一種用于制備ε?聚賴氨酸的微生物球的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于制備ε?聚賴氨酸的微生物球的制備方法，屬于ε?聚賴氨酸制備技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明利用蠶繭為原料進(jìn)行處理，將自制培養(yǎng)基作為填充物，對(duì)處理蠶繭殼進(jìn)行填充，制得微生物球基體，浸泡于由無(wú)菌水淋洗培養(yǎng)菌種的培養(yǎng)基表面得到的淋洗液中，之后再移入海藻酸鈉浸泡，進(jìn)行包裹，再使用竹膜進(jìn)行表面包裹，從而得到ε?聚賴氨酸的微生物球的制備方法。實(shí)例證明，本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，儀器取材容易，顯著提高了ε?聚賴氨酸的發(fā)酵產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度，最終使得制得的ε?聚賴氨酸收率和純度均達(dá)到了90％以上，可用于工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說(shuō)明】
一種用于制備ε-聚賴氨酸的微生物球的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明公開(kāi)了一種用于制備ε-聚賴氨酸的微生物球的制備方法，屬于ε-聚賴氨酸制備技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]食品的腐敗變質(zhì)會(huì)引起巨大的經(jīng)濟(jì)損失，如何防止腐敗是食品科學(xué)工作者最為關(guān)注的一個(gè)問(wèn)題.。目前，常用的防腐措施是添加食品防腐劑，食品防腐劑分為化學(xué)防腐劑、天然防腐劑和復(fù)合型防腐劑，其中使用最為廣泛的是化學(xué)防腐劑.目前。除礦泉水、純凈水以夕卜，幾乎所有保質(zhì)期超過(guò)一個(gè)月以上的飲料(包括兒童飲用的各種飲料)，蜜餞、醬菜等食品，包括藥品、保健食品口服液的保鮮，均需加入抗菌防腐劑。常規(guī)的抗菌防腐劑主要是化學(xué)合成的，如苯甲酸鈉、山梨酸鉀等，毒理學(xué)安全評(píng)價(jià)早已證明，長(zhǎng)期使用苯甲酸鈉會(huì)對(duì)人的肝臟產(chǎn)生危害，并可致癌；山梨酸鉀也對(duì)人體有一定的副作用，隨著人們對(duì)健康的重視，天然防腐劑和復(fù)合型防腐劑的應(yīng)用會(huì)越來(lái)越廣泛.。因此，研發(fā)天然、無(wú)副作用的抗菌防腐劑代替化學(xué)抗菌防腐劑已成為必然的趨勢(shì)。
[0003]ε_(tái)聚賴氨酸是一種新型的天然防霉防腐劑，它不但對(duì)人體健康無(wú)害，有的還具有一定的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是今后開(kāi)發(fā)的方向。ε_(tái)聚賴氨酸是L-賴氨酸殘基通過(guò)α-羧基和ε-氨基形成的酰胺鍵連接而成的均聚氨基酸，故稱為ε_(tái)聚賴氨酸。ε-聚賴氨酸具有廣譜抗菌性，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、酵母菌、霉菌均有很好的抑菌效果，是目前天然防腐劑中具有優(yōu)良防腐性能和巨大商業(yè)潛力的微生物類飼料防腐劑。
[0004]ε-聚賴氨酸生物防腐劑是一種天然的微生物代謝產(chǎn)物，是需要經(jīng)分離提取精制而獲得的發(fā)酵產(chǎn)品。但是，提取工藝繁瑣、收率低、含量低、純度低、費(fèi)用高一直是限制ε_(tái)聚賴氨酸工業(yè)化的重要因素，但目前葡萄糖和甘油都是ε-PL產(chǎn)生菌最適碳源。以葡萄糖為唯一碳源時(shí)，ε-PL產(chǎn)生菌的發(fā)酵速度快，但ε-PL產(chǎn)量低，葡萄糖轉(zhuǎn)化率低。以甘油為唯一碳源時(shí)，轉(zhuǎn)化率高，ε-PL產(chǎn)量高，但發(fā)酵速度慢。然而，我們研究發(fā)現(xiàn)簡(jiǎn)單的將葡萄糖和甘油混合共同作為碳源用于ε-PL發(fā)酵卻并不能有效提高ε-PL發(fā)酵水平。