專利名稱：一種發(fā)現(xiàn)和鑒定單細(xì)胞藻類脂質(zhì)生物標(biāo)志物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物分析化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種發(fā)現(xiàn)和鑒定單細(xì)胞藻類脂質(zhì)生物標(biāo)志物的方法。
背景技術(shù)：
脂質(zhì)化合物都是小分子化合物，它們都具有相近的物理和化學(xué)性質(zhì)，它們的存在和豐度對(duì)于細(xì)胞代謝調(diào)控、能量控制、信號(hào)傳導(dǎo)等重要生理活動(dòng)至關(guān)重要。通過研究從單細(xì)胞藻類中得到的總脂提取物，可以獲得脂代謝物組(Iipidome)的信息(脂代謝譜)，包括了細(xì)胞內(nèi)所有脂類物質(zhì)的組成、相互作用和功能信息，它反映了在特定生理狀態(tài)下單細(xì)胞藻類細(xì)胞內(nèi)脂代謝物的整體變化，能夠更詳細(xì)地了解細(xì)胞受外界干擾因素所引起的脂質(zhì)代謝通路和網(wǎng)絡(luò)的改變，發(fā)現(xiàn)和鑒定脂質(zhì)生物標(biāo)志物，能夠確定具有關(guān)鍵作用的生物分析，并有助于推測(cè)關(guān)鍵代謝途徑的調(diào)控模式。脂代謝物譜的分析要求高靈敏度、高通量和無偏向性的分析方法。由于脂代謝物和生物體系的復(fù)雜性，至今為止，尚無一種能滿足上述所有要求的代謝組學(xué)分析技術(shù)?，F(xiàn)有的核磁共振技術(shù)(NMR)具備快速和無偏向性的特點(diǎn)，但其靈敏度太低。色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)將色譜的分離能力與質(zhì)譜的定性功能結(jié)合起來，實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜混合物更準(zhǔn)確的定性定量分析，也簡(jiǎn)化了樣品的前處理過程。氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MQ靈敏度較高，但其研究范圍僅限于分析揮發(fā)性的物質(zhì)，無法分析熱不穩(wěn)定性和分子量較大的代謝產(chǎn)物。這一缺陷正好可由液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MQ技術(shù)來彌補(bǔ)。因此，LC-MS使得快速發(fā)現(xiàn)、靈敏檢測(cè)和證實(shí)新的和不尋常的脂族化合物和脂肪酸(包括生物膜主要組分、脂類信號(hào)分子)的效率明顯提高。超高效液相色譜(UPLC)耦合四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜Oi-TOF)，兩者的聯(lián)用適合于復(fù)雜體系的分離分析和未知物的結(jié)構(gòu)鑒定。樣品分型常用模式識(shí)別方法，即基于檢測(cè)到的代謝物信息來建立多變量統(tǒng)計(jì)模型，一方面表征樣品之間的關(guān)系，另一方面篩選對(duì)樣品分類有重要貢獻(xiàn)的潛在標(biāo)志物?，F(xiàn)有的常用模式識(shí)別方法是主成分分析(PCA)和偏最小二乘判別分析(PLS-DA)。主成分分析 (PCA)是一種現(xiàn)有的常用無師監(jiān)督模式識(shí)別方法，可以直觀地在多維空間上描述樣品間的差異。在PCA模型中，兩組之間的區(qū)別不太明顯，模型僅能解釋部分原始數(shù)據(jù)。偏最小二乘判別分析(PLS-DA)判別能力優(yōu)于PCA，而正交偏最小二乘判別(OPLS-DA)是一種該進(jìn)的偏最小二乘判別分析，其分析效果比常規(guī)的PLS-DA更有優(yōu)勢(shì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種發(fā)現(xiàn)和鑒定單細(xì)胞藻類脂質(zhì)生物標(biāo)志物的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下發(fā)現(xiàn)和鑒定單細(xì)胞藻類脂質(zhì)生物標(biāo)志物的方法，其特征包括下述步驟(1)單細(xì)胞藻類細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)化合物的提取和抗氧化保護(hù)；( 超高效液相色譜/四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC/Q-T0F-MS)分析脂質(zhì)化合物；(3)用Markerlynx提取分析數(shù)據(jù)并導(dǎo)入到Simca-p軟件中進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA) ； (4)對(duì)OPLS-DA模型進(jìn)行驗(yàn)證(5)由OPLS-DA模型的結(jié)果篩選出潛在脂質(zhì)生物標(biāo)志物；(6)對(duì)潛在脂質(zhì)生物標(biāo)志物進(jìn)行結(jié)構(gòu)推斷和鑒定。