一種基因定點改造的蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開一種基因定點改造的小麥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶及其應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。本發(fā)明通過對野生型小麥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶進行基因定點改造，獲得了僅含有伴侶活性的小麥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶突變體，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，是由氨基酸序列為SEQ ID NO：3所示的野生型小麥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶定點改造而得，其43、46、387和390位氨基酸由半胱氨酸(Cys)突變成絲氨酸(Ser)。面包烘焙結(jié)果表明，基因定點改造的小麥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶在改善面包品質(zhì)效果上優(yōu)于野生型小麥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶。研究結(jié)果為深入揭示wPDI的伴侶活性對面筋蛋白的作用機制奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】
一種基因定點改造的蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種基因定點改造的小麥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu) 酶及其在改善面粉加工品質(zhì)中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(protein disulfide isomeraseJDI)是一種位于真核生物 細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的巰基/二硫鍵氧化還原酶，對催化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中新生肽鏈氧化折疊、維持蛋白以 及細胞功能具有重要作用。PDI主要由4個硫氧還蛋白結(jié)構(gòu)域組成，以aj，!/和a'的順序排 列。其中，a和Y含有獨立的催化巰基/二硫鍵交換的CXXC活性位點(C為半胱氨酸cys，X為除 cys以外的氨基酸）。^)1包含多種酶學(xué)活性，包括二硫鍵的氧化酶、還原酶和異構(gòu)酶活性。
[0003] 除酶學(xué)活性外，PDI還具有分子伴侶活性，即能夠幫助新生肽鏈正確折疊并抑制因 錯誤折疊引起的蛋白凝沉作用。PDI伴侶活性的大小受其活性位點cys氧化還原狀態(tài)的調(diào) 節(jié)。盡管如此，PDI的伴侶活性并不依賴于其活性位點cys。人H)I(hroi)活性位點cys烷基化 后喪失了酶學(xué)活性，但仍然保留了抑制變性蛋白凝沉的能力，即保留了分子伴侶活性。PDI 的伴侶活性在促進重組蛋白可溶表達以及包涵體的復(fù)性等方面都表現(xiàn)出了積極的影響。
[0004] 已有的研究認為小麥roi(wroi)的酶學(xué)活性在面筋蛋白的折疊和二硫鍵的形成中 發(fā)揮了重要作用。張婷婷等在專利(ZL 201310373089.1)中指出，wPDI能夠改善面粉加工品 質(zhì)。然而，Every等提出wPDI的添加水平與面包質(zhì)量呈負相關(guān)關(guān)系，即wPDI添加量越大，面包 品質(zhì)越低，這可能是由于wPDI在面粉中發(fā)揮二硫鍵還原酶活性引起的。目前，尚未有將wPDI 進行基因突變改造后應(yīng)用于改善面粉加工品質(zhì)的相關(guān)技術(shù)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種基因定點改造 的小麥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶。本發(fā)明通過對野生型小麥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶進行基因定點 改造，獲得了僅含有伴侶活性的小麥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶突變體。面包烘焙結(jié)果表明，基因 定點改造的小麥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶在改善面包品質(zhì)效果上優(yōu)于野生型小麥蛋白質(zhì)二硫 鍵異構(gòu)酶。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供所述的基因定點改造的小麥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶在 改善面粉加工品質(zhì)中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0008] 一種基因定點改造的小麥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0:4所 不。
[0009] 具體地說，上述基因定點改造的小麥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶是由氨基酸序列為SEQ ID N0:3所示的野生型小麥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶定點改造而得，其43、46、387和390位氨基 酸由半胱氨酸(Cys)突變成絲氨酸(Ser)。
[0010] -種基因定點改造的小麥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
[0011] -種含有上述核苷酸序列的重組表達載體。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述表達載體為PET-30M + )。
[0013] -種重組表達菌，其包含了上述重組表達載體。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述表達菌為大腸桿菌BL21(DE3)。
[0015] 所述的基因定點改造的小麥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶喪失了酶學(xué)活性，但保留了伴侶 活性。
[0016] 所述的基因定點改造的小麥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶在改善面粉加工品質(zhì)中的應(yīng)用。
