專(zhuān)利名稱(chēng)：一種體外高效提高藍(lán)藻藻膽體向光系統(tǒng)ii傳能的sgb緩沖液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藻類(lèi)生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及ー種體外高效提高藍(lán)藻藻膽體向光系統(tǒng)II反應(yīng)中心傳能的SGB緩沖液。
背景技術(shù)：
藍(lán)藻是一類(lèi)能進(jìn)行光合放氧的原核生物，也是研究光合作用的模式生物之一。電子顯微鏡的觀察結(jié)果顯示在藍(lán)藻細(xì)胞類(lèi)囊體膜上排列著數(shù)量眾多的小顆?！迥戵w， 其主要功能是捕獲光能。因此，藻膽體是藍(lán)藻細(xì)胞吸收光能，并傳遞至光系統(tǒng)反應(yīng)中心的主要入口。正常條件下，藍(lán)藻藻膽體與光系統(tǒng)II連結(jié)，把吸收的光能傳遞到光系統(tǒng)II反應(yīng)中心。由于藻膽體具有親水的屬性，因此在分離藻膽體-光系統(tǒng)II超分子復(fù)合體時(shí)常常導(dǎo)致藻膽體從光系統(tǒng)II反應(yīng)中心表面上脫落下來(lái)；即使部分保留的藻膽體-光系統(tǒng)II超分子復(fù)合體，也幾乎失去了能量傳遞(從藻膽體向光系統(tǒng)II)的生物學(xué)功能。盡管人們能夠單獨(dú)地在體外分離出完整的藻膽體(中國(guó)專(zhuān)利CN1654629A—種完整藻膽體的制備方法)和光系統(tǒng)II復(fù)合體，然而至今尚未見(jiàn)有分離出完整的、且具備高效能量傳遞功能的藻膽體-光系統(tǒng)II超分子復(fù)合體。眾所周知，合適的緩沖液是體外有效分離功能蛋白復(fù)合體所必須。目前，常規(guī)用于分離藻膽體-光系統(tǒng)II超分子復(fù)合體的緩沖液是SPC (Sucrose/phosphate/citrate) 但遺憾的是該緩沖液分離出的藻膽體_光系統(tǒng)II超分子復(fù)合體不具備高效傳遞光能的屬性。因此，為了分離出具有高效傳能的藻膽體-光系統(tǒng)II超分子復(fù)合體，必須開(kāi)發(fā)出適宜分離該超分子復(fù)合體的新型緩沖液。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提出ー種體外高效提高藍(lán)藻藻膽體向光系統(tǒng)II傳能的SGB緩沖液，這ー緩沖液的應(yīng)用不僅能增加藻膽體與光系統(tǒng)II間的連接數(shù)量，而且能大大改善體外藻膽體向光系統(tǒng)II反應(yīng)中心的傳能效率。本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下—種體外高效提高藍(lán)藻藻膽體向光系統(tǒng)II傳能的SGB緩沖液，包括以下組分O. 6-0. 9M蔗糖，O. 4-0. 6M磷酸鹽，O. 2-0. 4M檸檬酸鹽和O. 5-1. 2M甜菜堿，優(yōu)選O. 8M蔗糖，O. 5M磷酸鹽，O. 3M檸檬酸鹽和IM甜菜堿。所述磷酸鹽為磷酸ニ氫鉀、磷酸ニ氫鈉、磷酸氫ニ鉀和磷酸氫ニ鈉中的一種或兩種以上的混合物。所述檸檬酸鹽為檸檬酸三鈉和檸檬酸三鉀中的ー種或兩種的混合物。檸檬酸鹽有利于藻膽體向光系統(tǒng)II復(fù)合體的能量傳遞。進(jìn)ー步，可用堿將上述SGB緩沖液pH調(diào)節(jié)至7.0，所述堿優(yōu)選NaOH。這樣可以更好地維持體外藻膽體和光系統(tǒng)II等功能復(fù)合體的穩(wěn)定性。本發(fā)明還提供ー種藍(lán)藻藻膽體-光系統(tǒng)II的超分子復(fù)合體的制備方法，包括以下步驟(I)將收集的藍(lán)藻細(xì)胞重懸于上述SGB緩沖液中進(jìn)行破碎，破碎時(shí)間為100-500S，每次10-20s，間隔5min ；(2)在4°C、18，OOOXg條件下離心60min，獲得藻膽體和類(lèi)囊體膜的混合物；(3)用去垢劑對(duì)藻膽體和類(lèi)囊體膜的混合物進(jìn)行增溶，然后用蔗糖密度梯度離心，從而獲得藻膽體-光系統(tǒng)II的超分子復(fù)合體。所述去垢劑為體積百分比濃度為1%的Triton X-100。