一種高溫活性和熱穩(wěn)定性提高的蛋白酶及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高溫活性和熱穩(wěn)定性提高的蛋白酶及其編碼基因，以來源于極端嗜熱古生菌Pyrococcus furiosus的蛋白酶Pfsp為母本，采用分子生物學(xué)技術(shù)對Pfsp的氨基酸序列進行改造，獲得了一種具有廣泛工業(yè)應(yīng)用前景的蛋白酶Pfsp?m。Pfsp?m的最適反應(yīng)溫度由對照的90℃提高到105℃；于90℃絕對酶活由對照的1396.24U/mg提高至6823.32U/mg，提高了4.89倍；于90℃絕對角蛋白酶酶活由對照的1116.99U/mg提高至6140.99U/mg，提高了5.50倍；于90℃半衰期由對照的6h延長至28h，提高了4.67倍。
【專利說明】
一種高溫活性和熱穩(wěn)定性提高的蛋白酶及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種高溫活性和熱穩(wěn)定性提高的蛋白酶及其制備方法和應(yīng)用，屬于基 因工程和酶工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 角蛋白是一類不溶性的硬質(zhì)蛋白，廣泛存在于生物體的組織中，是羽毛、毛發(fā)、羊 毛、指甲、犄角等的主要組成成分。角蛋白作為養(yǎng)殖業(yè)和皮革制造業(yè)的副產(chǎn)物，是一筆可觀 的再生利用蛋白質(zhì)資源。傳統(tǒng)的角蛋白處理工藝主要是高溫加熱酸堿水解法，這不僅會對 環(huán)境造成污染，而且還會破壞部分氨基酸，從而影響角蛋白的利用率。因此，發(fā)展生物降解 法(微生物法和酶法)對廢棄角蛋白質(zhì)進行回收和利用是角蛋白工業(yè)應(yīng)用的迫切需要。
[0003] 由于在高溫條件下降解角蛋白不僅可以提高反應(yīng)速度，使底物更容易被降解，還 能夠減少雜菌的生長。因此，尋找新的可以降解角蛋白的嗜熱微生物和嗜熱蛋白酶、提高可 以降解角蛋白的蛋白酶的活性和熱穩(wěn)定性有利于角蛋白的工業(yè)化應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供了一種高溫活性和熱穩(wěn)定性提高的蛋 白酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。
[0005] 本發(fā)明還提供一種編碼上述的蛋白酶的基因；所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
[0006] 本發(fā)明還提供一種能表達生產(chǎn)上述蛋白酶的載體。
[0007] 本發(fā)明還提供一種能表達生產(chǎn)上述蛋白酶的基因工程菌。
[0008] 本發(fā)明還提供一種上述蛋白酶的制備方法，以氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示的 蛋白酶Pfsp為出發(fā)序列，將第113位谷氨酸替換為谷氨酰胺、第189位丙氨酸替換為天冬酰 胺、第456位天冬氨酸替換為天冬酰胺、第458位天冬氨酸替換為天冬酰胺、第470位天冬氨 酸替換為天冬酰胺。
[0009] 上述的制備方法，具體步驟如下：
[0010] 1)根據(jù)Pyrococcus furiosus的蛋白酶Pfsp的基因序列，其基因序列如SEQ ID N0:4所示，采用化學(xué)全合成的方法合成優(yōu)化的基因后，將其克隆到質(zhì)粒pET-26b( + )中，構(gòu)建 重組質(zhì)粒；
[0011] 2)利用SWISS-MODEL軟件對蛋白酶Pfsp進行模擬，獲得蛋白酶Pfsp的三級結(jié)構(gòu)；
[0012] 3)通過BLASTP搜索比對，找出與蛋白酶Pfsp在氨基酸序列上高度相似的蛋白質(zhì)； 采用ClustalW2程序?qū)@些蛋白質(zhì)進行序列比對;通過對蛋白酶Pfsp的氨基酸序列和空間 結(jié)構(gòu)進行分析，確定要突變的氨基酸位點，分別為第113位谷氨酸、第189位丙氨酸、第456位 天冬氨酸、第458位天冬氨酸和第470位天冬氨酸；
[00?3 ] 4)設(shè)計突變引物，對蛋白酶Pf sp的氨基酸序列進行定點突變，將所述位點的氨基 酸進行替換，獲得含有蛋白酶突變體基因序列的重組載體；
[0014] 5)將含有蛋白酶突變體基因序列的重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21-C〇d 〇nPlus (DE3)-RIL，誘導(dǎo)表達，獲得蛋白酶突變體Pfsp-m。