[0017] 所述的基因定點改造的小麥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶在改善面包品質(zhì)中的應(yīng)用，包括 如下步驟：
[0018] 將基因定點改造的小麥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶按0.01 %~0.5% (w/w，面粉基）比例 添加至面包中，經(jīng)面包質(zhì)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，基因定點改造的小麥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶在改善面 包品質(zhì)上具有優(yōu)于野生型小麥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶的效果。
[0019] 優(yōu)選地，按〇. 1 % (w/w，面粉基)比例添加至面包中。
[0020] 所述的基因定點改造的小麥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶的制備方法，包括如下步驟:將 核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示的表達基因?qū)氲絧ET-30b( + )表達載體上，然后轉(zhuǎn)化至大 腸桿菌BL21(DE3)中，通過金屬螯合層析純化得到基因定點改造的小麥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu) 酶。
[0021] 本發(fā)明的機理是:WPDI同時含有酶學(xué)活性和分子伴侶活性，為了獲得僅含有分子 伴侶活性的wPDI突變體，探究wPDI的伴侶活性對面粉加工品質(zhì)的影響，本發(fā)明利用基因工 程技術(shù)，對wPDI的活性位點進行定向改造，獲得了喪失酶學(xué)活性但保留了伴侶活性的wPDI 突變體蛋白。本發(fā)明改造的小麥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶在改善面包品質(zhì)上發(fā)揮積極作用，且 效果要優(yōu)于野生型的wPDI。研究結(jié)果為深入揭示wPDI的伴侶活性對面筋蛋白的作用機制奠 定了基礎(chǔ)。
[0022]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點及效果：
[0023] (1)本發(fā)明在野生型小麥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶的基礎(chǔ)上，通過定點突變生物技術(shù) 改造了小麥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶，得到僅含有伴侶活性的小麥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶突變 體。
[0024] (2)本發(fā)明得到的基因定點改造的小麥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶在改善面包品質(zhì)方面 效果優(yōu)于野生型小麥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶。
【附圖說明】
[0025] 圖1是mPDI誘導(dǎo)表達菌的SDS-PAGE分析；其中，泳道M:低分子量蛋白marker;泳道 1:未誘導(dǎo)菌液;泳道2:誘導(dǎo)菌液。
[0026] 圖2是改造前后wPDI的SDS-PAGE圖譜比較；其中，泳道M:低分子量蛋白marker;泳 道1:親和純化的wPDI;泳道2:親和純化的mPDI。
[0027]圖3是重組mPDI和wPDI對面包質(zhì)構(gòu)參數(shù)的影響比較;其中，不同字母表示差異顯著 (P<0.05)〇
【具體實施方式】
[0028] 下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限 于此。
[0029] 對于未特別注明的工藝參數(shù)，可參照常規(guī)技術(shù)進行。本發(fā)明的實施例中使用的面 粉購于糧食市場；限制性內(nèi)切酶BamHI和Xhol購于Thermo Fisher Scientific公司；pET-30b( + )質(zhì)粒購于寶生物工程(大連)有限公司；大腸桿菌BL21(DE3)購于Novagen公司；重組 質(zhì)粒PET30b-wPDI由本實驗室自行構(gòu)建，構(gòu)建的相關(guān)方法和信息見ZL 201310373089.1。
[0030] 實施例1小麥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶的改造及其重組質(zhì)粒構(gòu)建
[0031]野生型小麥蛋白質(zhì)^硫鍵異構(gòu)酶的喊基序列如SEQ ID NO: 1所不，對小麥蛋白質(zhì) 二硫鍵異構(gòu)酶基因的改造采用重疊延伸聚合酶鏈式反應(yīng)，設(shè)計如下6條引物：
[0032] R1:5，-TTGGAGTGTCCACTCCATGGGGCGTAGAAC-3，；
[0033] F2:5，-ATGGAGTGGACACTCCAAGAGCCTGGCACC-3，；
[0034] R2:5，-TTTGAGTGTCCGCTCCAGGGTGCATAGAAC-3，；
[0035] F3:5，-TGGAGCGGACACTCAAAGAAGCTAGCACCC-3，；
[0036] T7:5 '-TAATACGACTCACTATAGGG-3 '；
[0037] T7ter:5 '-TGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3 '；
[0038] 以重組質(zhì)粒PET30b-wPDI為模板，T7/Rl，F(xiàn)2/R2，F(xiàn)3/T7ter為引物分別進行PCR擴 增，PCR擴增條件如下：
[0039]
[0040] PCR擴增后得到三個片段，瓊脂糖凝膠電泳回收后，以T7/T7ter為引物，三個回收 片段為模板再進行PCR擴增，得到全長片段。全長片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收后，經(jīng)BamHI和 Xhol雙酶切，連接到經(jīng)相同內(nèi)切酶處理的pET-30b( + )質(zhì)粒上，進一步轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)大腸 桿菌中，并涂布于含有卡那霉素的LB平板培養(yǎng)基上37°C培養(yǎng)過夜。