上述的方法中，用甲醇-三氯甲烷-水提取液提取單細(xì)胞藻細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)化合物，提取液中加入抗氧化劑2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)。其中提取液甲醇、三氯甲烷、水的體積比為1 1 0.5，抗氧化劑2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)與提取液的質(zhì)量體積比為0.01% -0. 05% g/mi。樣品與提取液混合后，用振蕩器震蕩5-lOmin后，在4-10°C下離心后取下層溶液，用氮?dú)獯蹈?，再?. 5-lml色譜甲醇溶解；所述樣品為單細(xì)胞藻粉。上述的方法中，步驟(1)中單細(xì)胞藻中提取的脂質(zhì)化合物采用超高效液相色譜與四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀測(cè)定。上述的方法中，步驟O)中采用超高效液相色譜與四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀分析脂質(zhì)化合物，超高效液相色譜方法中，流動(dòng)相A為水、異丙醇和甲酸的混合液，其中水、 異丙醇的體積比為95/5 70/30，甲酸的含量始終為流動(dòng)相A的0.1% (ν/ν)；流動(dòng)相B 為乙腈、異丙醇和甲酸的混合液，其中乙腈、異丙醇的體積比為95/5 70/30，甲酸的含量始終為流動(dòng)相B的0. (ν/ν)；色譜柱溫為35°C -40°C，樣品室溫為4°C -10°C，流速為 0. 3-0. 4ml/min，進(jìn)樣體積為 1-5 μ 1。上述的方法中，質(zhì)譜分析過程分別采用電噴霧(ESI)離子源正離子和負(fù)離子兩種模式進(jìn)行檢測(cè)。正、負(fù)離子模式下的質(zhì)譜參數(shù)如下毛細(xì)管電壓為^00V-3000V，錐孔電壓為40-60V，離子源溫度為95-105°C，電噴霧氣(脫溶劑氣)溫度為340_360°C，電噴霧氣流量(脫溶劑氣流量)為580-6201/h，錐孔氣流量為58-621/h，數(shù)據(jù)采集范圍在IOO-IOOOmZo上述的方法中，用Markerlynx提取步驟O)由超高效液相色譜/四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀所采集到的數(shù)據(jù)，并將提取的數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，再導(dǎo)入到Simca-p軟件中進(jìn)行Pareto標(biāo)尺化處理，然后經(jīng)Pareto標(biāo)尺化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析。上述的方法中，對(duì)步驟C3)所建立的OPLS-DA模型進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證方法為隨機(jī)抽取80%由Markerlynx所提取的數(shù)據(jù)來建立OPLS-DA模型，由該模型來預(yù)測(cè)剩下20%數(shù)據(jù)的分類情況。上述的方法中，由步驟(3)正交偏最小二乘判別分析的結(jié)果，即變量重要因子(Variable Importance for the Pro jection，VIP)值和 s 載荷圖，篩選出潛在的脂質(zhì)生物標(biāo)志物；其中，變量重要因子值(VIP)大于1，同時(shí)在s載荷圖中縱坐標(biāo)的絕對(duì)值 (|p(COrr) I)，即變量投影置信水平，大于0. 6的化合物作為潛在的脂質(zhì)生物標(biāo)志物。