專利名稱：基于多癌癥侵襲相關(guān)機制的生物標(biāo)記的制作方法
基于多癌癥侵襲相關(guān)機制的生物標(biāo)記相關(guān)申請的交叉引用本申請要求2010年5月28日提交的美國臨時專利申請第61/349，684號和2010年4月13日提交的美國臨時專利申請第61/323，818號的優(yōu)先權(quán)，其通過引用全文納入本文。1.引言本發(fā)明涉及以下發(fā)現(xiàn):特定差異性表達(dá)基因與癌侵襲相關(guān)，如原發(fā)性腫瘤的某些細(xì)胞在轉(zhuǎn)移的初始階段中侵入相鄰結(jié)締組織。此活性的根本生物機制在癌癥發(fā)展進(jìn)程中發(fā)生并標(biāo)志獲得與轉(zhuǎn)移癌相關(guān)的運動性和侵襲性。因此，鑒定與該機制相關(guān)的生物標(biāo)記如本文公開的特定差異性表達(dá)基因，能用于診斷具體癌癥并進(jìn)行分期，用于監(jiān)控癌癥發(fā)展/消退，用于開發(fā)療法，和用于預(yù)測某些治療策略的適宜性。2.
背景技術(shù)：
據(jù)推測癌侵襲與改變的蛋白質(zhì)水解環(huán)境相關(guān)(Kessenbrock K, Cell2010; 141:52-67)且可包括活化成纖維細(xì)胞的出現(xiàn)。腫瘤的“促纖維形成”間質(zhì)中存在活化成纖維細(xì)胞稱為“癌相關(guān)成纖維細(xì)胞”(CAF)，似乎是癌侵襲的根本生物機制的一部分。如本申請所概括，看來特異性涉及此轉(zhuǎn)移相關(guān)纖維成形性反應(yīng)的特定CAF亞組在本文中稱為“轉(zhuǎn)移相關(guān)成纖維細(xì)胞”(MAF)。因此，與所述MAF相關(guān)的對應(yīng)基因表達(dá)特征和生物機制在本文中分別稱為“MAF特征”和“MAF機制”。目前對鑒定癌侵襲和隨后轉(zhuǎn)移的根本生物機制有極大興趣，本發(fā)明即針對此問題。3.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及構(gòu)成轉(zhuǎn)移相關(guān)成纖維細(xì)胞(“MAF”)特征的生物標(biāo)記和其在診斷多種癌癥并進(jìn)行分期中的應(yīng)用。這至少部分基于以下發(fā)現(xiàn):鑒定某些基因的差異表達(dá)指示有高度特異性的多種癌癥的診斷和/或分期。因此，在多個實施方式中，本發(fā)明提供診斷、診斷試劑盒的方法以及包括評價對象生物標(biāo)記狀態(tài)的治療方法。本發(fā)明進(jìn)一步部分基于以下發(fā)現(xiàn):由于某些基因的差異表達(dá)能就侵襲潛力獲得起標(biāo)記作用，這類表達(dá)概況可用于篩選能抑制轉(zhuǎn)移潛力獲得的治療。因此，在多個實施方式中，本發(fā)明提供就抗侵襲和/或抗轉(zhuǎn)移特性篩選治療以及篩選試劑盒的方法。在某些實施方式中，本發(fā)明針對診斷對象中侵襲癌的方法，所述方法包括測定對象樣品中COLlIAl基因產(chǎn)物相對于正常對象的表達(dá)水平，其中COLlIAl基因產(chǎn)物過表達(dá)指示所述對象有侵入性癌。在某些實施方式中，本發(fā)明針對診斷對象中侵入性癌的方法，所述方法包括測定對象樣品中以下基因產(chǎn)物相對于正常對象的表達(dá)水平:至少一種選自C0L11A1、C0L10A1、C0L5A1、C0L5A2、COLlAl 和 C0L1A2 的基因產(chǎn)物，以及至少一種選自 THBS2、INHBA、VCAN、FAP、MMPl1、POSTN、ADAMl2, LOX、FNl和SNAI2的基因產(chǎn)物，其中所述基因產(chǎn)物的過表達(dá)指示所述對象有侵入性癌。在某些實施方式中，表達(dá)水平由包含加工樣品從而裂解該樣品中細(xì)胞的方法測定。在某些這類實施方式中， 所述方法包括至少部分純化細(xì)胞基因產(chǎn)物并使所述蛋白暴露于檢測劑的額外步驟。在某些這類實施方式中，所述方法包括至少部分純化細(xì)胞核酸并使所述核酸暴露于檢測劑的額外步驟。在某些這類實施方式中，所述方法包括測定SNAIl表達(dá)水平的額外步驟，其中SNAIl未過表達(dá)而其他基因產(chǎn)物過表達(dá)的測定結(jié)果指示所述對象有侵入性癌。在某些實施方式中，本發(fā)明針對治療對象的方法，所述方法包括進(jìn)行鑒定MAF特征的上述診斷方法，建議患者進(jìn)行影像學(xué)方法。在某些這類實施方式中，鑒定MAF特征后建議患者不進(jìn)行新輔助治療。在某些這類實施方式中，鑒定MAF特征后建議患者改變其目前治療方案。在某些實施方式中，本發(fā)明針對鑒定抑制對象中癌侵襲的試劑的方法，所述方法包括使測試劑接觸表達(dá)成纖維細(xì)胞特征相關(guān)轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞，其中如果所述測試劑降低基因在該特征中的過表達(dá)，則該測試劑可用作抑制癌侵襲的治療劑。在某些實施方式中，所述方法使用的轉(zhuǎn)移相關(guān)成纖維細(xì)胞特征包括至少一種選自以下基因產(chǎn)物的過表達(dá):C0L11A1、COLIOAKC0L5AKC0L5A2,COLIAI 和 C0L1A2 的基因產(chǎn)物，以及至少一種選自 THBS2、INHBA、VCAN、FAP、MMP11、P0STN、ADAM12、L0X、FN1 和 SNAI2 的基因產(chǎn)物。在某些實施方式中，本發(fā)明涉及試劑盒，所述試劑盒包括:(a)能與轉(zhuǎn)移相關(guān)成纖維細(xì)胞特征基因產(chǎn)物特異性相互作用的標(biāo)記報道分子；(b)對照或校準(zhǔn)試劑，和(C)描述使用試劑盒方式的說明書。在某些實施方式中，本發(fā)明涉及試劑盒，所述試劑盒包括:(a)包含與轉(zhuǎn)移相關(guān)成纖維細(xì)胞特征抗原特異性相互作用的抗體的偶聯(lián)物，所述抗原結(jié)合于能產(chǎn)生可檢測信號的信號生成化合物；(b)對照或校準(zhǔn)試劑，和(C)描述使用試劑盒方式的說明書。在某些這類實施方式中，本發(fā)明針對包含以下的試劑盒:轉(zhuǎn)移相關(guān)成纖維細(xì)胞特征抗原特異性抗體，其中由所述抗體結(jié)合的轉(zhuǎn)移相關(guān)成纖維細(xì)胞特征抗原包括或衍生自一種或多種下列基因編碼的蛋白:C0L11A1、C0L10A1、C0L5A1、C0L5A2、COLlAU C0L1A2、THBS2、INHBA、VCAN、FAP、MMPl1、POSTN、ADAM12、LOX、FNl 和 SNAI2。在某些實施方式中，本發(fā)明試劑盒，所述試劑盒包括:(a)能與轉(zhuǎn)移相關(guān)成纖維細(xì)胞特征核酸雜交的核酸；(b)對照或校準(zhǔn)試劑，和(C)描述使用試劑盒方式的說明書。在某些這類實施方式中，所述試劑盒包括:(a)核酸序列，所述序列包括:(i)與轉(zhuǎn)移相關(guān)成纖維細(xì)胞特征核酸特異性雜交的靶標(biāo)特異性序列，和(ii)檢測標(biāo)記；(b)引物核酸序列；(c)指示擴增的核酸指示物；和(d)描述使用試劑盒方式的說明書。在某些這類實施方式中，本發(fā)明涉及的試劑盒包括與轉(zhuǎn)移相關(guān)成纖維細(xì)胞特征核酸特異性雜交的核酸，所述核酸包括或衍生自下列基因之一:C0L11A1、C0L10A1、C0L5A1、C0L5A2、COLlAl、C0L1A2、THBS2、INHBA、VCAN, FAP, MMPl K POSTN, ADAMl2, LOX, FNl 和 SNAI2。4.附圖簡要說明

圖1:描述本發(fā)明具體、非限制性實施方式的一般步驟。圖2:使用表型分期閾值IIIc期轉(zhuǎn)化就TCGA卵巢癌數(shù)據(jù)集中基因C0L11A1評價EVA指標(biāo)。圖3:描述EVA算法的低復(fù)雜度說明。圖4:實施例所述機械無偏性(僅取決于表型)算法的偽碼。5.發(fā)明詳述 5.1MAF特征的鑒定