所述破碎和增溶在冰浴((TC )條件下進(jìn)行。本發(fā)明的SGB緩沖液與常規(guī)SPC緩沖液相比，不僅能増加藻膽體與光系統(tǒng)11間的連接數(shù)量，而且能大大改善體外藻膽體向光系統(tǒng)II的能量傳遞效率。因此，本發(fā)明將有助 于人們從生物化學(xué)、生物物理學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)等水平上研究藻膽體和光系統(tǒng)II間的相互關(guān)系，從而大幅度提高藻類(lèi)光合效率和生物量，為藻類(lèi)能源化利用提供理論基礎(chǔ)。


圖I是本發(fā)明實(shí)施例I和實(shí)施例2中所得藻膽體-光系統(tǒng)II超分子復(fù)合體的低溫?zé)晒獍l(fā)射光譜。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步說(shuō)明，其目的在于更好地理解本發(fā)明的研究?jī)?nèi)容而非限制本發(fā)明的保護(hù)范圍實(shí)施例I(I)將5g收集的藍(lán)藻細(xì)胞(A73tl=L 0-1. 2)分別重懸于15mLSPC、SGB緩沖液中，用Bead-beater (Biospec,日本)在冰浴中進(jìn)行破碎，破碎時(shí)間為100s,姆次IOs,間隔5min ；SPC緩沖液含有O. 5M蔗糖，O. 5M磷酸鹽和O. 3M檸檬酸鹽，而SGB緩沖液含有O. 8M蔗糖，O. 5M磷酸鹽，O. 3M檸檬酸鹽和IM甜菜堿，pH為7. O。(2)在4° C、18，OOOXg條件下離心60min，獲得藻膽體和類(lèi)囊體膜的混合物；(3)用lmLl% (V/V)去垢劑Triton X-100對(duì)藻膽體和類(lèi)囊體膜的混合物進(jìn)行增溶(冰浴中孵育lOmin)，然后用蔗糖密度梯度離心(4° C、150，000Xg條件下離心17h ;CP100WX,日立，日本)，從而獲得藻膽體-光系統(tǒng)II的超分子復(fù)合體，用蛋白免疫印跡和低溫(77K)熒光(F4500，日立，日本)等方法分別檢測(cè)所獲得的藻膽體-光系統(tǒng)II的超分子復(fù)合體的數(shù)量和能量傳遞效率。檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)SPC緩沖液相比，本發(fā)明SGB緩沖液増加了約2. I倍藻膽體-光系統(tǒng)II超分子復(fù)合體的數(shù)量(從該超分子復(fù)合體的條帶強(qiáng)度和蛋白免疫印跡的條帶密度進(jìn)行判斷，下同)。圖I中，曲線(xiàn)I為本實(shí)施例中用SPC緩沖液獲得的藻膽體-光系統(tǒng)II超分子復(fù)合體的77K低溫?zé)晒獍l(fā)射光譜，曲線(xiàn)2為本實(shí)施例中用SGB緩沖液獲得的藻膽體-光系統(tǒng)II超分子復(fù)合體的77K低溫?zé)晒獍l(fā)射光譜?？梢钥闯觯c常規(guī)SPC緩沖液相比，本發(fā)明SGB緩沖液提高了約2. 3倍藍(lán)藻藻膽體向光系統(tǒng)II的能量傳遞效率。
實(shí)施例2步驟(I)與實(shí)施例I的不同之處在于破碎時(shí)間為500s,姆次20s,間_ 5min ;步驟(2)和(3)與實(shí)施例I相同。檢測(cè)結(jié)果常規(guī)SPC緩沖液分離出藻膽體-光系統(tǒng)II超分子復(fù)合體的數(shù)量不到實(shí)施例I的三分之一，而本發(fā)明SGB緩沖液分尚出藻膽體_光系統(tǒng)II超分子復(fù)合體的數(shù)量與實(shí)施例I類(lèi)似。
曲線(xiàn)4為本實(shí)施例中用SPC緩沖液獲得的藻膽體-光系統(tǒng)II超分子復(fù)合體的77K低溫?zé)晒獍l(fā)射光譜，可以看出，其能量傳遞效率不到實(shí)施例I中用SPC緩沖液獲得的藻膽體-光系統(tǒng)II超分子復(fù)合體的三分之一；曲線(xiàn)3為本實(shí)施例中用SGB緩沖液獲得的藻膽體-光系統(tǒng)II超分子復(fù)合體的77K低溫?zé)晒獍l(fā)射光譜，其能量傳遞效率僅略低于與實(shí)施例I中用SGB緩沖液獲得的藻膽體-光系統(tǒng)II超分子復(fù)合體的能連傳遞效率。以上所述為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，但本發(fā)明不應(yīng)該局限于該實(shí)施例和附圖所公開(kāi)的內(nèi)容。所以凡是不脫離本發(fā)明所公開(kāi)的精神下完成的等效或修改，都落入本發(fā)明保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