[00411結(jié)果：成功獲得了基因定點改造的小麥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(mutant PDI，mPDI) 重組質(zhì)粒，堿基測序結(jié)果證實了該序列為基因定點改造的小麥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶的核苷 酸序列（SEQ ID N0:2)。
[0042] 實施例2重組mPDI的誘導(dǎo)表達及純化 [0043] 1、重組mPDI的誘導(dǎo)表達
[0044] 將構(gòu)建好的重組mPDI質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)中，挑取2~3顆單克隆菌落到含50yg/ mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C，200r/m條件下培養(yǎng)至0D6Q()到0.6~0.8左右，加入0.5mM IPTG誘導(dǎo)表達8h，誘導(dǎo)溫度為20°C。經(jīng)SDS-PAGE分析，重組mPDI獲得高效表達(圖1)。
[0045] 2、重組mPDI的親和純化
[0046]收集表達后的菌體，加入緩沖液重懸，利用探頭式超聲儀破碎菌體細胞，超聲條件 為功率300w，占空比0.4:0.6，超聲時間15min。超聲完全后，8000r/m離心20min后收集上清 液。
[0047]上清液緩慢注入Ni-NTA親和層析柱中，利用線性洗脫方式純化目的蛋白，收集目 的組分，并利用SDS-PAGE檢測重組蛋白。
[0048]結(jié)果:重組mPDI獲得高效表達，經(jīng)一步親和層析獲得高純度目的蛋白，且改造前后 的蛋白在SDS-PAGE膠上的迀移率無顯著差異（圖2)。
[0049] 實施例3重組mPDI的酶學(xué)性質(zhì)和伴侶活性測定
[0050] PDI的酶學(xué)活性包含二硫鍵氧化酶活性、還原酶活性以及異構(gòu)酶活性。而PDI的伴 侶活性指的是促進新生蛋白的折疊和抑制變性蛋白因稀釋引起的凝沉作用。本文以胰島素 還原法表征二硫鍵的還原酶活性；以恢復(fù)二硫鍵斷裂的核糖核酸酶活性表征二硫鍵氧化酶 活性；以恢復(fù)二硫鍵錯配的核糖核酸酶活性表征二硫鍵異構(gòu)酶活性；以抑制胰島素 B鏈聚集 表征伴侶活性。
[0051 ] 結(jié)果:如表1所示，相比于WPDI，重組mPDI未表現(xiàn)出二硫鍵氧化酶、還原酶和異構(gòu)酶 活性，即喪失了酶學(xué)活性。對于伴侶活性，mPDI抑制胰島素 B鏈聚集程度比wPDI大，表明mPDI 仍然保留了伴侶活性且高于wPDI。
[0052] 表1 mPDI和wPDI的酶學(xué)活性和伴侶活性比較 [0053]
[0054]~注：以重組wPDI的活性作為參考，值以百分比表示。ND表示未檢出。
[0055] 實施例4重組mPDI和wPDI對面包質(zhì)構(gòu)的影響比較
[0056]面包的制作方法：100g市售高筋粉中加入60g水、1.6g鹽，6g糖，3g植物油（金龍魚 食用調(diào)和油，市售），lg酵母粉(安琪高活性干酵母，市售）以及0.1%的重組mPDI或wPDI蛋白 (溶于5mM Tris-HCl，pH 8.0中），100r/m的速度攪拌20min后，將面團分成50g/個，揉成圓 形，置于30°C下發(fā)酵50min。發(fā)酵好的面團放入180°C烘箱中烘烤lOmin，取出，冷卻至室溫， 測定面包的質(zhì)構(gòu)參數(shù)，以無任何添加的為對照。
[0057]質(zhì)構(gòu)分析條件:p/25探頭，測前和測試速度lmm/s，測后速度5mm/s，壓縮比50%，下 壓間隔10s。
[0058] 結(jié)果如圖3所示：相比于對照組，添加 wPDI提高了面包硬度和黏性，降低了面包彈 性。該結(jié)果與ZL 201310373089.1中實施例3結(jié)果基本一致。然而，添加 mPDI降低了面包硬度 和黏性，提高了面包彈性，表現(xiàn)出了改善面包品質(zhì)的作用。因此，面包質(zhì)構(gòu)結(jié)果表明，mPDI能 夠提尚面包的品質(zhì)。
[0059] 上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種基因定點改造的小麥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶，其特征在于:所述的基因定點改造 的小麥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示，是由氨基酸序列為SEQ ID NO: 3所示的野生型小麥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶定點改造而得，其43、46、387和390位氨基酸由 半胱氨酸突變成絲氨酸。2. -種編碼權(quán)利要求1所述的基因定點改造的小麥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶的基因，其特 征在于:其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。3. -種含有權(quán)利要求2所述的基因的重組表達載體。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組表達載體，其特征在于:所述的表達載體為pET-30b( + )。5. -種重組表達菌，其特征在于:包含權(quán)利要求3或4所述的重組表達載體。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組表達菌，其特征在于：所述的表達菌為大腸桿菌BL21 (DE3)〇7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因定點改造的小麥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶，其特征在于:該酶 喪失了酶學(xué)活性，但保留了伴侶活性。8. 權(quán)利要求1所述的基因定點改造的小麥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶在改善面粉加工品質(zhì)中 的應(yīng)用。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的基因定點改造的小麥蛋白質(zhì)二硫鍵 異構(gòu)酶在改善面包品質(zhì)中的應(yīng)用。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于包括如下步驟： 將基因定點改造的小麥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶按面粉基的〇. 01 %~〇. 5 %w/w比例添加 至面包中。
【文檔編號】A23L29/00GK106085995SQ201610429913
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月15日
【發(fā)明人】胡松青, 劉光, 侯軼, 李琳, 張亞萍, 王敬敬
【申請人】華南理工大學(xué)