一個關(guān)于嚴(yán)重乳頭狀卵巢癌的研究(Bignotti E, Am J Obstet Gynecol2007; 196:245 el-11)比較了 14個網(wǎng)膜原發(fā)性腫瘤樣品和17個網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移性腫瘤樣品的基因表達(dá)概況，鑒定156個差異表達(dá)的基因。為研究這些基因在獨立的豐富數(shù)據(jù)集中的顯著性，僅使用這156個基因?qū)Π┌Y基因組圖譜(TCGA)基因表達(dá)數(shù)據(jù)集進(jìn)行分層聚類，所述數(shù)據(jù)集由含精確分期信息的377個卵巢癌樣品組成。得到的熱圖顯示94個樣品中約100個高度過表達(dá)基因的顯著“紅色方塊”，來自IIIb和以下分期腫瘤的41個樣品中沒有一個在所述94個“紅色方塊”樣品內(nèi)(P=4X 10-6)，與這些基因的協(xié)調(diào)過表達(dá)一致，指示腫瘤發(fā)展到至少IIIc期。為測定此反應(yīng)是否在其他癌癥中由基因表現(xiàn)，開發(fā)了一種以無偏方式鑒定與具體表型(如轉(zhuǎn)變到特定分期)相關(guān)的協(xié)調(diào)過表達(dá)基因的計算技術(shù)。結(jié)果一致地“再發(fā)現(xiàn)”過表達(dá)基因的相同“核心”特征。發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象在多種癌癥中出現(xiàn)，所述癌癥各自有其潛在涉及額外基因的特征，但共有核心特征。在某些實施方式中，本發(fā)明涉及在基因具有其極端(在大部分情況下最大)值時(但不是沒有其他)通過關(guān)注與二元(“低期”相比“高期”)表型相關(guān)的基因簇而鑒定MAF特征(低/高分期的具體閾值取決于具體癌癥類型)，包括首先開發(fā)基因和表型間關(guān)聯(lián)的特殊量度，稱為“極值關(guān)聯(lián)”(EVA)。簡言之，EVA指標(biāo)是具有最高基因表達(dá)值的所有樣品子集中偏向性部分的最小P值。換言之，假設(shè)總共有M個樣品，其中N個是“低期”且M-N個是“高期”，選擇有最聞基因表達(dá)值的m個樣品。假定基因表達(dá)值與表型不相關(guān)，所選m個樣品中有最多η個“低期”樣品的概率由累積超幾何概率h(x彡n;M，N，m)給出。隨后，EVA指標(biāo)等于-1ogltl (所有可能的η值中這些概率的最小值)。例如，假設(shè)就總共300個樣品而言，有250個高期樣品和50個低期樣品。此外，假設(shè)有特定基因最高值的100個樣品包含99個高期樣品和I個低期樣品。在此情況中，可用MATLAB函數(shù)hypercdf (1，300, 50, 100) =5 X IO^9評估h (X彡I; 300，50，100)，得到該基因的EVA指標(biāo)為至少-1og10 (5 X 10_9) =8.3，例如若第101個樣品還是高期，則所述基因的EVA指標(biāo)會甚至更高。應(yīng)注意一旦達(dá)到最高值，剩余樣品的分選排列不相關(guān)，反映了僅極值與表型相關(guān)的假設(shè)。圖2顯示C0L11A1基因的累積超幾何概率值，使用TCGA卵巢癌數(shù)據(jù)集和IIIb和IIIc之間的分期閾值:m=133時產(chǎn)生最大值(8.31)。事實上，有最高C0L11A1表達(dá)的所有133個樣品處于IIIc或IV期。然后開發(fā)了機械無偏性(僅取決于表型)算法，就多種標(biāo)記“高期”或“低期”的樣品給定基因表達(dá)數(shù)據(jù)集時，所述算法可選擇僅在高期樣品中協(xié)調(diào)過表達(dá)的基因。首先根據(jù)EVA指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)選擇排列最高的前100個基因。僅使用此基因集，用間隙統(tǒng)計進(jìn)行k-均值聚類(Tibshirani R, J R Statist Soc B 63:411-423)。此步驟中，如果基因確實協(xié)調(diào)過表達(dá)，其會在熱圖上良好排列。這導(dǎo)致選擇與高/低期表型最相關(guān)的類群所屬樣品-此集合稱為“基于EVA的樣品”。該類群中的幾乎所有樣品超過MAF分期閾值，僅很少的例外可能是由于誤診。其次，定義“干凈”MAF表型，對比(a) “基于EVA”和“高期”的樣品與(b) “非基于EVA”和“低期”的樣品。如果樣 品數(shù)目足夠大，此“干凈”表型提供可鑒定與觀察到的侵襲現(xiàn)象和/或轉(zhuǎn)移相關(guān)協(xié)調(diào)過表達(dá)最相關(guān)的基因的最靈敏方法。然后用異方差t檢驗通過“干凈”表型來排列基因并計算其多重檢驗校正P值，選擇邦弗倫尼校正(Bonferronicorrection)后P〈10_3的基因。最后，發(fā)現(xiàn)這些選定基因集在所有癌表達(dá)數(shù)據(jù)集上的交叉并根據(jù)倍數(shù)變化對其進(jìn)行排列。
對于有η個樣品和m個探針組的數(shù)據(jù)集，EVA算法計算η X m累積超幾何分布概率。這可能在計算上相當(dāng)密集，因此設(shè)計了低復(fù)雜度實現(xiàn)算法以隨著EVA算法推進(jìn)而動態(tài)“建立”各探針組的累積超幾何分布，如下所詳述。給定有高期樣品和b_低期樣品的數(shù)據(jù)集，構(gòu)建了對應(yīng)所有可能樣品子集的超幾何概率的(a+1) X (b+1)表。然后，對于各探針組，根據(jù)所述探針組的表達(dá)值來分選樣品。此排序廣生從左下角到右上角穿過表格的路徑，就各樣品而目向上或向右移動。此路徑的每一步驟中，遇到所觀察數(shù)目或更多高期樣品的累積概率計算是通過對當(dāng)前細(xì)胞沿對角線向下和向右的入口求和，包括當(dāng)前細(xì)胞本身。圖3所示的直觀示例最佳展示了所述算法，其中數(shù)據(jù)集共有3個低期樣品和5個高期樣品。各探針組產(chǎn)生穿過此表格的路徑，示例路徑在此以灰色顯示。I對應(yīng)高期樣品且O對應(yīng)低期樣品，此示例探針集產(chǎn)生路徑111001011。就對應(yīng)于子路徑111001的藍(lán)色細(xì)胞而言，遇到這許多或更多高期樣品的概率通過對所述藍(lán)色細(xì)胞沿對角線向下和向右的3個概率求和(包括其本身)來計算。此情況中，所述概率相當(dāng)高(82.2%)。對沿著路徑的每一步計算此累積概率，這些的最小值是EVA算法的輸出。在某些實施方式中，本發(fā)明針對與癌侵襲和/或MAF出現(xiàn)相關(guān)的生物標(biāo)記特征。本文所用的術(shù)語侵襲和侵襲性涉及轉(zhuǎn)移的初始階段，其中特定癌癥的發(fā)生浸潤局部組織且該癌癥開始擴散。在本發(fā)明的某些實施方式中，侵襲和/或MAF出現(xiàn)的生物標(biāo)記特征包括COLlIAl的過表達(dá)。在某些實施方式中，侵襲和/或MAF出現(xiàn)的生物標(biāo)記特征包括COLlIAl和INHBA的過表達(dá)。在某些實施方式中，侵襲和/或MAF出現(xiàn)的生物標(biāo)記特征包括COLlIAl和THBS2的過表達(dá)。在某些實施方式中，侵襲和/或MAF出現(xiàn)的生物標(biāo)記特征包括C0L11A1、INHBA和THBS2的過表達(dá)。

在某些實施方式中，侵襲和/或MAF出現(xiàn)的生物標(biāo)記特征包括過表達(dá)至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種、或至少五種、或至少所有六種下列蛋白:C0L11A1 (優(yōu)選)，C0L10A1, C0L5A1, C0L5A2, COLlAl 和 C0L1A2。在某些實施方式中，侵襲和/或MAF出現(xiàn)的生物標(biāo)記特征包括過表達(dá)至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種、或至少五種、或至少所有六種下列蛋白:C0L11A1 (優(yōu)選)，C0L10A1, C0L5A1, C0L5A2, COLlAl和C0L1A2 ；以及下列一種或更多或者兩種或更多或者三種或更多:THBS2 (優(yōu)選)，INHBA (優(yōu)選)，VCAN, FAP, MMPl 1，POSTN, ADAMl2, LOX, FNl 和SNAI2。在某些實施方式中，侵襲和/或MAF出現(xiàn)的生物標(biāo)記特征包括過表達(dá)至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種、或至少五種、或至少六種下列蛋白:C0L11A1 (優(yōu)選)，C0L10A1, C0L5A1, C0L5A2, COLlAl和C0L1A2 ；以及下列一種或更多或者兩種或更多或者三種或更多:THBS2 (優(yōu)選)，INHBA (優(yōu)選)，VCAN, FAP, MMPl 1，POSTN, ADAMl2, LOX, FNl, SNA12 ;以及SNAIl表達(dá)未顯著改變時(如在某些非限制性實施方式中，SNAIl基因甲基化)。在本發(fā)明的一個特定非限制性實施方式中，C0L11A1、THBS2和INHBA但不是SNAIl的過表達(dá)指示侵襲進(jìn)展。在某些實施方式中，侵襲和/或MAF出現(xiàn)的生物標(biāo)記特征包括過表達(dá)COLlIAl、INHBA和THBS2中的一種、兩種、或所有三種以及差異性表達(dá)一種或多種選自下組的miRNA:hsa-miR-22;hsa-miR-514-l/hsa-miR-514_2|hsa-miR-514-3;hsa-miR-152;hsa-miR-508;hsa-miR-509-l/hsa-miR-509-2/hsa-miR-509_3;hsa-miR-507;hsa-miR-509-l/hsa_miR-509-2;hsa-miR-506;hsa-miR-509-3;hsa-miR-214;hsa-miR-510;hsa-miR-199a-l/hsa_miR199a_2;hsa-miR-21;hsa_miR-513c;和 hsa_miR-199b。