本發(fā)明涉及體外診斷免疫檢測領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明提供了一種化學(xué)發(fā)光免疫檢測肺炎支原體IgM試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
肺炎支原體（mycoplasma pneumoniae，MP）是介于細(xì)菌和病毒之間的一種超過濾性病原微生物，主要通過呼吸道飛沫以氣溶膠微粒的形式傳播。1962 年首先從人類原發(fā)性非典型肺炎（primary atypical pneumonia，PAP）患者的痰液中分離和培養(yǎng)而來。20 世紀(jì)90 年代以來，隨著肺炎病原學(xué)的變遷，MP已成為小兒肺炎的重要病原體，MP感染不僅引起肺部病變，且能侵犯心、腦、肝、腎等其他器官，引起多種肺外表現(xiàn)。MP還是社區(qū)獲得性肺炎（CAP）的重要病原，尤其是5 歲以上小兒，MP在非流行年占CAP 病原10~20％。因MP生長緩慢、潛伏期及帶菌時間長，形成間歇期發(fā)病緩慢、長時期傳播的流行特點，流行可達(dá)數(shù)月至數(shù)年。近些年來，流感人群比例逐年增加，不僅侵犯青少年和兒童，嬰幼兒發(fā)病率也呈增多趨勢，且由于MP感染常無特異性臨床表現(xiàn)，容易與一般的病毒性感冒相混淆，因此能夠及時確診何種病因致病，做到早發(fā)現(xiàn)早治療，減少兒童急性肺炎病情惡化，故早期診斷極為重要。
肺炎支原體抗體分為IgG抗體和IgM抗體兩種，因為肺炎支原體感染的潛伏期為2周-3周，當(dāng)患者出現(xiàn)癥狀而就診時，IgM抗體已達(dá)到相當(dāng)高的水平，因此，IgM抗體陽性可作為急性期感染的診斷指標(biāo)。如IgM抗體陰性，也不能否定肺炎支原體感染，還需檢測IgG抗體。IgG較IgM出現(xiàn)晚，需動態(tài)觀察。肺炎支原體IgG抗體的測定，同時結(jié)合肺炎支原體IgM抗體的檢測，可以用于輔助診斷支原體肺炎等疾病。
臨床檢測肺炎支原體IgM的主要方法為酶聯(lián)免疫吸附法，但該方法存在著下述的不足之處：
（1） 使用12×8型、6×8型、8×12型或整板型96孔專用微孔板作為抗原包被用具和反應(yīng)容器，在使用時只能分成12批次、6批次、8批次或整板一次使用，無法進(jìn)行獨立的、單人份的檢測；
（2） 定量測定所用的試劑種類較多，每一種檢測試劑都要用試劑瓶來盛裝，并且每使用一種試劑時都需要更換吸液嘴來分別加注到微孔板的微孔中，不但試劑瓶種類多，加注試劑的操作也極為繁瑣；
（3） 缺少對檢測信息的相應(yīng)標(biāo)注，只能通過查看試劑盒外包裝盒的標(biāo)識才能了解或知悉檢測試劑的生產(chǎn)批號及有效期信息，而且所知悉的信息在檢測過程中不受控，具有很大的隨意性；
（4） 檢測試劑在檢測過程中處于開放的空間，容易引起各種試劑之間的交叉污染而影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性；
（5） 檢測過程多采用手工操作，試劑或樣本的加量不很精確，操作過程極為繁瑣和復(fù)雜，容易發(fā)生操作差錯，檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度較差；
（6） 在檢測項目成套試劑的數(shù)量配置及使用上均為項目數(shù)×48/96人份，如果需要檢測10個項目，則試劑的配置及使用數(shù)須為10×48/96人份，如果只有一份樣本需要檢測10個不同的項目，也需要配置10×48/96人份的試劑，存在著不夠經(jīng)濟(jì)合理的缺點。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
目前肺炎支原體IgM檢測技術(shù)存在以下缺點：檢測成本高、檢測靈敏度低、檢測線性范圍窄、重現(xiàn)性低、不能定量、操作復(fù)雜等。
本發(fā)明正是為了克服以上所述缺點，公開了一種檢測成本低、靈敏度高、檢測線性范圍廣、重現(xiàn)性高、可以定量、操作簡單的肺炎支原體IgM試劑盒及其制備方法。本發(fā)明首先制備化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒，主要包括：肺炎支原體IgM單克隆抗體包被的磁顆粒、肺炎支原體IgM單克隆抗體包被的吖啶酯以及肺炎支原體IgM定標(biāo)品；然后利用全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀對定標(biāo)品進(jìn)行檢測，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，內(nèi)置于電腦軟件，測試實際樣本，根據(jù)樣本發(fā)光值計算樣本濃度；最后對肺炎支原體IgM全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)進(jìn)行性能（靈敏度、線性、精密度、干擾性）的評價。
本發(fā)明與目前技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點：
1、本發(fā)明選擇吖啶酯作為標(biāo)記材料，并應(yīng)用于化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)，該發(fā)光體系為直接化學(xué)發(fā)光，與傳統(tǒng)的酶促化學(xué)發(fā)光相比，該反應(yīng)不需要酶的參與，更加節(jié)約成本；
2、本發(fā)明選用的吖啶酯化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)檢測靈敏度高；