上述的方法中，對(duì)步驟(5)中潛在脂質(zhì)生物標(biāo)志物進(jìn)行結(jié)構(gòu)推斷和鑒定，其依據(jù)是Masslynx軟件給出的精確分子量、可能元素組成、一級(jí)質(zhì)譜母離子的保留時(shí)間以及二級(jí)質(zhì)譜(MS/MS)特征碎片離子分析。相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有的優(yōu)勢(shì)如下1、本發(fā)明使用超高效液相色譜(UPLC)耦合四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀0MOF) 為分析檢測(cè)手段，兩者的聯(lián)用適合于復(fù)雜體系的分離分析和未知物的結(jié)構(gòu)鑒定。UPLC使用小顆粒色譜填料(< 2 μ m)和超高壓輸液?jiǎn)卧?能達(dá)到15，OOOpsi)，與常規(guī)HPLC相比峰容
4量增加2倍，分離速度提高10倍，靈敏度提高3 5倍，反壓提高8倍，提高了樣品的分析通量，靈敏度、分離度和分析速度，再和質(zhì)譜聯(lián)用時(shí)有助于目標(biāo)化合物與競(jìng)爭(zhēng)性電離雜質(zhì)的分離，從而減弱離子抑制作用。Q-TOF檢測(cè)器靈敏度高、分辨率高，能夠達(dá)到20X10_6的質(zhì)量準(zhǔn)確度，能夠區(qū)分分子質(zhì)量很接近的不同脂類分子的質(zhì)量峰。通過TOF-MS能獲取較高的質(zhì)量準(zhǔn)確度的碎片離子信息，同時(shí)具有的MS/MS 二級(jí)碎片解析功能對(duì)于鑒定未知或者尚未鑒定的脂類代謝分子也非常有幫助。2、本發(fā)明采用正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)的模式識(shí)別方法，是一種改進(jìn)的偏最小二乘判別分析(PLS-DA)，橫坐標(biāo)體現(xiàn)了樣品組間差異(外界干擾因素引起)，縱坐標(biāo)體現(xiàn)了樣品組內(nèi)差異，其判別能力優(yōu)于常規(guī)的PCA和PLS-DA，其分析結(jié)果將與分類變量相關(guān)的變量和與分類變量正交(無關(guān))的變量分開，僅篩選出與分類變量相關(guān)的標(biāo)志物，從而提高可靠性和準(zhǔn)確性。3、本發(fā)明所建立的發(fā)現(xiàn)和鑒定單細(xì)胞藻類脂類生物標(biāo)志物的通用技術(shù)體系，可輻射應(yīng)用到植物和微生物代謝組學(xué)分析、食品安全代謝組學(xué)分析等領(lǐng)域。


圖1是0. 5% NaCl脅迫培養(yǎng)的雪地衣藻和無NaCl培養(yǎng)的雪地衣藻對(duì)照的OPLS-DA 模型，其中圖Ia為ESI正離子模式的OPLS-DA模型，圖Ib為ESI負(fù)離子模式的OPLS-DA模型。三角形為0. 5% NaCl脅迫培養(yǎng)的雪藻，方塊為無NaCl培養(yǎng)的對(duì)照雪藻，每個(gè)點(diǎn)表示一個(gè)樣品。圖2是0. 5% NaCl脅迫培養(yǎng)的雪地衣藻和無NaCl培養(yǎng)的雪地衣藻對(duì)照的OPLS-DA 模型驗(yàn)證圖，圖加為ESI正離子模式的OPLS-DA模型驗(yàn)證圖，圖2b為ESI負(fù)離子模式的 OPLS-DA模型驗(yàn)證圖。黑色圓點(diǎn)表示用來塑造OPLS-DA的80%已知樣品；+符號(hào)表示用 OPLS-DA來預(yù)測(cè)的20%未知樣品，每個(gè)點(diǎn)表示一個(gè)樣品。圖3是s載荷圖和VIP值的結(jié)合圖，其中圖3a為ESI正離子模式下圖，圖北為 ESI負(fù)離子模式下圖。每個(gè)點(diǎn)表示一個(gè)質(zhì)譜檢測(cè)到的離子，空白三角形表示變量載荷投影值的置信水平，黑色三角形表示變量投影的重要因子(VIP)值。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明實(shí)施例1發(fā)現(xiàn)和鑒定雪地衣藻(Chlamydomonas nivalis)適應(yīng)NaCl脅迫環(huán)境的脂質(zhì)生物標(biāo)志物1、雪地衣藻(Chlamydomonas nivalis)培養(yǎng)和收獲雪地衣藻在培養(yǎng)6天后，添加已滅菌的NaCl溶液，使終濃度達(dá)到0.5% (w/v) 0繼續(xù)培養(yǎng)Oh、IhJhU^i即取樣，每個(gè)時(shí)刻設(shè)置四個(gè)平行樣。藻液離心(5000r/min，5min)，去上清，藻泥用純凈水洗滌三次后置于超低溫冰箱中預(yù)凍后，冷凍干燥得藻粉。