在某些實施方式中，侵襲和/或MAF出現(xiàn)的生物標(biāo)記特征包括過表達(dá)COLlIAl、INHBA和THBS2的一種、兩種、或所有三種以及差異性甲基化一種或多種選自下組的基因:PRAME;SNAII;KRT7;RASSF5;FLJ14816;PPL;CXCR6;SLC12A8;NFATC2;H0M-TES-103;ZNF556;OCIAD2;APS;MGC9712;SLC1A2;HAK;C3orfl8;GMPR;和 C0R06。不受理論約束，認(rèn)為排序靠前的基因提示MAF特征的一個特性是基于激活素信號傳導(dǎo)的成纖維細(xì)胞活化。認(rèn)為所述信號傳導(dǎo)產(chǎn)生某些改變的蛋白質(zhì)水解形式，最終使得環(huán)境富集膠原 COLlIAl、C0L10A1、C0L5A1、C0L5A2、COLIAUP / 或 C0L1A2。MAF 特征中存在的其他相關(guān)基因是金屬蛋·白酶-3 (TIMP3)、溶基質(zhì)素-3 (MMPll)和鈣粘附蛋白_11 (CDHll)的組織抑制劑。盡管包括miRNA和甲基化基因在內(nèi)的各MAF特征分子如SNAIl能用作潛在治療靶標(biāo)，認(rèn)為激活素信號傳導(dǎo)在MAF機制中起作用的情況表明卵泡抑素(激活素結(jié)合蛋白)能用作侵襲和/或轉(zhuǎn)移抑制劑，這正是近期研究(Talmadge JE1Clin Cancer Res2008; 14:624-6;Ogino H, Clin Cancer Res 2008; 14:660-7)就單獨癌癥類型方面顯示的內(nèi)容。另一種方法是使用間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化(MET)介質(zhì)如基因TCF21，已知TCF21在數(shù)個單獨癌癥類型中沉默。由于數(shù)種原因尚未發(fā)現(xiàn)MAF特征為多癌癥侵襲和/或轉(zhuǎn)移相關(guān)特征，盡管已發(fā)表了數(shù)個與特定癌癥相關(guān)的其他部分重疊特征。首先，這些其他特征各缺乏精確表型定義，認(rèn)識到所述特征僅在超過具體分期的腫瘤亞組中存在。確實，如果卵巢癌的表型閾值設(shè)為II期-1II期或III期-1V期，而不是IIIb期-1IlC期，所述特征會不明顯。甚至可能(見下)錯誤選擇表型閾值會產(chǎn)生反向結(jié)果。第二，各癌癥類型在MAF特征以外具有其自身其他特征。例如，卵巢癌中伴隨著基因C0LEC11、PEG3和TSPAN8的大幅下調(diào)，而在其他癌癥中不是如此。實際上，本發(fā)明的一個實施方式是鑒定共同的多癌癥“核心”特征，從中能更容易鑒定通用侵襲和/或轉(zhuǎn)移相關(guān)生物機制。第三，也是最重要的一點，MAF特征經(jīng)間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化(MET)或通過MAF細(xì)胞凋亡而潛在可逆。例如(Ellsworth RE, Clin Exp Metastasis2009;26:205-13),比較轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)樣品與其對應(yīng)原發(fā)性乳腺癌樣品，發(fā)現(xiàn)C0L11A1在原發(fā)性腫瘤樣品中的表達(dá)高許多。這種反向結(jié)果可能阻礙數(shù)據(jù)分析。MAF特征的潛在可逆性強調(diào)了所述特征是動態(tài)過程的一部分且也許所有侵入性和/或轉(zhuǎn)移性樣品在某一時刻但僅暫時在此，這解釋了為何只在其子集中觀察到。已認(rèn)識到“盡管難以證明，所有癌細(xì)胞類型必需經(jīng)歷部分或完整EMT以變?yōu)檫\動和侵入型是合理的(Weinberg RA.紐約加蘭科學(xué)出版社(New York:Garland Science) ; 2007)第 600 頁”。這特別令人興奮，因為靶向MAF機制的任何抑制侵襲和/或轉(zhuǎn)移的治療干預(yù)廣泛應(yīng)用于跨不同癌癥類型的轉(zhuǎn)移前腫瘤，其直到本公開前還是未實現(xiàn)的目標(biāo)。因此，通過計算分析公開可用的生物信息，系統(tǒng)生物學(xué)揭示了多癌癥侵襲相關(guān)基因表達(dá)特征的核心，且多癌癥轉(zhuǎn)移相關(guān)特征可產(chǎn)生臨床應(yīng)用，如抑制侵襲和/或轉(zhuǎn)移的治療。在不久的將來，有大量額外信息可用，包括下一代測序、用于多種癌癥的miRNA和甲基化信息，可在此工作上建立其他令人振奮的計算研究并闡明相應(yīng)復(fù)雜生物過程的細(xì)節(jié)。5.2使用MAF特征的試驗本文所述發(fā)現(xiàn)的直接臨床應(yīng)用涉及開發(fā)高特異性侵襲和/或轉(zhuǎn)移感測生物標(biāo)記試驗方法。在某些實施方式中，所述試驗方法包括但不限于:核酸擴增試驗；核酸雜交試驗；和蛋白檢測試驗。在某些實施方式中，本發(fā)明的試驗包括這些檢測技術(shù)的組合，例如但不限于:使用擴增和雜交以檢測基因在核酸水平表達(dá)變化的試驗，如過表達(dá)或表達(dá)降低；檢測基因在蛋白水平表達(dá)變化的免疫試驗；以及包含基于核酸的檢測步驟和基于蛋白的檢測步驟的組合試驗。本文所用的“過表達(dá)”指基因產(chǎn)物表達(dá)相對于正常或?qū)φ罩翟黾?，在非限制性實施方式中，增加至少約30%或至少約40%或至少約50%、或至少約100%、或至少約200%、或至少約300%、或至少約400%、或至少約500%、或至少約1000%。本文所用的“表達(dá)降低”指基因產(chǎn)物表達(dá)相對于正常或?qū)φ罩禍p少，在非限制性實施方式中，減少至少約30%或至少約40%或至少約50%、至少約90%，或減少到用常規(guī)方法基本無法檢測的表達(dá)水平。本文所用的“基因產(chǎn)物”指基因轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的任何產(chǎn)物。因此，基因產(chǎn)物包括但不限于mRNA前體、mRNA和蛋白。在某些實施方式中，本發(fā)明提供組合物和方法以檢測指示樣品中所有或部分MAF特征的基因表達(dá)，使用基于核酸雜交和/或擴展的試驗。在非限制性實施方式中，上述MAF特征內(nèi)的基因/蛋白構(gòu)成給定試驗中評估的至少10%、或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%的基因/蛋白。在某些實施方式中，本發(fā)明提供用核酸雜交試驗檢測指示樣品中所有或部分MAF特征的基因表達(dá)的組合物和方法，其中來自所述樣品或其擴增產(chǎn)物的核酸與一種或多種核酸探針序列的陣列雜交。在某些實施方式中，“陣列”包括支持物，優(yōu)選固體，一種或多種核酸探針結(jié)合支持物。優(yōu)選的陣列通常包括多種在不同已知位置偶聯(lián)底物表面的不同核酸探針。這些陣列也描述為“微陣列”或“芯片”，在本領(lǐng)域中已有普遍描述，例如美國專利號5，143，854，5，445，934，5，744，305，5，677，195，5，800，992，6，040，193，5，424，186 和 Fodor等，Science, 251:767-777 (1991)。陣列一般可用多種技術(shù)生成，如機械合成方法或組合光刻法與固相合成法的光引導(dǎo)合成方法。用機械合成方法合成這些陣列的技術(shù)描述于例如美國專利號5，384，261和6，040，193，所述專利通過引用全文納入本文以用于所有目的。盡管優(yōu)選平面陣列，但陣列可在幾乎任何表面或甚至多重表面上制造。陣列可以是珠、凝膠、聚合物表面、纖維如光纖、玻璃或任何其他合適基底上的核酸。參見美國專利號5，770，358，5，789，162，5，708，153，6，040，193 和 5，800，992。在某些實施方式中，本發(fā)明的陣列可以某種方式包裝，從而允許診斷、預(yù)后、和/或預(yù)測應(yīng)用或者可以是包括一切的裝置；例如美國專利號5，856，174和5，922，591。在某些實施方式中，本發(fā)明的雜交試驗包括引物延伸步驟。從固體支持物延伸引物的方法公開于例如美國專利號5，54 7，839和6，770，751。另外，用引物延伸對樣品進(jìn)行基因分型的方法公開于例如美國專利號5，888，819和5，981，176。
