專利名稱：：高抑菌活性ε-聚-L-賴氨酸組分的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物化工
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其是一種高抑菌活性e-聚-L-賴氨酸組分的制備方法。
背景技術(shù)：
：e-聚-L-賴氨酸(e-poly-L-lysine，簡(jiǎn)稱e-PL)是由白色鏈霉菌等菌種生物合成的一種氨基酸同型聚和物，是由單體L-賴氨酸的e-氨基和另一單體L-賴氨酸的a-羧基形成的酰胺鍵連接而成。e-PL水溶性好，微溶于乙醇，熱穩(wěn)定性高，抑菌譜廣，能夠抗革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、真菌、耐熱芽孢桿菌及病毒的活性，在人體內(nèi)分解為L(zhǎng)-賴氨酸。L-賴氨酸是人體必須的八種氨基酸之一，因此是一種安全高效的天然生物防腐劑。此外，"PL還可用做基因運(yùn)輸載體、藥物包被材料、電子材料，環(huán)保材料等，具有十分廣泛的應(yīng)用前景。近年來(lái)，隨著菌種性能的改造和發(fā)酵調(diào)控手段的改進(jìn)，e-PL的發(fā)酵生產(chǎn)效率不斷的提高。目前，我國(guó)公布的有關(guān)e-PL生產(chǎn)的主要專利有1.2000年7月12日，國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局公布了日本國(guó)巖田敏志等人在中國(guó)申請(qǐng)的名稱為"大量產(chǎn)生e-聚-L-賴氨酸的菌株和生產(chǎn)方法"的發(fā)明專利，專利號(hào)為971S2253.0。此專利提供一種較常規(guī)的提高菌株e-PL的生成能力以及大規(guī)模生產(chǎn)e-PL的方法。2.2005年11月16日，國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局公布了由南京工業(yè)大學(xué)申請(qǐng)的"利用北里孢菌PL6-3制備e-PL及其鹽的方法"發(fā)明專利，申請(qǐng)?zhí)枮?00510037774.2。該專利提出了一種通過(guò)篩選獲得的北里孢菌PL-3發(fā)酵生產(chǎn)e-PL的方法。3.2007年11月28日，國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局公布了由申請(qǐng)人自己申請(qǐng)的"回流工藝生產(chǎn)e-聚-L-賴氨酸的方法"發(fā)明專利，申請(qǐng)?zhí)枮?00610013800.2。該專利提出了一種回流工藝生產(chǎn)e-PL的方法，即在e-PL的發(fā)酵過(guò)程中，將提取過(guò)程的后期穿透液作為流加液，進(jìn)行流加發(fā)酵生產(chǎn)e-PL。后期穿透液作為流加液使用，提高了e-PL的產(chǎn)率，減少了發(fā)酵廢液和洗脫用鹽酸廢液的排放，減輕了環(huán)境兀然。2007年4月9日，申請(qǐng)人在已有專利的基礎(chǔ)上繼續(xù)申請(qǐng)了"一種大量產(chǎn)生e-1^的誘變菌株白色鏈霉菌1!^丁2及利用該誘變菌株11;8丁2采用發(fā)酵法生產(chǎn)"PL及其鹽的方法"的發(fā)明專利，申請(qǐng)?zhí)?00710057098.4。該專利利用從我國(guó)海南省土壤中篩選、誘變并鑒定的e-PL的生產(chǎn)菌株白色鏈霉3菌TUST2(CGMCCNo.1986)發(fā)酵生產(chǎn)s-PL，產(chǎn)量在1030g/L。已有研究表明，微生物發(fā)酵生產(chǎn)的e-PL分子量分布范圍較廣，不同聚合度的e-PL有著不同的理化性質(zhì)和用途；另外，e-PL分子量不同，它的抑菌效果有很大差別。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種高抑菌活性e-聚-L-賴氨酸組分的制備方法，該方法將現(xiàn)有工藝生產(chǎn)的e-PL按照不同分子量(不同聚和度)進(jìn)行分級(jí)處理，并收集具有高抑菌活性的e-PL組分。