2、細(xì)胞脂質(zhì)化合物的提取藻粉用甲醇-三氯甲烷-水提取液提取。先在2.5ml的甲醇-三氯甲烷-水 (1/1/0.5, ν/ν/ν)提取溶液中加入0.025 % (w/v, g/ml)抗氧化劑BHT，然后準(zhǔn)確稱取 10. Omg的藻粉，加入提取液，用振蕩器震5min后，在10°C和5500rpm轉(zhuǎn)速下離心IOmin后，取下層溶液，用氮?dú)獯蹈桑儆?. 8ml色譜甲醇溶解后用于UPLC-Q-T0F/MS分析。3、脂代謝譜的UPLC-Q-T0F/MS分析液相分析采用美國(guó)Waters公司Acquity超高效液相色譜系統(tǒng)(UPLC)；色譜柱采用BEH C18柱(2. ImmX 50mm, 1.7 μ m)；流動(dòng)相A為水/異丙醇70/30 (含0· 甲酸)；流動(dòng)相B為乙腈/異丙醇70/30 (含0. 1 %甲酸)；流速為0. 4ml/min ；進(jìn)樣量為1 μ 1 ；柱溫 40°C，樣品室溫度4°C。正離子模式下，流動(dòng)相洗脫程序?yàn)槌跏糀 B比例為(50 50)， IminA B 比例為(15 85)，l_5min A B 比例為(15 85)，9min A B 比例為(0 100)， 9-14min A B 比例為(0 100)，15minA B 比例為(50 50)，15_17minA B 比例為 (50 50)；負(fù)離子模式下，流動(dòng)相洗脫程序?yàn)槌跏糀 B比例為(60 40), 2min A B比例為(20 80)，2-7min A B 比例為(20 80)，9min A B 比例為(0 100)，9_14min A B 比例為(0 100)，15min A B 比例為(50 50)，15_17min A B 比例為(50 50)。質(zhì)譜分析采用美國(guó)Waters公司Micromass Q-TOF串聯(lián)四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀， 配有電噴霧離子源(ESI)。質(zhì)譜分析過程分別采用ESI源正離子和負(fù)離子兩種模式進(jìn)行檢測(cè)。正、負(fù)離子模式下的質(zhì)譜參數(shù)如下毛細(xì)管電壓為3000V，錐孔電壓為50V，離子源溫度為100°C，電噴霧氣(脫溶劑氣)溫度為350°C，電噴霧氣流量(脫溶劑氣流量)為6001/h， 錐孔氣流量為601/h，數(shù)據(jù)采集范圍在lOO-lOOOm/z。4、OPLS-DA 分析用Markerlynx將得到的總離子流圖進(jìn)行峰提取、峰匹配。提取后的數(shù)據(jù)，進(jìn)行歸一化處理，再將數(shù)據(jù)導(dǎo)入到Simca-p中進(jìn)行Pareto標(biāo)尺化處理，然后再進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)。用OPLS-DA方法對(duì)0. 5% NaCl脅迫培養(yǎng)的雪地衣藻和無NaCl脅迫的對(duì)照雪地衣藻的數(shù)據(jù)進(jìn)行建模，結(jié)果如圖1所示。據(jù)此建立的ESI正離子模式的OPLS-DA 模型(圖la)可以解釋98. 2%的分類信息，并且模型的預(yù)測(cè)能力達(dá)到91. 2%;ESI負(fù)離子模式的OPLS-DA模型(圖lb)可以解釋99. 4%的分類信息，并且模型的預(yù)測(cè)能力達(dá)到86. 2%0 圖1中，X軸方向(線性第一主成分)體現(xiàn)了組間差異，即鹽濃度對(duì)雪藻脂代謝譜的差異性影響；Y軸方向(正交第一主成分)體現(xiàn)了組內(nèi)差異，即同一鹽濃度，不同脅迫時(shí)間(lh，7h， 15h)對(duì)雪藻脂代謝譜的差異性影響。從圖1中可以看出，0. 5% NaCl脅迫的雪地衣藻和無 NaCl脅迫的對(duì)照雪地衣藻的脂代謝譜有比較顯著的區(qū)別，在圖中橫坐標(biāo)方向上有明顯的分類；對(duì)同一鹽濃度、不同脅迫時(shí)間的樣品無明顯的分類。5、OPLS-DA 模型驗(yàn)證隨機(jī)抽取由Markerlynx提取的80 %數(shù)據(jù)作為訓(xùn)練集建立OPLS-DA模型，剩下 20%數(shù)據(jù)作為預(yù)測(cè)集導(dǎo)入到所建立的模型中來評(píng)價(jià)模型的準(zhǔn)確性。由圖加和圖2b，可以看出，兩種模式所建立的模型都能正確預(yù)測(cè)未知數(shù)據(jù)的分類，故表明所建的模型未發(fā)生過擬合，是穩(wěn)健的。6、潛在脂質(zhì)生物標(biāo)志物的篩選圖3a和圖北分別表示了正、負(fù)離子模式下變量的s載荷圖和VIP值的結(jié)合圖。分別在兩個(gè)圖中篩選出變量重要因子(VIP)值> 1，同時(shí)在S載荷圖中載荷投影值置信水平 (|p(corr) ) > 0.6的化合物作為雪地衣藻適應(yīng)0. 5% NaCl的潛在脂質(zhì)生物標(biāo)志物，并對(duì)潛在標(biāo)志物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。7、標(biāo)志物的結(jié)構(gòu)鑒定
