稀有細(xì)胞富集裝置的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型涉及細(xì)胞分離、檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種從細(xì)胞懸液中高回收率篩選收集稀有細(xì)胞的裝置。
【背景技術(shù)】
[0002]為了醫(yī)學(xué)診療等目的，會(huì)需要從人或動(dòng)物的血液、組織液或淋巴液，尤其是血液中篩選、分離出游離其中的特定目標(biāo)細(xì)胞，主要是病變的細(xì)胞或從病變組織、器官上脫落的細(xì)胞。經(jīng)常地，目標(biāo)細(xì)胞在在上述體液中的含量非常稀少。
[0003]例如，循環(huán)上皮細(xì)胞是存在于血液中的一種稀有細(xì)胞，從病變的上皮組織脫落，其中從良性病變組織脫落的為良性上皮細(xì)胞，從惡性病變組織(癌癥)脫落的為腫瘤細(xì)胞，其數(shù)目極其稀少，每1ml血液可能僅含幾個(gè)到幾十個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞，卻有多達(dá)約I億個(gè)白細(xì)胞和500億個(gè)紅細(xì)胞(Zhe XN,Cher ML,BonfiI RD,Am.J.Cancer Res.2011，I，740-751 )，對其檢測猶如大海撈針。除了血液之外，一些組織液中也含有從病變組織脫落的具有診療價(jià)值的細(xì)胞，如腹水、胸腔積液、腦脊液等中的腫瘤細(xì)胞。此外，孕婦外周血中也可檢測到來自胎兒的有核紅細(xì)胞，收集這些胎兒的稀有細(xì)胞能夠獲得胎兒完整的基因組，從而為產(chǎn)前診斷遺傳病提供有力的工具。
[0004]下面以血液中循環(huán)上皮細(xì)胞為例概述目前一些稀有細(xì)胞富集方法。從血液中富集循環(huán)上皮細(xì)胞的方法按照富集方式可分為正選或負(fù)選，按照富集原理可分為基于細(xì)胞表面標(biāo)志物或基于細(xì)胞的物理性質(zhì)。
[0005](I)正選+細(xì)胞表面標(biāo)志物:這一方法主要通過針對上皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物(如EpCAM，EGFR，HER2等)的抗體來富集血液中的上皮來源細(xì)胞，抗體可修飾于免疫磁球表面或微流控芯片通道表面，其中最具代表性的是已被美國FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于檢測轉(zhuǎn)移性乳腺癌、前列腺癌及結(jié)直腸癌患者外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的Cel I Search?系統(tǒng)(Cri stofani I Ii M,Budd T1Ellis MJ’et al.N.Engl.J.Med.2004,351,781-791；Riethdorf S1Fritsche Η,Muller V,et al.Clin.Cancer Res.2007,13,920-928；Cohen SJ,Punt CJA,Iannotti N,et al.J.Clin.0ncol.2008，26，3213-3221)，該系統(tǒng)運(yùn)用標(biāo)記有EpCAM抗體的磁性微球進(jìn)行血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集，但這一方法難以捕獲不表達(dá)或低表達(dá)EpCAM的上皮細(xì)胞，即使使用若干種針對不同抗原的抗體進(jìn)行聯(lián)合捕獲也依然存在上述問題。
[0006](2)正選+細(xì)胞物理性質(zhì):這一方法主要是利用腫瘤細(xì)胞與血細(xì)胞尺寸上的差異進(jìn)行富集。紅細(xì)胞明顯小于上皮來源的細(xì)胞，而白細(xì)胞雖然平均尺寸小于上皮細(xì)胞，但是數(shù)量巨大的白細(xì)胞其尺寸分布很寬，且上皮細(xì)胞尤其是腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性較大，因此部分白細(xì)胞與循環(huán)上皮細(xì)胞的尺寸存在重疊。通過這一方法分離的循環(huán)上皮細(xì)胞中往往混入大量白細(xì)胞，獲得樣本的純度很低，難以進(jìn)行后續(xù)的分子分析。同時(shí)，由于腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性，存在著一些尺寸較小的腫瘤細(xì)胞容易被漏選從而造成損失。
[0007](3)負(fù)選:這一方法主要是為解決正選難以富集到血液中全體游離的循環(huán)上皮細(xì)胞而采用的，其富集策略是將血液中已知的血細(xì)胞分步去除，從而剩下的細(xì)胞懸液中包含了我們所需要的循環(huán)上皮細(xì)胞?；镜姆椒ㄊ鞘紫韧ㄟ^密度梯度離心去除血液中的紅細(xì)胞及部分白細(xì)胞，取單個(gè)核細(xì)胞層與修飾了 CD45抗體的免疫磁球孵育(CD45是白細(xì)胞表面共同抗原)，然后通過施加磁場截留表面結(jié)合了CD45磁球的白細(xì)胞，同時(shí)收集剩余的細(xì)胞懸液，其中包含了所需要的循環(huán)上皮細(xì)胞，最后通過離心濃縮這一稀有細(xì)胞懸液并進(jìn)行后續(xù)分析。但之前的研究證實(shí)這一方法的對上皮細(xì)胞的回收率很低，因此一直不是主流的稀有細(xì)胞富集方法。