在某些實施方式中，檢測樣品中所有或部分MAF特征的方法包括基于核酸擴增的試驗。在某些實施方式中，所述試驗包括但不限于:實時PCR(例如參見 Mackay, Clin.Microbiol.1nfect.10(3):190-212, 2004)，鏈置換擴增(SDA)(例如參見 Jolley 和 Nasir, Comb.Chem.High Throughput Screen (《高通量篩選》).6 (3): 235-44, 2003)，再生式序列復(fù)制反應(yīng)(3SR)(例如參見Mueller等,Histochem.Cell.Biol.108(4-5):431-7, 1997)，連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)(例如參見 Laffler 等，Ann.Biol.Clin.(Paris).51 (9):821-6, 1993)，轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增(TMA)(例如參見 Prince 等，J.Viral Hepat.11(3): 236-42，2004)，或基于核酸序列的擴增(NASBA)(例如參見 Romano等，Clin.Lab.Med.16(1):89-103, 1996)。在本發(fā)明的某些實施方式中，基于PCR的試驗例如但不限于實時PCR，用于檢測測試樣品中MAF特征的存在。在某些實施方式中，MAF特征特異性PCR引物組用于擴增MAF特征相關(guān)RNA和/或DNA靶標(biāo)。這些靶標(biāo)的信號能用例如熒光標(biāo)記探針產(chǎn)生。沒有這些靶序列時，在某些實施方式中，熒光團(tuán)的熒光發(fā)射可通過同樣操作性連接探針核酸的淬滅分子來消除。然而，存在靶序列時，探針在引物延伸步驟中結(jié)合模板鏈且催化引物延伸步驟的聚合酶的核酸酶活性使熒光團(tuán)釋放并生成檢測信號，因為熒光團(tuán)不再連接淬滅分子。(綜述參見 Bustin, J.Mol.Endocrinol 25，169 - 193 (2000))。選擇熒光團(tuán)(例如 FAM,TET 或 Cy5)和對應(yīng)淬滅分子(例如BHQl或BHQ2)在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)且特異性標(biāo)記試劑盒市售可得。在某些實施方式中，本發(fā)明通過檢測感興趣基因編碼的一種或多種蛋白濃度變化，提供檢測指示樣品中所有或部分MAF特征的基因表達(dá)的組合物和方法。在某些實施方式中，本發(fā)明涉及通過檢測感興趣基因編碼的蛋白濃度變化，使用免疫試驗檢測基因表達(dá)調(diào)節(jié)。本領(lǐng)域已知多種技術(shù)用于經(jīng)免疫試驗檢測蛋白表達(dá)變化。(參見The Immunoassay Handbook (《免疫測定手冊》)，第2版,David Wild編,倫敦自然出版集團(tuán)(Nature Publis hing Group) 2001。)在某些這類免疫試驗中，能與感興趣蛋白如MAF特征的個體成員特異性相互反應(yīng)的抗體試劑共價或非共價結(jié)合固相。共價結(jié)合的連接劑已知且可以是固相一部分或在包被前對其衍生。免疫試驗所用固相的示例是多孔和非多孔材料、膠乳粒子、磁性粒子、微粒、條、珠、膜、微量滴定孔和塑料管。固相材料的選擇和標(biāo)記抗體試劑的方法根據(jù)所需試驗形式運行特性測定。對于一些免疫試驗，不需要標(biāo)記，然而在某些實施方式中，免疫試驗所用的抗體試劑結(jié)合信號生成化合物或“標(biāo)記”。此信號生成化合物或“標(biāo)記”本身可檢測或可與一種或多種其他化合物反應(yīng)以產(chǎn)生可檢測產(chǎn)物(也參見美國專利號6，395，472B1)。這種信號生成化合物的示例包括發(fā)色團(tuán)、放射性同位素(例如1251、1311、32P、3H、35S和14C)、熒光化合物(例如熒光素和若丹明)、化學(xué)發(fā)光化合物、粒子(可見或熒光)、核酸、絡(luò)合劑、或催化劑如酶(例如堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、辣根過氧化物酶、β -半乳糖苷酶和核糖核酸酶)。在酶應(yīng)用的情況中，添加顯色、突光或產(chǎn)生能量(lumo-genic)底物可生成檢測信號。其他檢測系統(tǒng)如時間分辨熒光、內(nèi)反射熒光、擴增(例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))和拉曼光譜也用于本發(fā)明方法。根據(jù)本文所述試驗方法之一來自待測試對象的“樣品”可以是至少一部分組織、至少一部分腫瘤、細(xì)胞、細(xì)胞集合、或液體(例如血液、腦脊液、尿液、表達(dá)的前列腺液、腹膜液、胸膜積液、腹膜液等)。在某些實施方式中，與本發(fā)明試驗相關(guān)使用的樣品將通過活檢獲得。通過開放或經(jīng)皮技術(shù)完成活檢。開放性活檢用手術(shù)刀常規(guī)進(jìn)行并可包括移除完整腫瘤塊(切除活檢)或部分腫瘤塊(切開活檢)。相反，經(jīng)皮活檢通常用類似針的設(shè)備摸索或由成像裝置輔助進(jìn)行，且可以是細(xì)針抽吸(FNA)或核心活檢。FNA活檢中，獲得個體細(xì)胞或細(xì)胞簇用于細(xì)胞學(xué)檢測。核心活檢中，獲得組織核心或片段用于組織學(xué)檢測，可經(jīng)冷凍切片或石蠟切片完成。在本發(fā)明的某些實施方式中，本文所述試驗方法可用于檢測癌癥中MAF特征的存在。在某些實施方式中，所述癌癥可包括涉及實體瘤出現(xiàn)的癌癥。在某些實施方式中，所述癌癥可包括上皮癌。在某些實施方式中，所述癌癥可包括例如但不限于卵巢癌、胃癌、胰腺癌、十二指腸癌、肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、陰道癌、宮頸癌、前列腺癌、肺癌、睪丸癌、口腔癌、食道癌以及神經(jīng)母細(xì)胞瘤和尤文氏肉瘤。在某些實施方式中，本發(fā)明針對能診斷、預(yù)后和/或預(yù)測應(yīng)用MAF特征的試驗方法。例如但不限于，本文所述試驗方法可用于診斷背景，如侵入性癌可通過檢測樣品中所有或部分MAF特征來診斷。在某些非限制性實施方式中，本文所述試驗方法可用于預(yù)后背景，如檢測所有或部分MAF特征能評價未來轉(zhuǎn)移的可能性，包括尚未鑒定所述轉(zhuǎn)移的那些情況。在某些非限制性實施方式中，本文所述試驗方法可用于預(yù)測背景，如檢測所有或部分MAF特征能評價某些治療類型的可能益處，例如但不限于新輔助治療、手術(shù)切除、和/或化療。在某些非限制性實施方式中，本發(fā)明的標(biāo)記物和試驗方法可用于測定對象中的癌癥是否發(fā)展到侵入性和/或轉(zhuǎn)移形式，或消退(例如響應(yīng)治療)。在某些非限制性實施方式中，本發(fā)明的標(biāo)記物和試驗方法可用于對癌癥分期(其中臨床分期考慮是否發(fā)生侵襲)。由于MAF特征在多種癌癥中作為某些癌癥不同分期出現(xiàn)的侵襲標(biāo)記而存在，所述多癌癥分期是可能的。例如，在某些實施方式中，本發(fā)明的標(biāo)記物和試驗方法可用于對選自乳腺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌和神經(jīng)母細(xì)胞瘤的癌癥分期。在某些實施方式中，本發(fā)明的標(biāo)記物和試驗方法可用于鑒定原位乳腺癌何時達(dá)到I期。在某些實施方式中，本發(fā)明的標(biāo)記物和試驗方法可用于鑒定卵巢癌何時達(dá)到III期，更特定是IIIc期。在某些實施方式中，本發(fā)明的標(biāo)記物和試驗方法可用于鑒定結(jié)直腸癌何時達(dá)到II期。在某些實施方式中，本發(fā)明的標(biāo)記物和試驗方法可用于鑒定神經(jīng)母細(xì)胞瘤何時發(fā)展超越I期。在某些非限制性實施方式中，本發(fā)明的標(biāo)記物和試驗方法可用于預(yù)測診斷患有癌癥對象中的藥物反應(yīng)，所述癌癥例如但不限于上皮癌，至少一部分MAF特征先前鑒定為與乳腺癌中耐受新輔助化療相關(guān)(Farmer P, NatMed 2009; 15:68-74)。然而，由于MAF特征的多癌癥相關(guān)性(直到提交本發(fā)明才得以理解)，本發(fā)明的某些實施方式涉及利用MAF特征的存在以預(yù)測診斷有上皮癌對象中的藥物反應(yīng)，所述上皮癌選自卵巢癌、胃癌、胰腺癌、十二指腸癌、肝癌、結(jié)腸癌、陰道癌、宮頸癌、前列腺癌、肺癌、睪丸癌。在某些非限制性實施方式中，MAF特征或與之相關(guān)的標(biāo)記物子集可用于評價治療在對象中的關(guān)聯(lián)(相對)益處。例如，若治療決定是基于癌癥定位于對象的假設(shè)，出現(xiàn)MAF特征或與之相關(guān)的標(biāo)記物子集會提示癌癥為侵入性。在一個特定非限制性實施方式中，手術(shù)或放射學(xué)抗腫瘤治療前新輔助化學(xué)和/或免疫治療對有惡性腫瘤對象的相對益處可通過測定MAF特征或與之相關(guān)的標(biāo)記物子集的存在來評價，其中MAF特征或與之相關(guān)的標(biāo)記物子集的存在指示所述新輔助治療賦 予對象的相對益處減少。