一種固態(tài)發(fā)酵制備納豆激酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種固態(tài)發(fā)酵制備納豆激酶的方法，先分別配制斜面培養(yǎng)基、種子液培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基，再將納豆芽孢桿菌接種到斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)得到活化后的納豆芽孢桿菌后挑取1～2環(huán)到種子液培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)作為發(fā)酵種子液，然后將發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后自然冷，將發(fā)酵種子液噴灑于發(fā)酵培養(yǎng)基中，并加入水?dāng)嚢杈鶆蚝蛟跓袖伋杀?，用紗布封口后依次發(fā)酵、后熟24h后加入生理鹽水，浸提、離心后獲得富含納豆激酶的上清液；其制備工藝簡(jiǎn)單，操作方便，原料易得，成本低，制備的納豆激酶活性高，經(jīng)濟(jì)效益明顯。
【專利說明】
一種固態(tài)發(fā)酵制備納豆激酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
[0001] 本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種以花生柏為原料，采用固態(tài)發(fā)酵 工藝制備納豆激酶的技術(shù)，特別是一種固態(tài)發(fā)酵制備納豆激酶的方法。
【背景技術(shù)】：
[0002] 血栓是由纖維蛋白原和血小板聚集形成的，常引發(fā)一系列疾病，是一種嚴(yán)重危害 人類健康的心血管疾病。納豆激酶(nattokinase簡(jiǎn)稱NK，是由納豆芽孢桿菌（Bacillus subtilisl natto)產(chǎn)生的一種絲氨酸蛋白酶，納豆激酶已被證實(shí)是一種治療心腦血管疾病 的理想候選藥物，與其他傳統(tǒng)溶栓藥相比，具有安全性好、成本低、易被人體吸收、作用直接 迅速、作用持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)等諸多優(yōu)點(diǎn)。因此，納豆激酶作為新一代治療血栓的有效藥物，具有 較廣闊的開發(fā)和應(yīng)用前景。目前，已公開的納豆激酶制備方法有很多，例如 CM 2 0 1 5 1 0 4 9 5 0 6 2 . 9公開了 一種可放大的快速高效納豆激酶純化制備方法， CN201510731704.0公開了一種采用深層液體發(fā)酵提取納豆激酶的方法，該方法的發(fā)酵料為 黃豆、紅豆、水果或蔬菜;N201210512373.8公開了一種納豆激酶的制造方法，利用經(jīng)典深層 發(fā)酵技術(shù)，通過引入鷹嘴豆粉作為原料組成混合培養(yǎng)基制備納豆激酶，201310154402.2公 開了一種以黑豆為原料制備高活性納豆激酶的方法，利用黑豆為原料制備高活性納豆激 酶，但這些方法基本上都存在酶活力低，生產(chǎn)率低，生產(chǎn)成本高等問題。因此，迫切需要尋求 一種生產(chǎn)率高、成本低的納豆激酶制備方法?；ㄉ?PNM)是花生仁經(jīng)壓榨提煉油料后所得 的副產(chǎn)品，其粗蛋白質(zhì)含量為38.0 %~47.0%，粗纖維含量為4.0 %~7.0%，粗脂肪含量為 0.5%~2.0%，現(xiàn)多采用熱壓榨工藝提取花生油，導(dǎo)致花生蛋白過度變性，附加值降低，只 能用于禽畜水產(chǎn)飼料，這極大限制了花生柏粗蛋白在食品和非食品領(lǐng)域的有效利用。目前 利用微生物發(fā)酵花生柏制備抗氧化肽的研究較多，明強(qiáng)強(qiáng)等人利用酵母菌、乳酸菌、黑曲霉 等五種微生物固態(tài)發(fā)酵花生柏，探索制備抗氧化肽的工藝條件。劉紅梅等人運(yùn)用枯草芽抱 桿菌AS1.398、地衣芽孢桿菌2709和植物乳桿菌等四種微生物液態(tài)發(fā)酵制備花生抗氧化肽， 但利用納豆芽孢桿菌發(fā)酵花生柏制備納豆激酶的研究未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0003] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)，尋求設(shè)計(jì)提供一種花生柏固態(tài)發(fā)酵 制備納豆激酶的方法，通過調(diào)整發(fā)酵時(shí)間、溫度、接種量、料液比和營養(yǎng)鹽加入量，制備高活 力的納豆激酶，為降低納豆激酶的生產(chǎn)成本提供理論依據(jù)和技術(shù)支持，為花生柏的高值化 利用提供新途徑。
[0004] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明制備納豆激酶的具體過程為：