[0008]由于稀有細(xì)胞難以高收率的篩選和富集，導(dǎo)致對其檢測分析困難。因此需發(fā)展高效、快速的將稀有細(xì)胞從例如血液這類極為復(fù)雜的生物樣本中富集出來的裝置，達(dá)到回收率收集稀有細(xì)胞的目的。
【實(shí)用新型內(nèi)容】
[0009]本實(shí)用新型所要解決的正是稀有細(xì)胞負(fù)選回收率低的問題。
[0010]本實(shí)用新型的第一方面是一種稀有細(xì)胞富集裝置，其包括:細(xì)胞篩選部分，其包含形成在兩個(gè)相對表面之間的細(xì)胞篩選通道，兩個(gè)相對表面中的至少一個(gè)表面為磁性吸附表面，其中所述細(xì)胞篩選通道的厚度設(shè)置為0.1毫米至5毫米。所述裝置還包括:細(xì)胞收集部分，其包含過濾單元，其可拆卸地設(shè)置于所述細(xì)胞篩選部分的下游，以截留未被磁性吸附的稀有細(xì)胞。
[0011]根據(jù)本實(shí)用新型優(yōu)選的稀有細(xì)胞富集裝置，所述細(xì)胞篩選部分包含具有磁性吸附表面的磁性部及具有非磁性吸附表面的非磁性部，其中所述磁性吸附表面以及所述非磁性吸附表面分別構(gòu)成所述兩個(gè)相對表面中的一個(gè)，且其中沿所述細(xì)胞篩選通道內(nèi)細(xì)胞懸液的流動(dòng)方向，所述磁性部的磁性逐步增強(qiáng)，以在所述磁性吸附表面均勻吸附結(jié)合不同數(shù)量免疫磁球的所述多數(shù)細(xì)胞。
[0012]根據(jù)本實(shí)用新型進(jìn)一步優(yōu)選的稀有細(xì)胞富集裝置，所述磁性部包括內(nèi)管和容納其中的磁體，所述非磁性部為套著所述內(nèi)管的外管，所述細(xì)胞篩選通道界定在所述內(nèi)管的外表面與所述外管的內(nèi)表面之間，沿所述細(xì)胞篩選通道內(nèi)細(xì)胞懸液的流動(dòng)方向所述磁體的體積逐步增大。
[0013]根據(jù)本實(shí)用新型進(jìn)一步優(yōu)選的稀有細(xì)胞富集裝置，所述過濾單元包括具有細(xì)胞截留孔的微濾膜，該細(xì)胞截留孔的孔徑為3-8微米。
[0014]根據(jù)本實(shí)用新型進(jìn)一步優(yōu)選的稀有細(xì)胞富集裝置，所述過濾單元包括雙層結(jié)構(gòu)的濾膜，該濾膜的上層為具有微孔的微孔板，下層為具有細(xì)胞截留孔的微濾膜，所述微孔的尺寸設(shè)置為允許所述稀有細(xì)胞通過，而所述細(xì)胞截留孔的尺寸設(shè)置為不允許所述稀有細(xì)胞通過，且所述微孔的孔徑為所述細(xì)胞截留孔的5-20倍;且其中所述微濾膜的細(xì)胞截留孔位于所述微孔板的對應(yīng)微孔的下方，用以截留進(jìn)入微孔中的稀有細(xì)胞。
[0015]根據(jù)本實(shí)用新型進(jìn)一步優(yōu)選的稀有細(xì)胞富集裝置，所述細(xì)胞截留孔的孔徑為4-6微米，且所述微孔的孔徑為所述細(xì)胞截留孔的8-15倍。
[0016]根據(jù)本實(shí)用新型進(jìn)一步優(yōu)選的稀有細(xì)胞富集裝置，所述細(xì)胞篩選通道的厚度為
0.1毫米至I毫米。
[0017]當(dāng)含有目標(biāo)稀有細(xì)胞以及結(jié)合有免疫磁球的多數(shù)細(xì)胞懸液從流經(jīng)細(xì)胞篩選通道時(shí)，由于流過通道的適當(dāng)稀釋細(xì)胞懸液的液層很薄，細(xì)胞基本上以單層形式存在，表面結(jié)合磁球的細(xì)胞被吸引到磁性表面的時(shí)候不會(huì)裹挾稀有的循環(huán)上皮細(xì)胞。另外，用微濾膜截留未被吸附的稀有細(xì)胞可以提高稀有細(xì)胞回收率，克服離心濃縮稀有細(xì)胞懸液帶來的回收率底的問題。本實(shí)用新型解決了通過負(fù)選富集稀有細(xì)胞時(shí)容易導(dǎo)致稀有細(xì)胞丟失的兩個(gè)關(guān)鍵問題，因此能獲得較高的稀有細(xì)胞回收率。
【附圖說明】
[0018]圖1是根據(jù)本實(shí)用新型【具體實(shí)施方式】的稀有細(xì)胞富集裝置的原理圖；
[0019]圖2是用于本實(shí)用新型稀有細(xì)胞富集裝置的用于收集稀有細(xì)胞的雙層濾膜示意圖;及
[0020]附圖標(biāo)記的說明:1.稀有細(xì)胞富集裝置;2.磁性部;2A.內(nèi)管；2B.磁體;3.外管;4.進(jìn)樣口；5.出樣口；6.濾膜;7.集液瓶;8.抽氣口；9.填充物;及C.細(xì)胞篩選通道。
【具體實(shí)施方式】
[0021]參見圖1，它們示出了本實(shí)用新型一【具體實(shí)施方式】的稀有細(xì)胞富集裝置的原理圖和三維圖。本實(shí)用新型的稀有細(xì)胞富集裝置I具有主體部分或細(xì)胞篩選部分，其包括磁性部2和套在磁性部2外的外管3。磁性部2可包括內(nèi)管2A和容納其中的磁體2B。磁性部2的外壁與外管3的內(nèi)壁，也即