本發(fā)明的技術(shù)方案是一種高抑菌活性e-聚-L-賴氨酸組分的制備方法，其制備方法的步驟是(1).將e-PL發(fā)酵液經(jīng)離心去除菌體和蛋白后，通過(guò)脫色得到e-PL濾液；(2).將e-PL濾液加入到事先組裝好的各種截留分子量的微濾、超濾和納濾膜組合分離裝置中，進(jìn)行分離并分別獲得各種分子量分布的e-PL組分濾液；(3).驗(yàn)證e-PL濾液分子量范圍在2KDa5KDa內(nèi)，并通過(guò)濃縮、低溫冷凍干燥或噴霧干燥得到高抑菌活性的e-PL產(chǎn)品。而且，所述濾膜的材質(zhì)為聚砜、聚酰胺、細(xì)菌纖維素、再生纖維素或者其他適宜pH值在214的濾膜，其微濾膜的孔徑為0.2Pm，超濾和納濾膜的截留分子量分別為25KDa、10kDa、5kDa、2kDa、lkDa，采用微濾、超濾和納濾膜組合分離裝置進(jìn)行分離純化。而且，所述過(guò)濾分級(jí)處理的工作壓力可在0.051.0MPa，發(fā)酵液過(guò)濾的pH為中性，溫度為2040。C。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是本發(fā)明對(duì)e-聚-L-賴氨酸按分子量大小進(jìn)行膜組合技術(shù)分級(jí)處理，通過(guò)抑菌實(shí)驗(yàn)來(lái)確定具有高抑菌活性的分子量部分，從而制備具有高抑菌活性的合適分子量分布的s-聚-L-賴氨酸產(chǎn)品。應(yīng)用本發(fā)明的方法可以獲得不同分子量范圍的高純度的e-PL濾液，由于采用的是膜分離技術(shù)，不會(huì)對(duì)e-PL的活性產(chǎn)生任何影響，而且有利于各種不同分子量的e-PL的研究。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明；下述實(shí)施例是說(shuō)明性的，不是限定性的，不能以下述實(shí)施例來(lái)限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。需要說(shuō)明的是，本發(fā)明發(fā)酵液是按照"回流工藝生產(chǎn)e-聚-L-賴氨酸的"專利中的方法制備的，所用菌種為"一種大量產(chǎn)生"PL的誘變菌株鏈霉菌TUST2及利用該誘變菌株TUST2采用發(fā)酵法生產(chǎn)e-PL及其鹽法"專利中的菌種。法色方方白的本發(fā)明所用濾膜的材質(zhì)可以為聚砜、聚酰胺、細(xì)菌纖維素、再生纖維素或者其他適宜pH值在214的濾膜，微濾膜的孔徑為0.2um，超濾和納濾膜的截留分子量分別為25KDa、10kDa、5kDa、2kDa、lkDa，采用微濾、超濾和納濾膜組合分離裝置進(jìn)行分離純化。本發(fā)明過(guò)濾分級(jí)處理的工作壓力可在0.051.0MPa，發(fā)酵液過(guò)濾的pH為中性，溫度為25'C。本發(fā)明收集抑菌活性最高的分子量段為2KDa5KDa的e-PL溶液，經(jīng)噴霧干燥或冷凍干燥制成e-PL產(chǎn)品，用做食品防腐劑。下面給出具體實(shí)施例方式實(shí)施例1-含量20g/Le-PL發(fā)酵液離心分離菌體，經(jīng)脫色后所得溶液即可進(jìn)行膜組合分離裝置分離。取2000mle-PL濾液，逐級(jí)經(jīng)過(guò)0.2ym微濾膜、25KDa、lOKDa、5KDa、2KDa，lKDa超濾膜和納濾膜。其中微濾的操作壓力為0.05MPa，截留分子量為25KDa、lOKDa、5KDa的超濾膜的操作壓力為0.15MPa，截留分子量為2KDa的超濾膜的操作壓力為0.2MPa，lKDa的納濾膜的操作壓力為0.7旨a。微濾膜對(duì)e-PL濾液的截留率為O，透過(guò)液體積約為2000ml;通過(guò)25KDa超濾膜之后，透過(guò)液與濃縮液的體積比約為10:1;通過(guò)10KDa超濾膜之后，透過(guò)液與截留液的體積比約為7:1;通過(guò)5KDa超濾膜之后，透過(guò)液與截留液的體積比約為7:1;通過(guò)2KDa超濾膜之后，透過(guò)液與截留液的體積比約為2:1;最后通過(guò)lKDa納濾膜之后，透過(guò)液與濃縮液的體積比約為1:1。