[0005] (1)培養(yǎng)基的配制：將瓊脂15g/L、蛋白胨10g/L、牛肉粉3g/L和氯化鈉5g/L混合均 勻后在121°C滅菌20min得到pH值為7.1~7.5的斜面培養(yǎng)基;將蛋白胨1(^/1、牛肉膏58/1、 氯化鈉3g/L、葡萄糖10g/L和酵母膏5g/L混合均勻后在121°C下滅菌20min得到種子液培養(yǎng) 基;將花生柏、麩子、豆柏、燕麥、大豆分別用清水洗凈并加總重量3倍的水浸泡15h后按6:1: 1:1:1的重量比混合，并加入花生柏、麩子、豆柏、燕麥和大豆總重量1.5的％蔗糖、0.21 %的 硫酸鎂、0.27 %的氯化鈣混合組成的營養(yǎng)鹽，混合均勻在121°C下滅菌20min得到發(fā)酵培養(yǎng) 基；
[0006] (2)納豆芽孢桿菌種子液的制備:在無菌環(huán)境下，將納豆芽孢桿菌用接種環(huán)挑出1 ~2環(huán)接種到滅菌后的新鮮斜面培養(yǎng)基上，在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h得到活化后的納豆芽孢 桿菌，將活化后的納豆芽孢桿菌在無菌條件下挑取1~2環(huán)到種子液培養(yǎng)基中，在37°C、 160r/min條件下振蕩培養(yǎng)18h作為發(fā)酵種子液，備用；
[0007] (3)將發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)121°C在0.22MPa壓力下蒸汽滅菌20min后自然冷卻至55°C以 下，在無菌條件下，將3~5mL發(fā)酵種子液噴灑于30g發(fā)酵培養(yǎng)基中，并加入發(fā)酵培養(yǎng)基重量 40%~60%的水?dāng)嚢杈?，?0〇111]^的燒杯中鋪成2-3〇]1的薄層，用紗布封口后在33~41 <€ 條件下依次發(fā)酵18~30h、4°C后熟24h后，加入總重量5倍的生理鹽水，在4°C浸提2h后 10000r/min離心10min，獲得富含納豆激酶的上清液。
[0008] 本發(fā)明制備的納豆激酶活力能達(dá)到3162U/mL，可溶性氮含量能達(dá)到5.6mg/mL，羥 自由基清除率能達(dá)到74%，鐵還原力0D值能達(dá)到0.906。
[0009] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，以花生柏作為主要原料進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵獲得具有較高納豆 激酶活性的產(chǎn)品，降低了溶栓激酶的生產(chǎn)成本，為廣大心腦血管疾病患者帶來福音，而且增 加了花生柏的附加值，經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)明顯，對(duì)于我國花生產(chǎn)業(yè)的發(fā)展與農(nóng)民的增收致富有著重 大的意義，其制備工藝簡(jiǎn)單，操作方便，原料易得，成本低，制備的納豆激酶活性高，經(jīng)濟(jì)效 益明顯。
【附圖說明】：
[0010] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例所述納豆芽孢桿菌的生長(zhǎng)曲線圖。
[0011] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例所述尿激酶活力標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0012] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例所述發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵效果的影響曲線圖。
[0013] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例所述接種量對(duì)發(fā)酵效果的影響曲線圖。
[0014] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例所述發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵效果的影響曲線圖。
[0015] 圖6為本發(fā)明實(shí)施例所述料液比對(duì)發(fā)酵效果的影響曲線圖。
【具體實(shí)施方式】：
[0016] 下面通過實(shí)施例并結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0017] 實(shí)施例1:
[0018]本實(shí)施例制備納豆激酶的具體過程為：
[0019] (1)培養(yǎng)基的配制：將瓊脂15g/L、蛋白胨10g/L、牛肉粉3g/L和氯化鈉5g/L混合均 勻后在121°C滅菌20min得到pH為7.1~7.5的斜面培養(yǎng)基;將蛋白胨1(^/1、牛肉膏58/1、氯 化鈉3g/L、葡萄糖10g/L和酵母膏5g/L混合均勻后在121°C下滅菌20min得到種子液培養(yǎng)基； 將花生柏、麩子、豆柏、燕麥、大豆分別用清水洗凈并加總重量3倍的水浸泡后按6:1:1:1:1 的重量比混合，并加入花生柏、麩子、豆柏、燕麥和大豆總重量1.5的％蔗糖、0.21 %的硫酸 鎂、0.27%的氯化鈣混合組成的營養(yǎng)鹽，混合均勻在121°C下滅菌20min得到發(fā)酵培養(yǎng)基；