在某些實施方式中，本發(fā)明的試驗?zāi)軝z測表達(dá)的協(xié)同調(diào)節(jié)，例如但不限于MAF特征相關(guān)基因的過表達(dá)。在某些實施方式中，所述檢測包括但不限于檢測COLlIAl、THBS2和INHBA的表達(dá)。在某些實施方式中，所述檢測包括但不限于檢測以下表達(dá):C0L11A1 (優(yōu)選)，C0L10A1, C0L5A1, C0L5A2, COLlAl和C0L1A2 ；以及下列一種或更多或者兩種或更多或者三種或更多:THBS2 (優(yōu)選)，INHBA (優(yōu)選)，VCAN, FAP, MMP11, POSTN, ADAMl2, LOX, FNl 和SNAI2。例如但不限于，診斷有癌癥的對象或者評價癌癥存在或分期的對象(癌癥優(yōu)選但不限于上皮癌)樣品可就出現(xiàn)MAF基因和/或過表達(dá)至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種、或至少五種、或所有六種下列蛋白:C0L11A1 (優(yōu)選)，C0L10A1，C0L5A1, C0L5A2, COLlAl和C0L1A2 ;以及下列一種或更多或者兩種或更多或者三種或更多:THBS2(優(yōu)選)，INHBA (優(yōu)選)，VCAN, FAP, MMP11, POSTN, ADAMl2, LOX, FNl 和 SNAI2 進(jìn)行測試。優(yōu)選但不限于，SNAIl 表達(dá)不改變(此外，在本發(fā)明的某些非限制性實施方式中，SNAIl基因甲基化)。在本發(fā)明的一個特定非限制性實施方式中，過表達(dá)COLl 1AUTHBS2和INHBA而非SNAII，指示診斷具有侵入性和/或轉(zhuǎn)移發(fā)展的癌癥。在某些實施方式中，本發(fā)明的高特異性侵襲感測生物標(biāo)記試驗檢測C0L11A1的過表達(dá)。在某些實施方 式中，所述高特異性侵襲感測生物標(biāo)記試驗檢測COLllA和INHBA的協(xié)調(diào)過表達(dá)。在某些實施方式中，所述高特異性侵襲感測生物標(biāo)記試驗檢測COLllA和THBS2的協(xié)調(diào)過表達(dá)。在某些實施方式中，所述高特異性侵襲感測生物標(biāo)記試驗檢測COLl 1A、INHBA和THBS2的協(xié)調(diào)過表達(dá)。在某些實施方式中，所述高特異性侵襲感測生物標(biāo)記試驗檢測一種、兩種、或所有三種C0L11A、INHBA和THBS2的協(xié)調(diào)過表達(dá)以及一種或多種C0L10A1、C0L5A1、C0L5A2、COLlAl和C0L1A2的表達(dá)；和下列一種或更多或者兩種或更多或者三種或更多:VCAN、FAP、MMPl1、POSTN、ADAM12、LOX、FNl 和 SNAI2。在某些實施方式中，所述高特異性侵襲感測生物標(biāo)記試驗檢測COLl 1A、INHBA和THBS2中一種、兩種、或所有三種的協(xié)調(diào)過表達(dá)以及一種或多種miRNA的差異性表達(dá)，所述miRNA 選自下組:hsa-miR-22; hsa-miR-514-l/hsa_miR-514-2 I hsa-miR-514-3; hsa-miR-152;hsa-miR-508;hsa-miR-509-l/hsa-miR-509-2/hsa-miR-509-3;hsa-miR-507;hsa-miR-509-l/hsa-miR-509_2;hsa-miR-506;hsa-miR-509-3;hsa-miR-214;hsa-miR-510;hsa-miR-199a-l/hsa-miR199a_2;hsa-miR-21;hsa_miR-513c;和 hsa_miR-199b。在某些實施方式中，所述高特異性侵襲感測生物標(biāo)記試驗檢測COLl 1A、INHBA和THBS2中一種、兩種、或所有三種的協(xié)調(diào)過表達(dá)以及一種或多種基因的差異性甲基化，所述基因選自下組:PRAME; SNAI I; KRT7; RASSF5; FLJ14816; PPL; CXCR6; SLC12A8; NFATC2; HOM-TES-103;ZNF556;0CIAD2;APS;MGC9712;SLC1A2;HAK;C3orfl8;GMPR;和 C0R06。診斷試劑盒也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。更特定地，本發(fā)明包括測定測試樣品中所有或部分MAF特征存在的試劑盒。測定樣品中所有或部分MAF特征存在的試劑盒可包括:a)至少一種含有選自下組的氨基酸序列的MAF特征抗原，和b)含有與所述MAF特征抗原特異性相互作用抗體的偶聯(lián)物，所述抗原結(jié)合于能產(chǎn)生檢測信號的信號生成化合物。所述試劑盒還可包括含有抗原結(jié)合試劑的對照或校準(zhǔn)物，以及描述使用該試劑盒方法的說明書。在某些實施方式中，所述試劑盒包括一種或多種MAF特征抗原特異性抗體，其中MAF特征抗原包括或衍生自一種或多種下列基因編碼的蛋白:C0L11A1 (優(yōu)選)，C0L10A1, C0L5A1, C0L5A2, C0L1A1,和 C0L1A2, THBS2, INHBA, VCAN, FAP, MMPl 1，POSTN, ADAMl2, LOX, FNl 和 SNAI2。在某些實施方式中，本發(fā)明涉及用于檢測MAF特征核酸的試劑盒和組合物。在某些實施方式中，所述試劑盒包括能與一種或多種MAF特征核酸雜交的核酸。例如但不限于，所述試劑盒能與雜交和/或核酸擴增試驗聯(lián)用以檢測MAF特征核酸。圖1描述可用于所述試劑盒非限制性示例的一般策略。在某些實施方式中，用本發(fā)明試劑盒的可采用雜交和/或核酸擴增試驗包括但不限于:實時 PCR(例如參見 Mackay, Clin.Microbiol.1nfect.10(3):190-212, 2004)，鏈置換擴增(SDA)(例如參見 Jolley 和 Nasir, Comb.Chem.High Throughput Screen (《高通量篩選》).6 (3): 235-44, 2003)，再生式序列復(fù)制反應(yīng)(3SR)(例如參見Mueller等,Histochem.Cell.Biol.108(4-5):431-7, 1997)，連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)(例如參見 Laffler 等，Ann.Biol.Clin.(Paris).51 (9):821-6, 1993)，轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增(TMA)(例如參見 Prince 等，J.Viral Hepat.11(3): 236-42，2004)，或基于核酸序列的擴增(NASBA)(例如參見 Romano等，Clin.Lab.Med.16(1):89-103, 1996)。在本發(fā)明的某些實施方式中，檢測MAF特征核酸的試劑盒包括:⑴含有靶標(biāo)特異性序列的核酸序列，所述序列與MAF特征核酸靶標(biāo)特異性雜交，和(ii)檢測標(biāo)記。所述試齊IJ盒還可包括一種或多種可作為引物的額外核酸序列以介導(dǎo)靶序列的擴增，所述引物包括巢式和/或半巢式引物。在某些實施方式中，本發(fā)明的試劑盒還可包括作為擴增指示物的額外核酸序列，如用于實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試驗的標(biāo)記探針。