然后針對(duì)各個(gè)不同組分做抑菌實(shí)驗(yàn)。通過(guò)抑菌實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的結(jié)果(見附表l)，得出抑菌效果最好的分子量段為2KDa5KDa,收集這一部分的溶液，進(jìn)行濃縮經(jīng)冷凍干燥制成高抑菌活性e-PL產(chǎn)品。實(shí)施例2:e-PL產(chǎn)品粉末配置成20g/L溶液2L(pH為中性，溫度為25°C)，再依次通過(guò)微濾、超濾和納濾組合膜分離裝置進(jìn)行膜過(guò)濾分離。其中微濾的操作壓力為0.1MPa，截留分子量為25KDa、lOKDa、5KDa的超濾膜的操作壓力為0.2MPa，截留分子量為2KDa的超濾膜的操作壓力為0.25MPa，lKDa的納濾膜的操作壓力為lMPa。上述2000ml的e-PL溶液完全透過(guò)微濾膜；之后，通過(guò)25KDa超濾膜,透過(guò)液與截留液的體積比約為10:1;再通過(guò)10KDa超濾膜，透過(guò)液與截留液的體積比約為8:1;然后通過(guò)5KDa超濾膜之后，透過(guò)液與截留液的體積比約5為7:1;接著通過(guò)2KDa超濾膜，透過(guò)液與截留液的體積比約為2:1;最后通過(guò)lKDa納濾膜之后，透過(guò)液與截留液的體積比約為1:1。然后針對(duì)各個(gè)不同組分做抑菌實(shí)驗(yàn)。通過(guò)抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果，即可得出抑菌效果最好的分子量段為2KDa5KDa，收集這一部分的溶液，進(jìn)行濃縮后經(jīng)冷凍干燥制成高抑菌活性e-PL產(chǎn)品。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>權(quán)利要求1.一種高抑菌活性ε-聚-L-賴氨酸組分的制備方法，其特征在于制備方法的步驟是(1).將ε-PL發(fā)酵液經(jīng)離心去除菌體和蛋白后，通過(guò)脫色得到ε-PL濾液；(2).將ε-PL濾液加入到事先組裝好的各種截留分子量的微濾、超濾和納濾膜組合分離裝置中，進(jìn)行分離并分別獲得各種分子量分布的ε-PL組分濾液；(3).驗(yàn)證ε-PL濾液分子量范圍在2KDa～5KDa內(nèi)，并通過(guò)濃縮、低溫冷凍干燥或噴霧干燥得到高抑菌活性的ε-PL產(chǎn)品。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高抑菌活性e-聚-L-賴氨酸組分的制備方法，其特征在于所述濾膜的材質(zhì)為聚砜、聚酰胺、細(xì)菌纖維素、再生纖維素或者其他適宜pH值在214的濾膜，其微濾膜的孔徑為0.2ym，超濾和納濾膜的截留分子量分別為25KDa、10kDa、5kDa、2kDa、lkDa，采用微濾、超濾和納濾膜組合分離裝置進(jìn)行分離純化。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高抑菌活性e-聚-L-賴氨酸組分的制備方法，其特征在于所述過(guò)濾分級(jí)處理的工作壓力可在0.051.0Mpa，發(fā)酵液過(guò)濾的pH為中性，溫度為204(TC。全文摘要本發(fā)明涉及一種高抑菌活性ε-聚-L-賴氨酸(ε-PL)組分的制備方法，是采用微慮、超濾和納濾組合多級(jí)分離技術(shù)獲取不同分子量分布的ε-PL，經(jīng)抑菌實(shí)驗(yàn)確定最佳抑菌活性組分分子量范圍，進(jìn)而收集干燥獲得高抑菌活性組分ε-PL產(chǎn)品。應(yīng)用本發(fā)明的方法可以獲得不同分子量范圍的高純度的ε-PL，由于采用的是膜分離技術(shù)，不會(huì)對(duì)ε-PL的活性產(chǎn)生任何影響，而且有利于各種不同分子量的ε-PL的研究。文檔編號(hào)C08G69/00GK101486794SQ200810153709公開日2009年7月22日申請(qǐng)日期2008年12月3日優(yōu)先權(quán)日2008年12月3日發(fā)明者斌周,沈顏新,范寶慶,譚之磊,賈原媛,賈士儒申請(qǐng)人:天津科技大學(xué);浙江銀象生物工程有限公司