[0020] (2)納豆芽孢桿菌種子液的制備:在無菌環(huán)境下，將納豆芽孢桿菌用接種環(huán)挑出1 ~2環(huán)接種到滅菌后的新鮮斜面培養(yǎng)基上，在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h得到活化后的納豆芽孢 桿菌，將活化后的納豆芽孢桿菌在無菌條件下挑取1~2環(huán)到種子液培養(yǎng)基中，在37°C、 160r/min條件下振蕩培養(yǎng)18h作為發(fā)酵種子液，備用；
[0021] (3)將發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)121°C在0.22MPa壓力下蒸汽滅菌20min后自然冷卻至55°C以 下，在無菌條件下，將3~5mL發(fā)酵種子液噴灑于30g發(fā)酵培養(yǎng)基中，并加入發(fā)酵培養(yǎng)基重量 40 %~60 %的水?dāng)嚢杈?，?00mL的燒杯中鋪成2~3cm薄層，用紗布封口后在33~41°C條 件下依次發(fā)酵18~30h、4°C后熟24h后，加入總重量5倍的生理鹽水，在4°C浸提2h后10000r/ min離心10min，獲得富含納豆激酶的上清液。
[0022] 實(shí)施例2:
[0023]本實(shí)施例將實(shí)施例1步驟(2)制備的發(fā)酵種子液每隔3h取樣，測(cè)定660nm處的0D值， 以未接種納豆芽孢桿菌的種子培養(yǎng)液為空白對(duì)照，繪制納豆芽孢桿菌的生長(zhǎng)曲線(如圖1所 示），確定接入發(fā)酵培養(yǎng)基的種齡;并依次改變步驟(3)中的發(fā)酵溫度、接種量(發(fā)酵種子液 噴灑量）、發(fā)酵時(shí)間、料液比(發(fā)酵培養(yǎng)基與加入其中的水的重量比）和步驟(1)中的營養(yǎng)鹽， 分別測(cè)定單因素對(duì)納豆激酶活力與可溶性氮含量的影響，發(fā)酵溫度分別為29、33、37、41、45 °C;接種量分別為l、2、3、4、5mL;發(fā)酵時(shí)間分別為12、18、24、30、36h;料液比分別為1:0.2、1: 0.3、1 :0.4、1:0.5、1:0.6;其測(cè)定結(jié)果分別如圖3、4、5、6所示;營養(yǎng)鹽41添加組42不加組， 然后根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇溫度、時(shí)間、接種量和料液比四個(gè)影響較為顯著的因素進(jìn)行 正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1:
[0024]表1因素與水平排列
[0025]
[0026]正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2:
[0027]表2:正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與極差分析結(jié)果
[0028]
[0029] 在發(fā)酵溫度的影響中，K2>K1>K3，K2最大，說明37°C對(duì)納豆激酶活力的影響最 大;在發(fā)酵時(shí)間的影響中K2 >K3 >K1，K2最大，說明24h對(duì)納豆激酶活力的影響最大;在接種 量的影響中，K3>K2>K1，K3最大，說明5mL對(duì)納豆激酶活力的影響最大;在料液比的影響中 ΚΙ >K2>K3，K1最大，說明1:0.4對(duì)納豆激酶活力的影響最大。
[0030] 本實(shí)施例所述納豆激酶活力的測(cè)定過程為：先制作尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照WS1 - (X-052)一2001Z-2010,參照文獻(xiàn)"Astrup T，Muller S.The fibrin plate method for estimating fibrinolytie activity[J].Arch Biochemical Biopys,1995,40：346-351" 公開的方法，以尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品單位數(shù)的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，溶解圈垂直兩直徑乘積的對(duì)數(shù)為橫 坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（如圖2所示），并計(jì)算得到回歸方程y = 4.9864x+0.5141，R2 = 0.9947， 再取上清液點(diǎn)樣于纖維蛋白平板上，37°C孵育18h，測(cè)量溶解圈的垂直兩直徑，兩直徑乘積 的對(duì)數(shù)代入回歸方程，計(jì)算樣品酶活力，每組數(shù)據(jù)均平行測(cè)定3次;可溶性氮含量的測(cè)定參 照文獻(xiàn)"明強(qiáng)強(qiáng)，于麗娜，楊慶利，等.黑曲霉固態(tài)發(fā)酵制備花生蛋白肽及抗氧化活性研究 [J].食品科技，2014，39(2): 17-22"的方法測(cè)定;測(cè)定抗氧化活性時(shí)，羥自由基清除率、鐵 還原力的測(cè)定按照文獻(xiàn)"Yu L N，Sun J，Liu S F，et al.Ultrasonic-assisted enzymolysis to improve the antioxidant activities of peanut(Arachin conarachin L.)antioxidant hydrolysate[J]. International Journal of Molecular Sciences · 2012，13:9051-9068" 的方法測(cè)定。