結(jié)構(gòu)鑒定的主要依據(jù)是Masslynx軟件給出的精確分子量、可能元素組成 (< IOppm)、一級(jí)質(zhì)譜母離子的保留時(shí)間以及二級(jí)質(zhì)譜(MS/MS)特征碎片離子片斷的分析而得到。表1給出了正離子模式下鑒定的14種脂質(zhì)生物標(biāo)志物，表2給出了負(fù)離子模式下鑒定的7種脂質(zhì)生物標(biāo)志物。它們是甜菜堿-1，2-二?；视?0-4 ‘ -(N，N，N-三甲基)高絲氨酸(DGTS，1， 2-diacylglyceryl-3-0-4‘ - (N, N, N-trimethyl)-homoserine)；單半乳糖二酰甘油酯(MGDG，Monogalactosyl-diacylglycerol)；雙半乳糖二酰甘油酯(DGDG，Digalactosyl-diacylglycerol)；磷脂酰乙醇胺(PE，Phosphatidylethanolamine)；磺酸基異鼠李糖基二脂酰基甘油(SQDG，sulfoquinovosyldiacylglycerol)；磷脂酰甘油(PG,Phosphatidylglycerol)；磷脂酰肌醇(PI，Phosphatidylinositiol)。表1正離子模式下鑒定的14種脂質(zhì)生物標(biāo)志物
權(quán)利要求
1.發(fā)現(xiàn)和鑒定單細(xì)胞藻類脂質(zhì)生物標(biāo)志物的方法，其特征包括下述步驟(1)單細(xì)胞藻類細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)化合物的提取和抗氧化保護(hù)；(2)用超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀分析脂質(zhì)化合物；(3)用Markerlynx軟件提取分析數(shù)據(jù)并導(dǎo)入到 Simca-p軟件中進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析；(4)對(duì)正交偏最小二乘判別模型進(jìn)行驗(yàn)證； (5)由正交偏最小二乘判別模型的結(jié)果篩選出潛在脂質(zhì)生物標(biāo)志物；(6)對(duì)潛在脂質(zhì)生物標(biāo)志物進(jìn)行結(jié)構(gòu)推斷和鑒定。
2.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于步驟(1)用甲醇-三氯甲烷-水提取液提取單細(xì)胞藻類細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)化合物，提取液中加入抗氧化劑2，6- 二叔丁基-4-甲基苯酚，提取液中甲醇、三氯甲烷、水的體積比為1:1:0.5，抗氧化劑2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚與提取液的質(zhì)量體積比為0.01%-0.05% g/ml ；樣品與提取液混合后，用振蕩器震蕩5-lOmin后，在 4-10°C下離心后取下層溶液，用氮?dú)獯蹈桑儆?. 5-lml色譜甲醇溶解；所述樣品為單細(xì)胞藻粉。
3.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于步驟(2)中采用超高效液相色譜與四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀分析脂質(zhì)化合物，超高效液相色譜方法中，流動(dòng)相A為水、異丙醇和甲酸的混合液，其中水、異丙醇的體積比為95/5 70/30，甲酸的含量始終為流動(dòng)相A的0. 1% (ν/ v);流動(dòng)相B為乙腈、異丙醇和甲酸的混合液，其中乙腈、異丙醇的體積比為95/5 70/30，甲酸的含量始終為流動(dòng)相B的0. 1% (ν/ν)；色譜柱溫為35°C -40°C，樣品室溫為4°C -10°C, 流速為0. 3-0. 4 ml/min,進(jìn)樣體積為1-5 μ 1。
