扁桃擬莖點霉TaqMan熒光定量PCR引物及探針的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及一種扁桃擬莖點霉TaqMan巧光定量PCR引物及探針,屬于生物技術領 域,適用于口岸檢驗檢疫、農業(yè)生產、植物保護等部口使用。
【背景技術】
[0002] 扁桃擬莖點霉(無性態(tài):Phomopsis amygdali,有性態(tài):Diapo;rthe amygdali)是重 要的植物病原菌,對桃、紅葉李、花梅、梨和杏等多種菩薇科植物均有致病性,但在桃樹上引 起的桃鎌縮潰瘍病尤為嚴重。常表現(xiàn)為在桃樹新梢嫩枝的基部形成環(huán)狀褐色病斑,致使枝 條病部W上葉片快速枯萎脫落,病害蔓延擴展迅速,可造成20~50%的產量損失,嚴重的致 使桃樹整株死亡。自1905年起,Delacroix等首次報道了法國發(fā)生桃樹潰瘍病之后,意大利、 美國、日本等地也相繼發(fā)現(xiàn)該病。在中國,桃潰瘍病出現(xiàn)的相對較晚,直到20世紀80年代后 期才有有關該病發(fā)生流行的報道,并且起初該病只在迂寧、云南、山東、河南的局部地區(qū)發(fā) 現(xiàn),危害范圍較小。2008年之后,桃潰瘍病在江蘇無錫、常州和浙江嘉興等我國南方桃區(qū)相 繼發(fā)生且逐年加重。尤其在2013年,江蘇無錫桃潰瘍病大暴發(fā),給當?shù)靥耶a業(yè)造成了嚴重的 損失,嚴重影響了桃農生產的積極性,已逐漸成為阻礙我國桃產業(yè)持續(xù)健康快速發(fā)展的重 要因素之一。
[0003] 對于扁桃擬莖點霉進行早期檢測可W及時采取防治措施,控制病害的進一步擴 展。目前,扁桃擬莖點霉的檢測技術主要為傳統(tǒng)檢測法和常規(guī)PCR檢測方法。傳統(tǒng)檢測法是 對病健交界處進行組織分離培養(yǎng),觀察病原菌形態(tài)、培養(yǎng)性狀并回接到寄主植物觀察致病 性的過程,但其費時費力,不適合病害的早期檢測。隨著分子生物學的快速發(fā)展,戴富明等 將常規(guī)PCR檢測法引入到桃潰瘍病病菌的檢測中,靈敏度達到lOOfg/L,且花費時間短,檢測 效率高。
[0004] 化qMan巧光定量PCR法是在常規(guī)PCR的基礎上,增加 1條雙巧光標記的特異性核酸 雜交探針,通過檢測巧光信號強弱來監(jiān)測PCR反應過程中擴增產物量的變化。與常規(guī)PCR相 比巧光探針雜交信號不需經過瓊脂糖凝膠電泳,有效避免了交叉污染和假陽性的產生,具 有省時省力、靈敏度高、特異性強、重復性好及病原定量等優(yōu)點,已成為病原定量檢測的重 要方法。張?zhí)鹛鸬葘⒈憩F(xiàn)植原體癥狀的野魏豆植株同時進行巢式PCR和巧光定量PCR檢測, 結果顯示巢式PCR檢測時有目的條帶,但測序分析并非植原體,運與巧光定量PCR檢測中未 發(fā)現(xiàn)巧光信號的增加結果相符。王恒波等利用巧光定量PCR法對甘薦宿根矮化病菌 (Leifsonia xyli subsp.xyli)樣品進行檢測,結果顯示巧光定量PCR陽性檢出率達到常規(guī) PCR檢出率的兩倍。W上研究表明,巧光定量PCR法能夠提供較常規(guī)PCR更高的?;院挽`敏 度。迄今,尚未有利用化qMan巧光定量PCR方法對扁桃擬莖點霉進行檢測的報道。
[0005] 病原生物的分子生物學檢測技術是當今的發(fā)展方向,檢測的效果和性能,很大程 度上取決于分子檢測祀標的篩選。前期研發(fā)的分子檢測技術,由于缺乏基因組學的支持,分 子檢測祀標沒有經過系統(tǒng)篩選,往往造成檢測結果的可信度出現(xiàn)問題。研究隨著基因組學 的發(fā)展,越來越多的生物基因組被測序,人們已經注意到,分子檢測祀標基因必須是病原生 物的核屯、基因。因此,本發(fā)明的重點之一是利用比較基因組學的方法,篩選出可供作為檢測 革己標的核屯、基因。
【發(fā)明內容】
[0006] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術中存在的不足,提供一種扁桃擬莖點霉化qMan巧光 定量PCR引物及探針,適用于扁桃擬莖點霉化qman巧光定量PCR檢測,快速、靈敏、簡便。
[0007] 按照本發(fā)明提供的技術方案,所述扁桃擬莖點霉化qMan巧光定量PCR引物,其特征 是:所述引物包括SEQ ID No: 1所示的上游引物histone冊-F和SEQ ID No: 1所示的下游引 物histone冊-R組成的引物對。
[0008] 所述用于檢測扁桃擬莖點霉的探針,其特征是:包括SEQ ID No: 1所示的探針 histone H3-P。
[0009] 進一步的,所述探針histone H3-P的5'端標記巧光報告基團FAM,3'端標記巧光巧 滅基團TAMRA。