[0031] 本實(shí)施例納豆芽孢桿菌的生長(zhǎng)曲線如圖1所示，在0~12h內(nèi)，納豆芽孢桿菌生長(zhǎng)速 度較慢，處于延滯期；12h后納豆芽孢桿菌生長(zhǎng)迅速，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；21h開始納豆芽孢桿 菌生長(zhǎng)變緩，菌數(shù)趨于穩(wěn)定，進(jìn)入穩(wěn)定期；30h開始納豆芽孢桿菌數(shù)量開始減少，進(jìn)入衰亡 期，由此確定納豆芽孢桿菌的最適種齡為18h。
[0032] 本實(shí)施例發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵效果的影響如圖3所示，在29~45°C范圍內(nèi)，納豆激酶活 力呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，在發(fā)酵溫度為37°C時(shí)，納豆芽孢桿菌產(chǎn)酶活力最高;可溶性氮 含量也呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，溫度為41°C時(shí)，可溶性氮含量最高，菌種的生長(zhǎng)對(duì)溫度要 求較高，在適宜溫度范圍內(nèi)，納豆芽孢桿菌才能快速生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)生大量的蛋白酶水解底物 蛋白。當(dāng)溫度高于納豆桿菌適宜的生長(zhǎng)范圍時(shí)，納豆桿菌的生長(zhǎng)繁殖受到抑制，導(dǎo)致菌體數(shù) 量減少，綜合評(píng)價(jià)發(fā)酵溫度對(duì)這2個(gè)指標(biāo)的影響，確定33~41°C作為正交實(shí)驗(yàn)發(fā)酵溫度范 圍。
[0033]本實(shí)施例接種量對(duì)發(fā)酵效果的影響如圖4所示，接種量在1~5mL范圍內(nèi)，發(fā)酵液中 納豆激酶活力先增加后減小，接種量4mL時(shí)納豆激酶活力最高，可溶性氮含量的增加趨勢(shì)與 納豆激酶活力變化基本一致，隨著接種量的增加，菌種生長(zhǎng)繁殖過程中產(chǎn)生的蛋白酶量增 多，蛋白水解生成的肽增加，發(fā)酵產(chǎn)物中可溶性氮含量增大，當(dāng)接種量5mL時(shí)，納豆激酶活力 和可溶性氮含量均降低。這可能與接種的納豆芽孢桿菌數(shù)量大、消耗的營養(yǎng)物質(zhì)過多，導(dǎo)致 納豆芽孢桿菌的生長(zhǎng)受到抑制，綜合評(píng)價(jià)菌液量對(duì)發(fā)酵的影響，選擇3~5mL接種量作為正 交實(shí)驗(yàn)水平范圍。
[0034]本實(shí)施例發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵效果的影響如圖5所示，在12~36h范圍內(nèi)，納豆激酶的 活力是先增加后減少，24h時(shí)納豆激酶活力最大；可溶性氮含量呈現(xiàn)出先增加后減少的趨 勢(shì)。在固態(tài)發(fā)酵初期，菌種生長(zhǎng)繁殖旺盛，產(chǎn)生各種酶量增多，將發(fā)酵底物的大分子有機(jī)物 水解為小分子物質(zhì)，有利于肽的生成，則發(fā)酵產(chǎn)物中可溶性氮含量高。隨著發(fā)酵時(shí)間的延 長(zhǎng)，菌種生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，產(chǎn)生的酶量減少，此外，納豆芽孢桿菌在生長(zhǎng)過程中要消耗營養(yǎng) 物質(zhì)，導(dǎo)致可溶性氮含量減少，綜合評(píng)價(jià)發(fā)酵時(shí)間的影響，確定18~30h作為正交實(shí)驗(yàn)發(fā)酵 時(shí)間范圍。
[0035]本實(shí)施例料液比對(duì)發(fā)酵效果的影響如圖6所示，由圖中可以看出最適料液比為1: 0.5,固態(tài)發(fā)酵水分含量過低，影響營養(yǎng)基質(zhì)的溶解和傳遞以及顆粒的潤(rùn)脹等條件，不利于 菌種生長(zhǎng)，水分含量過高不利于通氣，使基質(zhì)成團(tuán)，影響氧的傳遞和發(fā)酵熱的散失，且納豆 芽孢桿菌產(chǎn)生的蛋白酶被稀釋，使蛋白酶與底物蛋白接觸機(jī)率下降，影響水解速率，發(fā)酵液 中可溶性氮含量少，納豆激酶的活力較低，綜合評(píng)價(jià)料液比對(duì)發(fā)酵的影響，確定1:0.4~1: 〇. 6作為正交實(shí)驗(yàn)水平范圍。
[0036]本實(shí)施例添加營養(yǎng)鹽的E1組納豆激酶活力和可溶性氮含量分別為2680U/mL、 5. lmg/mL;不添加的E2組分別為2260U/mL、4.6mg/mL，El組明顯高于E2組.