本發(fā)明的試劑盒也用于同時或依序檢測多種MAF特征核酸。這類情況中，所述試劑盒可包括不同引物組和一種或多種不同標(biāo)記用于各個不同核酸靶標(biāo)。在某些實施方式中，所述試劑盒包括核酸(例如雜交探針、引物或RT-PCR探針)，所述核酸包括或衍生自一種或多種下列基因:C0L11A1 (優(yōu)選)，C0L10A1, C0L5A1, C0L5A2, C0L1A1,和 C0L1A2, THBS2, INHBA, VCAN, FAP, MMPl 1，POSTN, ADAMl2, LOX, FNl,和 SNAI2。本文所述任何示例性試驗形式和本發(fā)明所述任何試劑盒可適于或優(yōu)化用于自動化和半自動化系統(tǒng)(包括具有含微粒的固相的系統(tǒng))，例如描述于如美國專利號5，089，424和5，006, 309，以及與本領(lǐng)域已知的任何市售可得檢測平臺聯(lián)用。在某些實施方式中，本發(fā)明的方法、試驗、和/或試劑盒涉及檢測所有或部分MAF特征，其中所述檢測可采用二元、檢測/未檢測的結(jié)果形式。在某些實施方式中，本發(fā)明的方法、試驗、和/或試劑盒涉及檢測所有或部分MAF特征，其中所述檢測可采用多因子結(jié)果形式。例如但不限于，所述多因子結(jié)果可采用基于一、二、三或更多個因子的分?jǐn)?shù)形式。所述因子可包括但不限于:(I)對MAF特征基因產(chǎn)物的表達(dá)、甲基化狀態(tài)、和/或miRNA存在中的變化的檢測；(2)樣品中顯示出水平改變的MAF特征基因產(chǎn)物的數(shù)目、甲基化狀態(tài)、和/或miRNA的存在；和(3)MAF特征基因產(chǎn)物、甲基化狀態(tài)、和/或miRNA存在的這種變化的程度。5.3基于MAF特征的治療方法在其他非限制性實施方式中，本發(fā)明提供治療對象的方法，例如但不限于的方法包括進(jìn)行上述診斷方法且隨后，若MAF特征在對象樣品中測得，建議患者進(jìn)行進(jìn)一步診斷過程(例如影像學(xué)方法如X射線、超聲、計算機化軸向?qū)用鎄射線攝影法(CAT掃描)或磁共振成像(MRI))，和/或建議給予對象抑制侵襲和/或轉(zhuǎn)移的試劑治療。在本發(fā)明的某些非限制性實施方式中，進(jìn)行上述診斷方法并根據(jù)該試驗結(jié)果作出治療決定。例如但不限于，治療決定如是否在手術(shù)或放射學(xué)抗腫瘤治療前進(jìn)行新輔助化學(xué)和/或免疫治療可根據(jù)上述診斷方法結(jié)果作出。所述診斷方法的結(jié)果與診斷決定相關(guān)，由于出現(xiàn)MAF特征或與之相關(guān)的標(biāo)記子集指示癌癥未定位，因此對象樣品中出現(xiàn)MAF特征或與之相關(guān)的標(biāo)記子集指示該新輔助治療賦予對象的相對益處減少。在某些實施方式中，進(jìn)行上述診斷方法并根據(jù)該試驗結(jié)果決定是否繼續(xù)特定治療方案。例如但不限于，決定是否繼續(xù)特定治療方案如是否繼續(xù)特定化療、放射治療、和/或分子靶向治療(例如癌細(xì)胞特異性抗體治療)可根據(jù)上述診斷方法結(jié)果作出。所述診斷方法結(jié)果與決定是否繼續(xù)特定治療方案相關(guān)，因為對象樣品中出現(xiàn)MAF特征或與之相關(guān)的標(biāo)記子集可指示該對象對治療的響應(yīng)性。5.4基于MAF特征的藥物開發(fā)方法本發(fā)明還可用于開發(fā)抑制多癌癥侵襲的治療，使用由MAF特征提供的生物學(xué)知識衍生靶標(biāo)。在多個非限制性實施方式中，本發(fā)明提供鑒定抑制對象中癌侵襲和/或轉(zhuǎn)移擴散的試劑的方法。在某些這類實施方式中，所述方法包括使測試劑接觸表達(dá)MAF特征的癌細(xì)胞，其中如果所述測試劑降低該特征中的基因過表達(dá)，該測試劑可用作抑制癌侵襲和/或轉(zhuǎn)移的治療劑。在某些實施方式中，可測定測試劑對本文所述MAF特征中基因表達(dá)的效果(例如但不限于過表達(dá)至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種、或至少五種、或所有六種下列蛋白:C0L1 IAl (優(yōu)選)， C0L10A1, C0L5A1，C0L5A2, COLlAl 和 C0L1A2 ;以及下列一種或更多或者兩種或更多或者三種或更多:THBS2 (優(yōu)選)，INHBA (優(yōu)選)，VCAN, FAP, MMPl 1，POSTN, ADAM
12,LOX, FNl和SNAI2，且如果所述測試劑降低該特征中的基因過表達(dá)，該測試劑可用作治療/預(yù)防癌侵襲和/或轉(zhuǎn)移的治療劑。在某些實施方式中，可結(jié)合C0L11A1的表達(dá)分析測試劑的效果。在某些實施方式中，可結(jié)合COLl IAl和INHBA的表達(dá)分析測試劑的效果。在某些實施方式中，可結(jié)合COLl IAl和THBS2的表達(dá)分析測試劑的效果。在某些實施方式中，可結(jié)合C0L11A1、INHBA和THBS2的表達(dá)分析測試劑的效果。在某些實施方式中，可結(jié)合COLl 1A、INHBA和THBS2中一種、兩種、或所有三種的表達(dá)以及一種或多種 C0L10A1, C0L5A1, C0L5A2, COLlAl 和 C0L1A2, VCAN, FAP, MMPl 1，POSTN, ADAM12, LOX, FNl和SNAI2的表達(dá)來分析測試劑的效果。在某些實施方式中，可結(jié)合C0L11A、INHBA和THBS2中一種、兩種、或所有三種的表達(dá)以及一種或多種選自下組的miRNA的表達(dá)來分析測試劑的效果:hsa-miR-22;hsa-miR-514-1/hsa-miR-514-2|hsa-miR-514-3;hsa-miR-152;hsa-miR-508;hsa-miR-509-l/hsa-miR-509-2/hsa-miR-509_3;hsa-miR-507;hsa-miR-509-l/hsa-miR-509-2;hsa-miR-506;hsa-miR-509-3;hsa-miR-214;hsa-miR-510;hsa-miR-199a-l/hsa_miR199a_2;hsa-miR-21;hsa_miR-513c;和 hsa_miR-199b。 在某些實施方式中，可結(jié)合COLl 1A、INHBA和THBS2中一種、兩種、或所有三種的表達(dá)以及一種或多種選自下組的基因甲基化來分析測試劑的效果=PRAME; SNAI I; KRT7; RASSF5;FLJ14816;PPL;CXCR6;SLC12A8;NFATC2;H0M-TES-103;ZNF556;0CIAD2;APS;MGC9712;SLC1A2;HAK;C3orfl8;GMPR;和 C0R06。5.5協(xié)同基因?qū)Φ臋z測在某些實施方式中，作為第二步，鑒定了與特定MAF特征成員共同但非單獨最相關(guān)的基因?qū)?，因此它們未在先前研究中出現(xiàn)。對于此任務(wù)，根據(jù)其與MAF特征成員的協(xié)同作用來排列基因?qū)?Anastassiou D, Mol Syst Biol 2007; 3:83),使用(ffatkinson J, AnnN Y Acad Sci 2009;1158:302-13)的計算方法，這可進(jìn)一步有利于生物學(xué)發(fā)現(xiàn)。發(fā)現(xiàn)2種卵巢癌之間以及2種結(jié)直腸癌之間有力驗證的非限制性示例，但不是對2種癌癥類型都通用。特別感興趣的是在2種結(jié)腸癌的排列靠前基因中出現(xiàn)的基因?qū)?CCL11，MMP2)和(SLAM7, SLAM8)，2種卵巢癌的排列靠前基因中出現(xiàn)的基因?qū)?C7，TOGFRA)，(C7，ECM2)，(TCF21, ECM2) (TCF21是已知的間充質(zhì)-上皮介質(zhì))。在某些實施方式中，可評價交互信息和協(xié)同作用。例如，假定2個變量如2個基因G1和G2的表達(dá)水平由聯(lián)合概率密度P12決定，對應(yīng)邊際P1和p2，且使用簡化符號，交互信息
I(G1IG2)是關(guān)聯(lián)性的一般量度且定義為期望值E{logp12/p1p2}。2個變量G1, G2與第三變量G3的
協(xié)同性是[14]等于I (G1, G2;G3)-[I (G1;G3) +I (G2;G3)]，即G1, G2對與G3關(guān)聯(lián)部分純粹是由于G1和G2間的協(xié)同合作(“整體”減去“部分”之和)。5.6統(tǒng)計分析除了基因表達(dá)數(shù)據(jù)以外，miRNA表達(dá)和基因甲基化與MAF特征的關(guān)聯(lián)也能在本發(fā)明內(nèi)容中研究和使用。例如但不限于，用于miRNA表達(dá)和基因甲基化活性顯著性以及用于協(xié)同對的P值評估可如下進(jìn)行。應(yīng)用基于置換的方法作為多重檢驗校正:進(jìn)行100次類別標(biāo)簽的置換實驗，各置換實驗完成窮舉搜索后保存對應(yīng)的100個最高值。使用這100個最高值分?jǐn)?shù)組，獲得Gumbel (I型極值)分布的位置參數(shù)和尺度參數(shù)的最大可能估計值，產(chǎn)生累積密度函數(shù)F。然后，實際分?jǐn)?shù)Xtl的P值在與表型無關(guān)的零假設(shè)下為1-F(Xtl)。類似地，對于協(xié)同對，發(fā)現(xiàn)100個數(shù)據(jù)集中最高得分的協(xié)同作用與初始相同，除了 C0L11A1探針值彼此隨機置換，如上用Gumbel分布對最高置換協(xié)同分?jǐn)?shù)建模。6.實施例6.1 實施例1由于我們聚焦于基因具有其極端(在大部分情況下最大)值時(但并不是沒有其他)與轉(zhuǎn)移二元(“低期”相比“高期”)表型相關(guān)的基因簇，首先開發(fā)基因和表型間關(guān)聯(lián)的特殊量度，稱為“極值關(guān)聯(lián)”(EVA)。簡言之，EVA指標(biāo)是具有最高基因表達(dá)值的所有樣品子集中偏向性部分的最小P值。換言之，假設(shè)總共有M個樣品，其中N個是“低期”且M - N個是“聞期”，選擇有最聞基因表達(dá)值的m個樣品。