[0015] 上述蛋白酶突變體Pfsp-m在洗滌劑工業(yè)、飼料、肥料、紡織、制革工業(yè)、醫(yī)藥領(lǐng)域的 應(yīng)用。
[00?6]本發(fā)明通過對蛋白酶Pf sp的氨基酸序列和模擬的三維結(jié)構(gòu)進行分析，選擇待突變 的氨基酸位點，采用定點突變技術(shù)得到了一個高溫活性和熱穩(wěn)定性提高的蛋白酶突變體 Pfsp-m〇
[0017] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點如下:本發(fā)明提供的蛋白酶突變體Pfsp-m的高溫 活性和熱穩(wěn)定性顯著提高;蛋白酶突變體Pfsp-m的最適反應(yīng)溫度由對照（突變前）的90°C提 高到105°C ;于90°C絕對酶活由對照（突變前）的1396.24U/mg提高至6823.32U/mg，提高了 4.89倍;于90 °C半衰期由對照（突變前）的6h延長至28h，提高了 4.67倍。與蛋白酶Pf sp相比， 蛋白酶突變體Pfsp-m對于表面活性劑、變性劑以及金屬離子螯合劑的耐受性明顯提高。蛋 白酶Pfsp和突變體Pfsp-m均能夠降解角蛋白；突變體Pfsp-m于90 °C絕對角蛋白酶酶活由對 照(Pf sp)的1116.99U/mg提高至6140.99U/mg，提高了 5.50倍。本發(fā)明的優(yōu)化改良蛋白酶突 變體Pfsp-m在飼料、肥料、紡織、洗滌劑、制革、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0018] 圖1蛋白酶Pfsp和蛋白酶突變體Pfsp-m純化樣品的SDS-PAGE檢測圖；
[0019]圖2蛋白酶Pfsp和蛋白酶突變體Pfsp-m的最適反應(yīng)溫度；
[0020]圖3蛋白酶Pfsp和蛋白酶突變體Pfsp-m在90 °C的熱穩(wěn)定性；
[0021 ]圖4蛋白酶Pfsp和蛋白酶突變體Pfsp-m的角蛋白酶酶活。
【具體實施方式】
[0022]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明一種高溫活性和熱穩(wěn)定性提高的蛋白酶及其制備 方法和應(yīng)用作進一步的詳細(xì)說明。
[0023]實驗條件：
[0024] 1、菌株與載體
[0025]大腸桿菌DH5a (購自 TaKaRa)，大腸桿菌BL21-CodonPlus(DE3)_RIL(購自 Stratagene)，大腸桿菌表達載體pET_26b( + )(購自Novagen公司）。
[0026] 2、酶類及其他生化試劑
[0027] KOD DNA聚合酶及KOD-Plus-neo DNA聚合酶購自Toyobo公司，DNA限制性內(nèi)切酶、 T4DNA連接酶、DNA Marker、低分子量蛋白質(zhì)Marker購自Fermentase公司，DNA膠回收試劑 盒、質(zhì)粒抽提試劑盒E.Z.N.A.購自O(shè)mega Bio-tek公司，酪蛋白、桿菌肽(bacitracin)購自 Sigma公司，可溶性角蛋白（來源于羊毛)購自百靈威科技，福林酚試劑、Bradford法蛋白濃 度測定試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司，其它化學(xué)試劑均為國產(chǎn)或進口分析 純。
[0028] 3、培養(yǎng)基
[0029]大腸桿菌的培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基（1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、l%NaCl，pH 7.0)。 篩選培養(yǎng)基采用含50yg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基。
[0030] 本發(fā)明中所用到的分子克隆技術(shù)和蛋白質(zhì)檢測技術(shù)均為本領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)。在 以下實施例中未作詳細(xì)介紹的技術(shù)，均按照如下實驗手冊中的相關(guān)部分來進行。Green Μ R,Sambrook J.Molecular cloning:a laboratory manual[M].New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，2012〇
[0031] 實施例1蛋白酶Pfsp基因合成、表達載體構(gòu)建及突變體構(gòu)建
[0032] (1)突變位點分析與方法