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明主要解決的技術(shù)問(wèn)題:針對(duì)目前傳統(tǒng)方法制備ε_(tái)聚賴氨酸的過(guò)程中，提取工藝繁瑣，且在發(fā)酵的過(guò)程中，利用簡(jiǎn)單的葡萄糖和甘油混合，用于發(fā)酵不能有效提高ε-聚賴氨酸發(fā)酵水平，導(dǎo)致制得的ε_(tái)聚賴氨酸收率、純度均較低的現(xiàn)狀，提供了一種利用蠶繭為原料進(jìn)行處理，將自制培養(yǎng)基作為填充物，對(duì)處理蠶繭殼進(jìn)行填充，制得微生物球基體，浸泡于由無(wú)菌水淋洗培養(yǎng)菌種的培養(yǎng)基表面得到的淋洗液中，之后再移入海藻酸鈉浸泡，進(jìn)行包裹，再使用竹膜進(jìn)行表面包裹，從而得到ε_(tái)聚賴氨酸的微生物球的制備方法。該方法操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，儀器取材容易，顯著提高了 ε_(tái)聚賴氨酸的發(fā)酵產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度，最終使得制得的ε_(tái)聚賴氨酸收率和純度均達(dá)到了90%以上，可用于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0006]為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是: (1)使用水將蠶繭殼表面洗凈，再按固液比1:3，將其與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%碳酸氫鈉溶液放入低壓鍋中，設(shè)定壓力為70?80kPa，溫度為95?100°C，蒸煮50?70min后自然冷卻至室溫，過(guò)濾收集蠶繭殼浸泡于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的氨水溶液中，再置于15?20°C下靜置2?4h;
(2)上述靜置后過(guò)濾，將過(guò)濾后的蠶繭殼與蒸餾水按固體比1:3混合均勻，并置于超聲振蕩器中，在23?26KHz下振蕩50?60min，過(guò)濾并將濾渣放入風(fēng)干機(jī)中風(fēng)干，得處理蠶繭殼；
(3)按重量份數(shù)計(jì)，取60?70份蛋白胨、40?50份酵母浸膏、20?25份玉米胚芽柏、I?3份制霉素、0.3?0.6份磷酸二氫鉀、0.4?0.5份磷酸氫二鉀、0.6?0.8份水楊酸及6?8份瓊脂攪拌均勻，并殺菌消毒，得培養(yǎng)基，將所得的培養(yǎng)基填充至上述處理蠶繭殼中，得微生物球基體，備用；
(4)按接種量10?15%，將乳酸鏈球菌接種至上述培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)基移至恒溫?fù)u床中，設(shè)定溫度為28?32°C，使用紫外線進(jìn)行照射，培養(yǎng)10?15h，再將培養(yǎng)基移至微波反應(yīng)器中，室溫下培養(yǎng)4?6h，隨后取出，使用無(wú)菌水淋洗培養(yǎng)基表面至其表面無(wú)菌絲，收集淋洗液；
(5)將步驟(3)備用的微生物球基體浸泡于上述淋洗液，蠶繭殼開(kāi)口朝上，使淋洗液淹沒(méi)微生物球基體，靜置4?6h，將微生物球基體取出浸泡于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%的海藻酸鈉溶液中，靜置3?5min，將微生物球基體取出室溫下風(fēng)干，使用竹膜將其表面包裹，即可得用于制備ε -聚賴氨酸的微生物球。
[0007]本發(fā)明的應(yīng)用方法是:將本發(fā)明制得的ε-聚賴氨酸的微生物球放入發(fā)酵罐中，在溫度35?55°C，相對(duì)濕度38?42%下密封發(fā)酵5?7天，待發(fā)酵完畢，取出，經(jīng)檢測(cè)，經(jīng)此發(fā)酵制得的ε_(tái)聚賴氨酸收率和純度均達(dá)到了90%以上，比傳統(tǒng)發(fā)酵法收率提高了 I?2倍，可用于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0008]本發(fā)明的有益效果是:
(1)本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，儀器取材容易，發(fā)酵條件容易掌握，從而顯著提高了 ε-聚賴氨酸的發(fā)酵產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度；
(2)本發(fā)明使得制得的ε_(tái)聚賴氨酸能力強(qiáng)，收率和純度均達(dá)到了90%以上，可用于工業(yè)化生產(chǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0009]首先使用水將蠶繭殼表面洗凈，再按固液比1:3，將其與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%碳酸氫鈉溶液放入低壓鍋中，設(shè)定壓力為70?80kPa，溫度為95?100°C，蒸煮50?70min后自然冷卻至室溫，過(guò)濾收集蠶繭殼浸泡于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的氨水溶液中，再置于15?20°C下靜置2?4h;上述靜置后過(guò)濾，將過(guò)濾后的蠶繭殼與蒸餾水按固體比1:3混合均勻，并置于超聲振蕩器中，在23?26KHz下振蕩50?60min，過(guò)濾并將濾渣放入風(fēng)干機(jī)中風(fēng)干，得處理蠶繭殼；隨后按重量份數(shù)計(jì)，取60?70份蛋白胨、40?50份酵母浸膏、20?25份玉米胚芽柏、I?3份制霉素、0.3?0.6份磷酸二氫鉀、0.4?0.5份磷酸氫二鉀、0.6?0.8份水楊酸及6?8份瓊脂攪拌均勻，并殺菌消毒，得培養(yǎng)基，將所得的培養(yǎng)基填充至上述處理蠶繭殼中，得微生物球基體，備用;接下來(lái)按接種量10?15%，將乳酸鏈球菌接種至上述培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)基移至恒溫?fù)u床中，設(shè)定溫度為28?32°C，使用紫外線進(jìn)行照射，培養(yǎng)10?15h，再將培養(yǎng)基移至微波反應(yīng)器中，室溫下培養(yǎng)4?6h，隨后取出，使用無(wú)菌水淋洗培養(yǎng)基表面至其表面無(wú)菌絲，收集淋洗液;最后將上述備用的微生物球基體浸泡于上述淋洗液，蠶繭殼開(kāi)口朝上，使淋洗液淹沒(méi)微生物球基體，靜置4?6h，將微生物球基體取出浸泡于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%的海藻酸鈉溶液中，靜置3?5min，將微生物球基體取出室溫下風(fēng)干，使用竹膜將其表面包裹，即可得用于制備ε-聚賴氨酸的微生物球。
[0010]實(shí)例I
首先使用水將蠶繭殼表面洗凈，再按固液比1:3，將其與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%碳酸氫鈉溶液放入低壓鍋中，設(shè)定壓力為70kPa，溫度為95°C，蒸煮50min后自然冷卻至室溫，過(guò)濾收集蠶繭殼浸泡于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的氨水溶液中，再置于15°C下靜置2h;上述靜置后過(guò)濾，將過(guò)濾后的蠶繭殼與蒸餾水按固體比1: 3混合均勻，并置于超聲振蕩器中，在23KHz下振蕩50min，過(guò)濾并將濾渣放入風(fēng)干機(jī)中風(fēng)干，得處理蠶繭殼；隨后按重量份數(shù)計(jì)，取60份蛋白胨、40份酵母浸膏、20份玉米胚芽柏、I份制霉素、0.3份磷酸二氫鉀、0.4份磷酸氫二鉀、0.6份水楊酸及6份瓊脂攪拌均勻，并殺菌消毒，得培養(yǎng)基，將所得的培養(yǎng)基填充至上述處理蠶繭殼中，得微生物球基體，備用;接下來(lái)按接種量10%，將乳酸鏈球菌接種至上述培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)基移至恒溫?fù)u床中，設(shè)定溫度為28°C，使用紫外線進(jìn)行照射，培養(yǎng)10h，再將培養(yǎng)基移至微波反應(yīng)器中，室溫下培養(yǎng)4h，隨后取出，使用無(wú)菌水淋洗培養(yǎng)基表面至其表面無(wú)菌絲，收集淋洗液;最后將上述備用的微生物球基體浸泡于上述淋洗液，蠶繭殼開(kāi)口朝上，使淋洗液淹沒(méi)微生物球基體，靜置4h，將微生物球基體取出浸泡于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%的海藻酸鈉溶液中，靜置3min，將微生物球基體取出室溫下風(fēng)干，使用竹膜將其表面包裹，即可得用于制備ε -聚賴氨酸的微生物球。