假定基因表達(dá)值與表型不相關(guān)，所選m個樣品中有最多n個“低期”樣品的概率由累積超幾何概率h(x≤n;M，N，m)給出。隨后，EVA指標(biāo)等于-1ogltl(所有可能的n值中這些概率的最小值)。例如，假設(shè)就總共300個樣品而言，有250個高期樣品和50個低期樣品。此外，假設(shè)有特定基因最高值的100個樣品包含99個高期樣品和1個低期樣品。在此情況中，可用MATLAB函數(shù)hypercdf (1，300, 50, 100) =5 X 10-9評估h (X≤I; 300，50，100)，得到該基因的EVA指標(biāo)為至少-1og10 (5 X 10_9) =8.3，例如若第101個樣品還是高期，則所述基因的EVA指標(biāo)會甚至更高。應(yīng)注意一旦達(dá)到最高值，剩余樣品的分選排列不相關(guān)，反映了僅極值與表型相關(guān)的假設(shè)。圖2顯示COL11A1基因的累積超幾何概率值，使用TCGA卵巢癌數(shù)據(jù)集和IIIb和IIIc之間的分期閾值:m=133時產(chǎn)生最大值(8.31)。事實上，有最高COL11A1表達(dá)的所有133個樣品處于IIIc或IV期。然后開發(fā)了機械無偏性(僅取決于表型)算法，就多種標(biāo)記“高期”或“低期”的樣品給定基因表達(dá)數(shù)據(jù)集時，所述算法可選擇僅在高期樣品中協(xié)調(diào)過表達(dá)的基因。首先根據(jù)EVA指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)選擇排列最高的前100個基因。僅使用此基因集，用間隙統(tǒng)計進(jìn)行k-均值聚類(Tibshirani R, J R Statist Soc B 63:411-423)。此步驟中，如果基因確實協(xié)調(diào)過表達(dá)，其會在熱圖上良好排列。這導(dǎo)致選擇與高/低期表型最相關(guān)的類群所屬樣品-此集合稱為“基于EVA的樣品”。該類群中的幾乎所有樣品超過MAF分期閾值，僅很少的例外可能是由于誤診。其次，定義“干凈”MAF表型，對比(a) “基于EVA”和“高期”的樣品與(b) “非基于EVA”和“低期”的樣品。如果樣品數(shù)目足夠大，此“干凈”表型提供可鑒定與觀察到的侵襲現(xiàn)象和/或轉(zhuǎn)移相關(guān)協(xié)調(diào)過表達(dá)最相關(guān)的基因的最靈敏方法。然后用異方差t檢驗通過“干凈”表型來排列基因并計算其多重檢驗校正P值，選擇邦弗倫尼校正后P〈10_3的基因。最后，發(fā)現(xiàn)這些選定基因集在所有癌表達(dá)數(shù)據(jù)集上的交叉并根據(jù)倍數(shù)變化對其進(jìn)行排列。對于有η個樣品和m個探針組的數(shù)據(jù)集，EVA算法計算nXm累積超幾何分布概率。這可能在計算上相當(dāng)密集，因此設(shè)計了低復(fù)雜度實現(xiàn)算法以隨著EVA算法推進(jìn)而動態(tài)“建立”各探針組的累積超幾何分布，如下所詳述。給定有高期樣品和b_低期樣品的數(shù)據(jù)集，構(gòu)建了對應(yīng)所有可能樣品子集的超幾何概率的(a+1) X (b+1)表。然后，對于各探針組，根據(jù)所述探針組的表達(dá)值來分選樣品。此排序廣生從左下角到右上角穿過表格的路徑，就各樣品而目向上或向右移動。此路徑的每一步驟中，遇到所觀察數(shù)目或更多高期樣品的累積概率計算是通過對當(dāng)前細(xì)胞沿對角線向下和向右的入口求和，包括當(dāng)前細(xì)胞本身。圖3所示的直觀示例最佳展示了所述算法，其中數(shù)據(jù)集共有3個低期樣品和5個高期樣品。各探針組產(chǎn)生穿過此表格的路徑，示例路徑在此以灰色顯示。I對應(yīng)高期樣品且O對應(yīng)低期樣品，此示例探針集產(chǎn)生路徑111001011。就對應(yīng)于子路徑111001的藍(lán)色細(xì)胞而言，遇到這許多或更多高期樣品的概率通過對所述藍(lán)色細(xì)胞沿對角線向下和向右的3個概率求和(包括其本身)來計算。此情況中，所述概率相當(dāng)高(82.2%)。對沿著路徑的每一步計算此累積概率，這些的最小值是EVA算法的輸出。此算法的偽碼在圖4中給出。對4個豐富基因表達(dá)數(shù)據(jù)集運行EVA算法，2個來自卵巢癌且2個來自結(jié)直腸癌(Jorissen RN, Clin Cancer Res 2009;15:7642-51;Smith JJ,Gastroenterology; 138:958-68),所述癌癥有分期信息。使用多種分期轉(zhuǎn)化，顯然包括具有協(xié)調(diào)過表達(dá)基因的樣品的癌癥定義為在卵巢癌中超過IIIb期和結(jié)直腸癌中超過I期。有趣的是，認(rèn)識到由(Bignotti E, Am J Obstet Gynecol 2007; 196:245 el-11)鑒定在卵巢癌網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移中存在的“轉(zhuǎn)移相關(guān)基因”也主要由(Tothill Rff1Clin Cancer Res2008;14:5198-208)鑒定為屬于關(guān)聯(lián)廣泛結(jié)締組織生成的卵巢癌的“不良預(yù)后”亞型。

顯然，發(fā)現(xiàn)在所有4個數(shù)據(jù)集中共有多種P〈10_12的基因。表I顯示平均log(倍數(shù)變化)大于2的這些基因列表。倍數(shù)變化方面排列居前的基因是C0L11A1 (探針37892_at)，然后是C0L10A1、POSTN、ASPN、THBS2和FAP。其中所述基因協(xié)調(diào)過表達(dá)的幾乎所有樣品達(dá)到分期閾值，對于結(jié)腸癌是II期和對于卵巢癌是IIIc期。表1:用邦弗倫尼校正P〈10—3根據(jù)基于EVA的算法，所有四個數(shù)據(jù)集中與卵巢癌和結(jié)直腸癌內(nèi)高癌期相關(guān)的排列靠前的基因
權(quán)利要求
1.種診斷對象中侵入性癌的方法，所述方法包括測定對象樣品中C0L11A1基因產(chǎn)物相對于正常對象的表達(dá)水平，其中C0L11A1基因產(chǎn)物過表達(dá)指示所述對象有侵入性癌。
2.種診斷對象中侵入性癌的方法，所述方法包括測定對象樣品中至少一種選自COLl IAl、C0L10A1、C0L5A1、C0L5A2、COLlAl 和 C0L1A2 的基因產(chǎn)物，以及至少一種選自THBS2、INHBA、VCAN、FAP、MMP11、P0STN、ADAM12、L0X、FN1 和 SNAI2 的基因產(chǎn)物相對于正常對象的表達(dá)水平，其中所述基因產(chǎn)物的過表達(dá)指示所述對象有侵入性癌。
3.權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述表達(dá)水平由包含加工樣品從而裂解所述樣品中細(xì)胞的方法測定。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法包括至少部分純化細(xì)胞基因產(chǎn)物并使所述蛋白暴露于檢測劑的額外步驟。
5.權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法包括至少部分純化細(xì)胞核酸并使所述核酸暴露于檢測劑的額外步驟。
6.權(quán)利要求1-5中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法包括測定SNAII表達(dá)水平的額外步驟，其中SNAIl未過表達(dá)而其他基因產(chǎn)物過表達(dá)的測定結(jié)果指示所述對象有侵入性癌。
7.種開發(fā)涉及對象癌癥預(yù)后的方法，所述方法包括測定對象樣品中至少一種選自 COLlIAU C0L10A1、C0L5A1、C0L5A2、COLlAl 和 C0L1A2 的基因產(chǎn)物，以及至少一種選自THBS2、INHBA、VCAN、FAP、MMP11、P0STN、ADAM12、L0X、FN1 和 SNAI2 的基因產(chǎn)物相對于正常對象的表達(dá)水平，其中所述基因產(chǎn)物的過表達(dá)指示對象中出現(xiàn)的癌有變?yōu)檗D(zhuǎn)移性的可能。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述表達(dá)水平由包含加工樣品從而裂解所述樣品中細(xì)胞的方法測定。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括至少部分純化細(xì)胞基因產(chǎn)物并使所述蛋白暴露于檢測劑的額外步驟。
10.權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括至少部分純化細(xì)胞核酸并使所述核酸暴露于檢測劑的額外步驟。
