素的過(guò)程、方法、物品或者設(shè)備不僅包括那些要素，而且還包括沒(méi)有明確列出的其他要素，或者是還包括為這種過(guò)程、方法、物品或者設(shè)備所固有的要素。
[0085]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，以上所述本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。任何根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思所作出的各種其他相應(yīng)的改變與變形，均應(yīng)包含在本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種基于LSPR檢測(cè)精子頂體酶活性的試劑盒，其特征在于包含: 功能化納米金標(biāo)記精子頂體酶底物，包含納米金以及通過(guò)化學(xué)鍵合和/或物理吸附方式固定在納米金表面的精子頂體酶底物； 以及，適于使所述精子頂體酶底物與精子頂體酶專一結(jié)合并進(jìn)行反應(yīng)的緩沖液。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于還包含記載有所述試劑盒的使用方法的說(shuō)明書(shū)，所述使用方法包括: 測(cè)定主要由所述緩沖液和均勻分散在所述緩沖液內(nèi)的功能化納米金標(biāo)記精子頂體酶底物組成的混合溶液在300-1000nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收光譜，并記錄吸收峰對(duì)應(yīng)的吸收波長(zhǎng)λ。以及吸收峰強(qiáng)度A。； 在所述混合溶液中加入不同濃度Cn的精子頂體酶溶液，并分別測(cè)定在加入不同濃度的精子頂體酶標(biāo)準(zhǔn)溶液之后所獲的不同混合反應(yīng)體系在300-1000nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收光譜，記錄吸收峰對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)λ n和吸收峰值A(chǔ)n，波長(zhǎng)偏移值記為△ λη= λ η-λ。，吸收峰偏移值記為ΔΑη= Αη_Α。，探知(；與Δ λ?；颚?An成正比，并由此建立精子頂體酶溶液濃度與波長(zhǎng)偏移值或吸收峰偏移值的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，其中η為大于或等于2的自然數(shù)； 以及，在所述混合溶液中加入未知濃度Cx的精子頂體酶溶液，并測(cè)定由此形成的混合反應(yīng)體系在300_1000nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收波長(zhǎng)λ x，波長(zhǎng)偏移值Δ λχ= λ χ-λ?；蛭辗迤浦礎(chǔ)Ax= Αχ-Α。，并依據(jù)所述標(biāo)準(zhǔn)工作曲線而計(jì)算出Cx。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述使用方法還包括:控制所述混合溶液在300-1000nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收峰的峰值在0.6-0.8之間。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述精子頂體酶底物通過(guò)與修飾在納米金表面的選定官能團(tuán)發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)而固定連接到所述納米金表面。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述納米金包含納米金棒、納米金球或納米金立方塊。6.一種精子頂體酶活性的檢測(cè)裝置，其特征在于包含權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的試劑盒。7.一種基于LSPR檢測(cè)精子頂體酶活性的檢測(cè)方法，其特征在于包含: 提供功能化納米金標(biāo)記精子頂體酶底物以及適于使所述精子頂體酶底物與精子頂體酶專一結(jié)合并進(jìn)行反應(yīng)的緩沖液，所述功能化納米金標(biāo)記精子頂體酶底物包含納米金以及通過(guò)化學(xué)鍵合和/或物理吸附方式固定在納米金表面的精子頂體酶底物； 測(cè)定主要由所述緩沖液和均勻分散在所述緩沖液內(nèi)的功能化納米金標(biāo)記精子頂體酶底物組成的混合溶液在300-1000nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收光譜，并記錄吸收峰對(duì)應(yīng)的吸收波長(zhǎng)入0; 在所述混合溶液中加入不同濃度Cn的精子頂體酶溶液，并分別測(cè)定在加入不同濃度的精子頂體酶標(biāo)準(zhǔn)溶液之后所獲的不同混合反應(yīng)體系在300-1000nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收光譜，記錄吸收峰對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)λ n和吸收峰值A(chǔ)n，波長(zhǎng)偏移值記為△ λη= λ η-λ。，吸收峰偏移值記為ΔΑη= Αη_Α。，探知(；與Δ λ?；颚?An成正比，并由此建立精子頂體酶溶液濃度與波長(zhǎng)偏移值或吸收峰偏移值的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，其中η為大于或等于2的自然數(shù)； 以及，在所述混合溶液中加入未知濃度Cx的精子頂體酶溶液，并測(cè)定由此形成的混合反應(yīng)體系在300_1000nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收波長(zhǎng)λ x，波長(zhǎng)偏移值Δ λχ= λ χ-λ?；蛭辗迤浦礎(chǔ)Ax= Ax-A。，并依據(jù)所述標(biāo)準(zhǔn)工作曲線而計(jì)算出Cx。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的基于LSPR檢測(cè)精子頂體酶活性的檢測(cè)方法，其特征在于還包括:控制所述混合溶液在300-1000nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收峰的峰值在0.6-0.8之間。9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的基于LSPR檢測(cè)精子頂體酶活性的檢測(cè)方法，其特征在于所述功能化納米金標(biāo)記精子頂體酶底物的制備方法包括: 提供具有明顯紫外可見(jiàn)吸收光譜吸收峰的納米金， 通過(guò)化學(xué)或者物理方法在所述納米金表面修飾選定官能團(tuán)， 使所述精子頂體酶底物與所述選定官能團(tuán)進(jìn)行親合反應(yīng)而固定連接在所述納米金表面。10.根據(jù)權(quán)利要求7或9所述的基于LSPR檢測(cè)精子頂體酶活性的檢測(cè)方法，其特征在于所述納米金包含納米金棒、納米金球或納米金立方塊。
【文檔編號(hào)】G01N33/573GK106033086SQ201510116466
【公開(kāi)日】2016年10月19日
【申請(qǐng)日】2015年3月17日
【發(fā)明人】黃又舉, 陳濤, 榮運(yùn)
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院寧波材料技術(shù)與工程研究所