[0011]本實(shí)例操作簡(jiǎn)便，使用時(shí)，將本發(fā)明制得的ε-聚賴氨酸的微生物球放入發(fā)酵罐中，在溫度35°C，相對(duì)濕度38%下密封發(fā)酵5天，待發(fā)酵完畢，取出，經(jīng)檢測(cè)，經(jīng)此發(fā)酵制得的ε-聚賴氨酸收率和純度均達(dá)到了 90 %，比傳統(tǒng)發(fā)酵法收率提高了 I倍，可用于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0012]實(shí)例2
首先使用水將蠶繭殼表面洗凈，再按固液比1:3，將其與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%碳酸氫鈉溶液放入低壓鍋中，設(shè)定壓力為75kPa，溫度為98°C，蒸煮60min后自然冷卻至室溫，過(guò)濾收集蠶繭殼浸泡于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的氨水溶液中，再置于18°C下靜置3h;上述靜置后過(guò)濾，將過(guò)濾后的蠶繭殼與蒸餾水按固體比1: 3混合均勻，并置于超聲振蕩器中，在25KHz下振蕩55min，過(guò)濾并將濾渣放入風(fēng)干機(jī)中風(fēng)干，得處理蠶繭殼；隨后按重量份數(shù)計(jì)，取65份蛋白胨、45份酵母浸膏、23份玉米胚芽柏、2份制霉素、0.5份磷酸二氫鉀、0.45份磷酸氫二鉀、0.7份水楊酸及7份瓊脂攪拌均勻，并殺菌消毒，得培養(yǎng)基，將所得的培養(yǎng)基填充至上述處理蠶繭殼中，得微生物球基體，備用;接下來(lái)按接種量13%，將乳酸鏈球菌接種至上述培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)基移至恒溫?fù)u床中，設(shè)定溫度為30°C，使用紫外線進(jìn)行照射，培養(yǎng)13h，再將培養(yǎng)基移至微波反應(yīng)器中，室溫下培養(yǎng)5h，隨后取出，使用無(wú)菌水淋洗培養(yǎng)基表面至其表面無(wú)菌絲，收集淋洗液;最后將上述備用的微生物球基體浸泡于上述淋洗液，蠶繭殼開(kāi)口朝上，使淋洗液淹沒(méi)微生物球基體，靜置5h，將微生物球基體取出浸泡于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%的海藻酸鈉溶液中，靜置4min，將微生物球基體取出室溫下風(fēng)干，使用竹膜將其表面包裹，即可得用于制備ε -聚賴氨酸的微生物球。
[0013]本實(shí)例操作簡(jiǎn)便，使用時(shí)，將本發(fā)明制得的ε-聚賴氨酸的微生物球放入發(fā)酵罐中，在溫度45°C，相對(duì)濕度40%下密封發(fā)酵6天，待發(fā)酵完畢，取出，經(jīng)檢測(cè)，經(jīng)此發(fā)酵制得的ε-聚賴氨酸收率和純度均達(dá)到了 92 %，比傳統(tǒng)發(fā)酵法收率提高了 1.5倍，可用于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0014]實(shí)例3
首先使用水將蠶繭殼表面洗凈，再按固液比1:3，將其與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%碳酸氫鈉溶液放入低壓鍋中，設(shè)定壓力為SOkPa，溫度為100°C，蒸煮70min后自然冷卻至室溫，過(guò)濾收集蠶繭殼浸泡于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15 %的氨水溶液中，再置于20°C下靜置4h;上述靜置后過(guò)濾，將過(guò)濾后的蠶繭殼與蒸餾水按固體比1: 