[0010] 所述檢測扁桃擬莖點霉的方法,其特征是,包括W下步驟:
[0011] (1)合成上游引物histone H3-F、下游引物histone冊-R和探針histone H3-P,并 對探針histone冊-P進行標記;
[0012] (2)提取待檢測樣品的基因組DNA,W上游引物histone H3-F和下游引物histone H3-R進行擴增,得到擴增產物;
[OOU] (3)采用巧光定量PCR檢測體系對待測樣品進行檢測。
[0014] 進一步的,所述探針histone H3-P的5'端標記巧光報告基團FAM,3'端標記巧光巧 滅基團TAMRA。
[0015] 本發(fā)明所述扁桃擬莖點霉TaqMan巧光定量PCR檢測引物及探針,適用于口岸檢驗 檢疫、農業(yè)生產、植物保護等部口使用?;谠撘锛疤结樈⒌那晒舛縋CR檢測體系 可用于桃潰瘍的檢測,檢測方法易于操作,檢測結果可靠。
【附圖說明】
[0016] 圖1為TaqMan巧光定量PCR標準曲線。
[0017] 圖2為TaqMan巧光定量PCR特異性檢測。
[001引圖3為TaqMan巧光定量PCR標準品質粒靈敏度檢測。
[0019] 圖4為常規(guī)PCR DNA靈敏度檢測。
[0020] 圖5為化qMan巧光定量PCR抱子靈敏度檢測。
【具體實施方式】
[0021 ]下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0022] 1、菌株材料:選用56株參試菌株,包括不同年份,不同果園采集的25株扁桃擬莖點 霉(P.amygdali)及31株其他參試菌株,如表1所示。
[0023] 表 1
[0024]
[0025]
[0026] 表1中,25株曲omopsis amygdali中,11株于2014年在江蘇無錫進行分離,9株于 2015年在江蘇無錫進行分離,2株于2014年在上海進行分離,3株于2014年在浙江嘉興進行 分離。
[0027] 表1 中NJAU代表化njing Agricultural University(南京農業(yè)大學),JSCIQ代表 Jiangsu Entiy-Exit Inspection and 如arantine Bureau(江蘇出入境檢驗檢疫局)。
[0028] 2、檢測樣品:結合桃鎌縮潰瘍病的田間發(fā)病癥狀,于2015年在江蘇無錫多個桃園 采集了 50份疑似發(fā)病樣品。
[0029] 3、實驗試劑與儀器:
[0030] 巧光定量PCR所用引物及探針由上海Invi化ogen有限公司合成,巧光定量PCR和普 通PCR所用試劑、PMD19-T vector連接試劑盒、質粒提取純化試劑盒均購于大連寶生物公 司,真菌基因組DNA提取試劑盒購于OMEGA公司,美國ABI-7500實時巧光PCR擴增儀、Thermo Nanno化op 1000分光光度計、Eppendo;rf Master巧cler pro 384梯度PCR擴增儀、DYY-8C雙 穩(wěn)定時電泳儀(北京六一儀器廠)、培清JS-780全自動凝膠成像分析系統(tǒng)。
[0031] 4、檢測方法:
[0032] (1)核酸提?。罕馓覕M莖點霉、參試近緣菌株及實際樣品檢測中病樣的基因組DNA 均由OMEGA公司的真菌基因組DNA小量制備試劑盒提取,具體步驟詳見說明書。
[0033] (2)特異性引物探針的設計合成:根據(jù)GenBank登錄的扁桃擬莖點霉histone冊基 因(登錄號:KC343503)的保守區(qū)域,利用Bioedit軟件進行序列比對分析,設計巧光定量檢 測引物化istone H3-F、histone H3-R)和探針化istone H3-P),探針5'端標記巧光報告基 團FAM,3'端標記巧光巧滅基團TAMRA,擴增目的片段大小為130bp。引物和探針均委托上海 Invitrogen有限公司合成并純化,引物和探針的的序列如表2所示。
[0034] 表2引物及探針序列
[0035]
[0036] (3)標準質粒的構建:W提取的扁桃擬莖點霉DM為模板,用巧光定量引物 化istone冊-F、histone冊-R)擴增相應片段?;厥漳康钠闻cpMD19-T simple vector連 接試劑盒連接,轉化D冊α感受態(tài)細胞,利用Amp抗性挑選陽性克隆子。將陽性克隆接種到LB 培養(yǎng)基(含Amp100 mg/L),37°C搖菌過夜,使用質粒小量提取試劑盒提取質粒,經PCR鑒定后 委托上海Invitrogen有限公司測序驗證。
[0037] 經PCR鑒定,重組質粒的擴增產物大小為13化P,與預期大小一致,表明histone H3 基因已正確插入載體PMD19-T中,其測序結果在NCBI經Blast分析顯示,與參考