3、本發(fā)明選用的吖啶酯化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)準(zhǔn)確性高；
4、本發(fā)明選用的吖啶酯化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)重復(fù)性高，批內(nèi)及批間差均在5%以內(nèi)，這是其它化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)難以達(dá)到的；
5、本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)已實現(xiàn)樣本的定量，通過內(nèi)置標(biāo)準(zhǔn)曲線到測試軟件，只需測試樣本就可直接得到樣本的濃度值；
6、本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)已實現(xiàn)全自動化，試劑及樣本的添加全有儀器完成，操作更加簡便，減少了人為的誤差。
具體實施方式
實施例1：肺炎支原體IgM化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒制備方法
（1）肺炎支原體IgM單克隆抗體包被的納米磁珠制備：
取50mg羧基化的磁微粒（粒徑為0.05-1um）懸浮液，磁分離去上清，用0.02 M，pH為5.5 MES緩沖液重懸，加入0.5-2mL新配置的10 mg/mL的EDC水溶液，活化磁珠表面羧基，加入3-5 mg 肺炎支原體IgM單克隆抗體，室溫下混懸2-10 h，磁分離，去除上清，用含2% BSA 的0.1 M pH為8.0的Tris緩沖液重懸到1mg/mL，得到肺炎支原體IgM單克隆抗體包被的磁顆粒，每瓶5mL分裝保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>
（2）肺炎支原體IgM衍生物標(biāo)記的吖啶酯的制備：
取50 uL 25mg/mL的肺炎支原體IgM衍生物，加入150 uL 0.1-0.2 M pH 9.0-9.5的碳酸鹽緩沖液，混勻，然后加入1-2 uL 5 mg/mL的吖啶酯混勻，室溫下避光反應(yīng)，1-2 h后取出，用2 mL的zeba離心脫鹽柱脫鹽處理，脫鹽過程中首先分別用純凈水及TBS緩沖液進(jìn)行處理，最后加入得到的肺炎支原體IgM衍生物標(biāo)記的吖啶酯溶液，收集離心管中的液體至保存管得到肺炎支原體IgM衍生物標(biāo)記的吖啶酯，每瓶5 mL分裝保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>
（3）肺炎支原體IgM定標(biāo)品的制備：
用標(biāo)準(zhǔn)品緩沖液（40 mM Tris-HCl，0.5% BSA，1% NaCl，pH 8.0）將肺炎支原體IgM配置成一定濃度，每瓶0.5 mL分裝凍干，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
(4)化學(xué)發(fā)光預(yù)激發(fā)液的配制：
量取1.0升純化水，依次加入80uL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的雙氧水(H2O2)、1.0克疊氮化鈉、1.5克吐溫20，搖勻后避光存放。
(5)化學(xué)發(fā)光激發(fā)液的配制：
量取1.0升純化水，依次加入0.6克氫氧化鈉、0.5克PC300、0.5g疊氮化鈉、1.5克Triton X-405，搖勻后避光存放。
實施例2：肺炎支原體IgM化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法：
本發(fā)明以全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀為檢測工具，本發(fā)明的方法學(xué)模式為競爭法，即儀器依次加入20 uL的樣品、50 uL的肺炎支原體IgM單克隆抗體包被的磁顆粒以及50 uL的肺炎支原體IgM包被的吖啶酯，反應(yīng)10 min后，進(jìn)行磁分離，儀器將反應(yīng)混合物送入暗室，依次加入50uL化學(xué)發(fā)光預(yù)激發(fā)液、50uL化學(xué)發(fā)光激發(fā)液進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，最后記錄發(fā)光強(qiáng)度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出被測樣品的 肺炎支原體IgM含量。
實施例3：肺炎支原體IgM化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒性能評價
靈敏度的檢測：
對血清盤中的靈敏度參考品進(jìn)行檢測，符合試劑盒技術(shù)要求。
準(zhǔn)確度的檢測：
對血清盤中的陽性參考品和陰性參考品進(jìn)行檢測，符合性均為100% 。
精密度測定：
對重復(fù)性參考品R1、R2和R3進(jìn)行檢測，每個樣本每個濃度各做10個平行，用三批試劑盒進(jìn)行檢測，計算試劑盒批內(nèi)及批間差，結(jié)果，測試R1和R2的試劑盒批內(nèi)及批間差均小于5%，R3均為陰性。
干擾性實驗：
取混合血清分別添加干擾物包括： 結(jié)合膽紅素、游離膽紅素、血紅蛋白、抗壞血酸、甘油酯，添加比例按照 1:20 進(jìn)行，分別測定混合血清及添加了各種干擾物后混合血清的測值，計算二者之間的偏差，以 ±10%為可接受范圍。結(jié)果表明，干擾性均達(dá)到 NCCLS 的文件標(biāo)準(zhǔn)，可用于臨床實驗室肺炎支原體IgM濃度的準(zhǔn)確評估。