3混合均勻，并置于超聲振蕩器中，在26KHz下振蕩60min，過(guò)濾并將濾渣放入風(fēng)干機(jī)中風(fēng)干，得處理蠶繭殼；隨后按重量份數(shù)計(jì)，取70份蛋白胨、50份酵母浸膏、25份玉米胚芽柏、3份制霉素、0.6份磷酸二氫鉀、0.5份磷酸氫二鉀、0.8份水楊酸及8份瓊脂攪拌均勻，并殺菌消毒，得培養(yǎng)基，將所得的培養(yǎng)基填充至上述處理蠶繭殼中，得微生物球基體，備用;接下來(lái)按接種量15%，將乳酸鏈球菌接種至上述培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)基移至恒溫?fù)u床中，設(shè)定溫度為32°C，使用紫外線進(jìn)行照射，培養(yǎng)15h，再將培養(yǎng)基移至微波反應(yīng)器中，室溫下培養(yǎng)6h，隨后取出，使用無(wú)菌水淋洗培養(yǎng)基表面至其表面無(wú)菌絲，收集淋洗液;最后將上述備用的微生物球基體浸泡于上述淋洗液，蠶繭殼開(kāi)口朝上，使淋洗液淹沒(méi)微生物球基體，靜置6h，將微生物球基體取出浸泡于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%的海藻酸鈉溶液中，靜置5min，將微生物球基體取出室溫下風(fēng)干，使用竹膜將其表面包裹，即可得用于制備ε -聚賴氨酸的微生物球。
[0015]本實(shí)例操作簡(jiǎn)便，使用時(shí)，將本發(fā)明制得的ε-聚賴氨酸的微生物球放入發(fā)酵罐中，在溫度55°C，相對(duì)濕度42%下密封發(fā)酵7天，待發(fā)酵完畢，取出，經(jīng)檢測(cè)，經(jīng)此發(fā)酵制得的ε-聚賴氨酸收率和純度均達(dá)到了 95 %，比傳統(tǒng)發(fā)酵法收率提高了 2倍，可用于工業(yè)化生產(chǎn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種用于制備ε-聚賴氨酸的微生物球的制備方法，其特征在于具體制備步驟為: (1)使用水將蠶繭殼表面洗凈，再按固液比1:3，將其與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2 %碳酸氫鈉溶液放入低壓鍋中，設(shè)定壓力為70?80kPa，溫度為95?100°C，蒸煮50?70min后自然冷卻至室溫，過(guò)濾收集蠶繭殼浸泡于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的氨水溶液中，再置于15?20°C下靜置2?4h; (2)上述靜置后過(guò)濾，將過(guò)濾后的蠶繭殼與蒸餾水按固體比1:3混合均勻，并置于超聲振蕩器中，在23?26KHz下振蕩50?60min，過(guò)濾并將濾渣放入風(fēng)干機(jī)中風(fēng)干，得處理蠶繭殼； (3)按重量份數(shù)計(jì)，取60?70份蛋白胨、40?50份酵母浸膏、20?25份玉米胚芽柏、I?3份制霉素、0.3?0.6份磷酸二氫鉀、0.4?0.5份磷酸氫二鉀、0.6?0.8份水楊酸及6?8份瓊脂攪拌均勻，并殺菌消毒，得培養(yǎng)基，將所得的培養(yǎng)基填充至上述處理蠶繭殼中，得微生物球基體，備用； (4)按接種量10?15%，將乳酸鏈球菌接種至上述培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)基移至恒溫?fù)u床中，設(shè)定溫度為28?32°C，使用紫外線進(jìn)行照射，培養(yǎng)10?15h，再將培養(yǎng)基移至微波反應(yīng)器中，室溫下培養(yǎng)4?6h，隨后取出，使用無(wú)菌水淋洗培養(yǎng)基表面至其表面無(wú)菌絲，收集淋洗液； (5)將步驟(3)備用的微生物球基體浸泡于上述淋洗液，蠶繭殼開(kāi)口朝上，使淋洗液淹沒(méi)微生物球基體，靜置4?6h，將微生物球基體取出浸泡于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%的海藻酸鈉溶液中，靜置3?5min，將微生物球基體取出室溫下風(fēng)干，使用竹膜將其表面包裹，即可得用于制備ε -聚賴氨酸的微生物球。
【文檔編號(hào)】C12P13/02GK106085998SQ201610468620
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月25日
【發(fā)明人】張靜, 張明, 宋奇
【申請(qǐng)人】張靜