1.ー種體外高效提高藍(lán)藻藻膽體向光系統(tǒng)II傳能的SGB緩沖液，包括以下組分.O. 6-0. 9M蔗糖，O. 4-0. 6M磷酸鹽，O. 2-0. 4M檸檬酸鹽和O. 5-1. 2M甜菜堿。
2.權(quán)利要求I所述的體外高效提高藍(lán)藻藻膽體向光系統(tǒng)II傳能的SGB緩沖液，其特征在于，包括以下組分0. 8M蔗糖，O. 5M磷酸鹽，O. 3M檸檬酸鹽和IM甜菜堿。
3.權(quán)利要求I或2所述的體外高效提高藍(lán)藻藻膽體向光系統(tǒng)II傳能的SGB緩沖液，其特征在于，所述磷酸鹽為磷酸ニ氫鉀、磷酸ニ氫鈉、磷酸氫ニ鉀和磷酸氫ニ鈉中的一種或兩種以上的混合物。
4.權(quán)利要求I或2所述的體外高效提高藍(lán)藻藻膽體向光系統(tǒng)II傳能的SGB緩沖液，其特征在于，所述檸檬酸鹽為檸檬酸三鈉和檸檬酸三鉀中的ー種或兩種的混合物。
5.權(quán)利要求I或2所述的體外高效提高藍(lán)藻藻膽體向光系統(tǒng)II傳能的SGB緩沖液，其特征在于，用堿將所述SGB緩沖液pH調(diào)節(jié)至7. O。
6.權(quán)利要求5所述的體外高效提高藍(lán)藻藻膽體向光系統(tǒng)II傳能的SGB緩沖液，其特征在于，所述堿為NaOH。
7.—種藍(lán)藻藻膽體-光系統(tǒng)II的超分子復(fù)合體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)將收集的藍(lán)藻細(xì)胞重懸于權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述的SGB緩沖液中進(jìn)行破碎,破碎時(shí)間為100-500s，每次10-20s,間隔5min ； (2)在4°C、18，OOOXg條件下離心60min，獲得藻膽體和類(lèi)囊體膜的混合物； (3)用去垢劑對(duì)藻膽體和類(lèi)囊體膜的混合物進(jìn)行增溶，然后用蔗糖密度梯度離心，從而獲得藻膽體-光系統(tǒng)II的超分子復(fù)合體。
8.權(quán)利要求7所述的藍(lán)藻藻膽體光系統(tǒng)II的超分子復(fù)合體的制備方法，其特征在干，所述去垢劑體積百分比濃度為1%的Triton X-100。
9.權(quán)利要求7所述的藍(lán)藻藻膽體光系統(tǒng)II的超分子復(fù)合體的制備方法，其特征在干，所述破碎和增溶在冰浴條件下進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種體外高效提高藍(lán)藻藻膽體向光系統(tǒng)II傳能的SGB緩沖液，由以下組分組成0.6-0.9M蔗糖，0.4-0.6M磷酸鹽，0.2-0.4M檸檬酸鹽和0.5-1.2M甜菜堿。與常規(guī)SPC緩沖液相比，本發(fā)明SGB緩沖液不僅增加了藻膽體與光系統(tǒng)II間的連接數(shù)量，而且大大改善了體外藻膽體向光系統(tǒng)II反應(yīng)中心的傳能效率；本發(fā)明將有助于人們從生物化學(xué)、生物物理學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)等水平上研究藻膽體和光系統(tǒng)II間的相互關(guān)系，從而大幅度提高藻類(lèi)光合效率和生物量，為藻類(lèi)能源化利用提供理論基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N1/06GK102660463SQ201210142640
公開(kāi)日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月9日
發(fā)明者王全喜, 陳李萍, 馬為民, 馬宇恒, 高復(fù)旦, 魏蘭珍 申請(qǐng)人:上海師范大學(xué)