4.如權(quán)利要求3所述方法，其特征在于質(zhì)譜分析過程分別采用電噴霧離子源正離子和負(fù)離子兩種模式進(jìn)行檢測(cè)；正、負(fù)離子模式下的質(zhì)譜參數(shù)如下毛細(xì)管電壓為 ^00V-3000V，錐孔電壓為40-60V，離子源溫度為95_105°C，電噴霧氣溫度為340_360°C，電噴霧氣流量為580-6201/h，錐孔氣流量為58-621/h，數(shù)據(jù)采集范圍在lOO-lOOOm/z。
5.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于步驟(3)用Markerlynx提取步驟(2)由超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀所采集到的數(shù)據(jù)，并將提取的數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，再導(dǎo)入到Simca-p軟件中進(jìn)行Pareto標(biāo)尺化處理，然后經(jīng)Pareto標(biāo)尺化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析。
6.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于步驟(4)對(duì)正交偏最小二乘判別模型進(jìn)行驗(yàn)證， 驗(yàn)證方法為隨機(jī)抽取80%由Markerlynx所提取的數(shù)據(jù)建立正交偏最小二乘判別模型，由該模型來預(yù)測(cè)剩下20%數(shù)據(jù)的分類情況。
7.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于由步驟(5)正交偏最小二乘判別分析的結(jié)果即變量重要因子值和s載荷圖，篩選出潛在的脂質(zhì)生物標(biāo)志物；其中，變量重要因子值大于1， 同時(shí)在s載荷圖中縱坐標(biāo)的絕對(duì)值即變量投影置信水平大于0. 6的化合物作為潛在的脂質(zhì)生物標(biāo)志物。
8.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于步驟(6)對(duì)潛在脂質(zhì)生物標(biāo)志物進(jìn)行結(jié)構(gòu)推斷和鑒定，其依據(jù)是Masslynx軟件給出的精確分子量、元素組成、一級(jí)質(zhì)譜母離子的保留時(shí)間以及二級(jí)質(zhì)譜特征碎片離子分析。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種發(fā)現(xiàn)和鑒定單細(xì)胞藻類脂質(zhì)生物標(biāo)志物的方法，包括下述步驟(1)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)化合物的提取和抗氧化保護(hù)；(2)超高效液相色譜/四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC/Q-TOF-MS)分析提取脂質(zhì)化合物；(3)用Markerlynx提取分析數(shù)據(jù)并導(dǎo)入到Simca-p軟件中進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)；(4)對(duì)OPLS-DA模型進(jìn)行驗(yàn)證(5)由OPLS-DA模型的結(jié)果篩選出潛在脂質(zhì)生物標(biāo)志物；(6)對(duì)潛在脂質(zhì)生物標(biāo)志物進(jìn)行結(jié)構(gòu)推斷和鑒定。本發(fā)明所建立的發(fā)現(xiàn)和鑒定單細(xì)胞藻類脂質(zhì)生物標(biāo)志物的通用技術(shù)體系，可輻射應(yīng)用到植物和微生物代謝組學(xué)分析、食品安全代謝組學(xué)分析等領(lǐng)域。
文檔編號(hào)G01N30/72GK102262139SQ20111010859
公開日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2011年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月28日
發(fā)明者呂娜, 魏東 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)