[0037]本實(shí)施例由正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中納豆激酶活力的影響 最大，其余依次為接種量、料液比、溫度，理論最優(yōu)組合為發(fā)酵時(shí)間24h、發(fā)酵溫度37°C、接種 量5mL、料液比1:0.4，在此發(fā)酵條件下測(cè)得發(fā)酵液的納豆激酶活力達(dá)到3162U/mL，比單因素 中的最高酶活提高了 18 % (2680U/mL)，可溶性氮含量為5.6mg/mL，羥自由基清除率為74 %， 鐵還原力0D值為0.906。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種固態(tài)發(fā)酵制備納豆激酶的方法，其特征在于制備納豆激酶的具體過程為： (1) 培養(yǎng)基的配制：將瓊脂15g/L、蛋白胨10g/L、牛肉粉3g/L和氯化鈉5g/L混合均勻后 在121°C滅菌20min得到pH值為7.1~7.5的斜面培養(yǎng)基;將蛋白胨1(^/1、牛肉膏58/1、氯化 鈉3g/L、葡萄糖10g/L和酵母膏5g/L混合均勾后在121°C下滅菌20min得到種子液培養(yǎng)基;將 花生柏、麩子、豆柏、燕麥、大豆分別用清水洗凈并加總重量3倍的水浸泡15h后按6:1:1:1:1 的重量比混合，并加入花生柏、麩子、豆柏、燕麥和大豆總重量1.5的％蔗糖、0.21 %的硫酸 鎂、0.27%的氯化鈣混合組成的營養(yǎng)鹽，混合均勻在121°C下滅菌20min得到發(fā)酵培養(yǎng)基； (2) 納豆芽孢桿菌種子液的制備:在無菌環(huán)境下，將納豆芽孢桿菌用接種環(huán)挑出1~2環(huán) 接種到斜面培養(yǎng)基上，在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h得到活化后的納豆芽孢桿菌，將活化后的納 豆芽孢桿菌在無菌條件下挑取1~2環(huán)到種子液培養(yǎng)基中，在37°C、160r/min條件下振蕩培 養(yǎng)18h作為發(fā)酵種子液，備用； (3) 將發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)121°C在0 · 22MPa壓力下蒸汽滅菌20min后自然冷卻至55°C以下，在 無菌條件下，將3~5mL發(fā)酵種子液噴灑于30g發(fā)酵培養(yǎng)基中，并加入發(fā)酵培養(yǎng)基重量40 %~ 60%的水?dāng)嚢杈?，?0〇111]^的燒杯中鋪成2-3〇]1的薄層，用紗布封口后在33~41<€條件下 依次發(fā)酵18~30h、4°C后熟24h后，加入總重量5倍的生理鹽水，在4°C浸提2h后10000r/min 離心10min，獲得富含納豆激酶的上清液。
【文檔編號(hào)】C12R1/07GK106085991SQ201610562331
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年7月15日
【發(fā)明人】胡迎芬, 王艷平, 馬愛國, 梁惠, 張?jiān)礉? 劉青, 丁皓玥
【申請(qǐng)人】青島大學(xué)