11.權(quán)利要求7-10中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法包括測定SNAII表達(dá)水平的額外步驟，其中SNAIl未過表達(dá)而其他基因產(chǎn)物過表達(dá)的測定結(jié)果指示所述對象中出現(xiàn)的癌有變?yōu)檗D(zhuǎn)移性的可能。
12.種診斷對象中侵入性癌的方法，所述方法包括測定對象樣品中至少兩種選自COLlIAl、C0L10A1、C0L5A1、C0L5A2、COLlAl 和 C0L1A2 的基因產(chǎn)物，以及至少一種選自THBS2、INHBA、VCAN、FAP、MMP11、P0STN、ADAM12、L0X、FN1 和 SNAI2 的基因產(chǎn)物相對于正常對象的表達(dá)水平，其中所述基因產(chǎn)物的過表達(dá)指示所述對象有侵入性癌。
13.權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述表達(dá)水平由包含加工樣品從而裂解所述樣品中細(xì)胞的方法測定。
14.權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述方法包括至少部分純化細(xì)胞基因產(chǎn)物并使所述蛋白暴露于檢測劑的額外步驟。
15.權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述方法包括至少部分純化細(xì)胞核酸并使所述核酸暴露于檢測劑的額外步驟。
16.權(quán)利要求12-15中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法包括測定SNAIl表達(dá)水平的額外步驟，其中SNAIl未過表達(dá)而其他基因產(chǎn)物過表達(dá)的測定結(jié)果指示所述對象有侵入性癌。
17.種診斷對象中侵入性癌的方法，所述方法包括測定對象樣品中C0L11A1、THBS2和INHBA中一種、兩種、或所有三種相對于正常對象的表達(dá)水平，其中所述基因產(chǎn)物過表達(dá)指示所述對象有侵入性癌。
18.權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述表達(dá)水平由包含加工樣品從而裂解所述樣品中細(xì)胞的方法測定。
19.權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述方法包括至少部分純化細(xì)胞蛋白并使所述基因產(chǎn)物暴露于檢測劑的額外步驟。
20.權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述方法包括至少部分純化細(xì)胞核酸并使所述核酸暴露于檢測劑的額外步驟。
21.權(quán)利要求17-20中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法包括測定SNAIl表達(dá)水平的額外步驟，其中SNAIl未過表達(dá)而其他基因產(chǎn)物過表達(dá)的測定結(jié)果指示所述對象有侵入性癌。
22.種治療對象的方法，所述方法包括進(jìn)行權(quán)利要求1、7、12或17所述的診斷方法，其中蛋白過表達(dá)時，建議患者進(jìn)行影像學(xué)方法。
23.種治療對象的方法，所述方法包括進(jìn)行權(quán)利要求1、7、12或17所述的診斷方法，其中蛋白過表達(dá)時，建議患者不進(jìn)行新輔助治療。
24.種治療對象的方 法，所述方法包括進(jìn)行權(quán)利要求1、7、12或17所述的診斷方法，其中蛋白過表達(dá)時，建議患者改變其目前治療方案。
25.種鑒定抑制對象中癌侵襲的試劑的方法，所述方法包括使測試劑接觸表達(dá)轉(zhuǎn)移相關(guān)成纖維細(xì)胞特征的癌細(xì)胞，其中如果所述測試劑降低基因在所述特征中的過表達(dá)，所述測試劑可用作抑制癌侵襲的治療劑。
26.權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)移相關(guān)成纖維細(xì)胞特征包括過表達(dá)至少一種選自COLlIAl、C0L10A1、C0L5A1、C0L5A2、COLlAl和C0L1A2的基因產(chǎn)物，以及至少一種選自 THBS2、INHBA、VCAN、FAP、MMP11、P0STN、ADAM12、L0X、FN1 和 SNAI2 的基因產(chǎn)物。
27.權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)移相關(guān)成纖維細(xì)胞特征包括過表達(dá)至少兩種選自COLlIAl、C0L10A1、C0L5A1、C0L5A2、COLlAl和C0L1A2的基因產(chǎn)物，以及至少兩種選自 THBS2、INHBA、VCAN、FAP、MMP11、P0STN、ADAM12、L0X、FN1 和 SNAI2 的基因產(chǎn)物。
28.種試劑盒，所述試劑盒包括: (a)能與轉(zhuǎn)移相關(guān)成纖維細(xì)胞特征基因產(chǎn)物特異性相互作用的標(biāo)記報道分子； (b)對照或校準(zhǔn)試劑，和 (c)描述使用試劑盒方式的說明書。
29.權(quán)利要求28所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括: (a)包含與轉(zhuǎn)移相關(guān)成纖維細(xì)胞特征抗原特異性相互作用的抗體的偶聯(lián)物，所述抗原結(jié)合于能產(chǎn)生可檢測信號的信號生成化合物； (b)對照或校準(zhǔn)試劑，和 (C)描述使用試劑盒方式的說明書。
30.權(quán)利要求29所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括轉(zhuǎn)移相關(guān)成纖維細(xì)胞特征抗原特異性抗體，其中由所述抗體結(jié)合的轉(zhuǎn)移相關(guān)成纖維細(xì)胞特征抗原包括或衍生自一種或多種下列基因編碼的蛋白:C0L11A1、C0L10A1、C0L5A1、C0L5A2、COLlAl、C0L1A2、THBS2、INHBA、VCAN、FAP、MMP11、P0STN、ADAM12、L0X、FN1 和 SNAI2。
31.權(quán)利要求28所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括: (a)能與轉(zhuǎn)移相關(guān)成纖維細(xì)胞特征核酸雜交的核酸； (b)對照或校準(zhǔn)試劑，和 (C)描述使用試劑盒方式的說明書。
32.權(quán)利要求28所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括: (a)核酸序列，所述序列包括: (i)與轉(zhuǎn)移相關(guān)成纖維細(xì)胞特征核酸特異性雜交的靶特異性序列，和 (ii)檢測標(biāo)記； (b)引物核酸序列； (c)指示擴增的核酸指示物；和 (d)描述使用試劑盒方式的說明書。
33.權(quán)利要求31或32所述的試劑盒，其特征在于，所述與轉(zhuǎn)移相關(guān)成纖維細(xì)胞特征核酸特異性雜交的核酸包括或衍生自下列基因之一:C0L1 IAl、C0L10A1、C0L5A1、C0L5A2、COLlAl、C0L1A2、THBS2、INHBA、VCAN、FAP、MMPl K POSTN, ADAMl2, LOX、FNl 和 SNAI2。
全文摘要
本發(fā)明涉及構(gòu)成轉(zhuǎn)移相關(guān)成纖維細(xì)胞(“MAF”)特征的生物標(biāo)記和其在診斷多種癌癥并進(jìn)行分期中的應(yīng)用。這至少部分基于以下發(fā)現(xiàn)鑒定某些基因的差異表達(dá)指示有高度特異性的多種癌癥的診斷和/或分期。特定地，出現(xiàn)特征表明癌癥已變?yōu)榍秩胄浴Ｒ虼耍诙鄠€實施方式中，本發(fā)明提供診斷、診斷試劑盒的方法以及包括評價對象生物標(biāo)記狀態(tài)的治療方法。此外，由于某些基因的差異表達(dá)能作為獲得轉(zhuǎn)移潛力的標(biāo)記，如表達(dá)概況能用于預(yù)測某些治療干預(yù)的適宜性，例如新輔助治療的適宜性。所述概況還可用于篩選能抑制轉(zhuǎn)移潛力獲得的治療。因此，在多個實施方式中，本發(fā)明提供就抗轉(zhuǎn)移特性篩選治療以及篩選試劑盒的方法。
文檔編號C12Q1/68GK103097548SQ201180029006
公開日2013年5月8日 申請日期2011年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月13日
發(fā)明者D·阿納斯塔修, J·沃特金森, H·金 申請人:紐約市哥倫比亞大學(xué)托管會