[0033] 利用SWISS-MODEL軟件對蛋白酶Pfsp進行模擬，獲得蛋白酶Pfsp的三級結(jié)構(gòu);通過 BLASTP搜索比對，找出與蛋白酶Pfsp在氨基酸序列上高度相似的蛋白質(zhì);采用ClustalW2程 序?qū)@些蛋白質(zhì)進行序列比對;通過對蛋白酶Pfsp的氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)進行分析，確 定要突變的氨基酸位點，分別為第113位谷氨酸、第189位丙氨酸、第456位天冬氨酸、第458 位天冬氨酸和第470位天冬氨酸;蛋白酶Pfsp的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示。
[0034] (2)基因優(yōu)化合成
[0035] 采用化學(xué)全合成的方法合成改造設(shè)計好的基因序列。
[0036] (3)表達載體的構(gòu)建
[0037]根據(jù)合成基因的序列設(shè)計PCR引物，上游引物P1含有Nde I內(nèi)切酶酶切位點，下游 引物P 2含有X h ο I內(nèi)切酶酶切位點；引物序列如下：上游引物？1:5'_ GGAATTC CATATG GCTCCAGAGAAGAAAGTTGAAd;下游引物Ρ2:5'-CCGCTCGAGTCAGCCATAATAAACTTTAGCC-3 '，其中下劃線部分為限制性內(nèi)切酶的切割位點。 [0038]以合成基因為模板，以PI、Ρ2為引物，進行PCR擴增;PCR擴增條件為:98°C5min; 98 °C 20sec，60°C20sec，74°C lmin，30個循環(huán)；74°C，10min;擴增產(chǎn)物經(jīng)Nde I和Xho I雙酶切， 連接至載體pET-26b (+)，構(gòu)建重組載體pET-26b (+) -Pf sp。
[0039] (4)突變體的構(gòu)建
[0040] 米用TransGen公司的Fast Mutagenesis System對蛋白酶Pfsp基因進行定點突 變，包含突變位點的重疊引物(表1)按照該產(chǎn)品說明書的要求進行設(shè)計，PCR等相關(guān)操作按 照該產(chǎn)品說明書進行。
[0041 ] 具體操作如下：
[0042] 以pET-26b( + )-Pfsp為模板，采用引物P3和P4,進行PCR擴增得到包含載體序列和 基因序列的線性片段;PCR擴增條件為:94°C5min;94°C30sec，55°C20sec，68°C4min，35個循 環(huán);68°C，10min;擴增產(chǎn)物經(jīng)Dpn I酶處理后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，卡那霉素抗性平板篩選轉(zhuǎn) 化子，經(jīng)測序鑒定是否為突變基因 PfspE113Q;在此基礎(chǔ)上，以pET-26b( + )-PfspE113Q為模 板，采用引物P5和P6，進行PCR擴增，重復(fù)以上實驗步驟，獲得重組載體pET-26b ( + )-PfspEl 13Q/A189N;在此基礎(chǔ)上，以 pET-26b( + )-Pf spEl 13Q/A189N 為模板，采用引物 P7 和 P8， 進行PCR擴增，重復(fù)以上實驗步驟，獲得重組載體pET-26b( + )-PfspE113Q/A189N/D456N/ D458N;在此基礎(chǔ)上，以 pET-26b( + )-PfspE113Q/A189N/D456N/D458N 為模板，采用引物 P9 和 P10,進行PCR擴增，重復(fù)以上實驗步驟，最終獲得重組載體pET-26b( + )-PfspE113Q/A189N/ D456N/D458N/D470N，即 pET-26b(+)-Pfsp-m。
[0043] 表1突變引物
[0044]
[0045] 注:下劃線部分為突變位點。
[0046]實施例2蛋白酶Pf sp和蛋白酶突變體Pf sp-m在大腸桿菌中的表達和純化
[0047] 上述兩種表達載體pET_26b( + )_Pf sp及pET_26b( + )_Pf sp-m通過熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿 菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL，分別獲得含有原基因和突變體基因的重組菌株。
[0048] 取含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL菌株和含有pET-26b( + )的 大腸桿菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL菌株(作為對照），分別接種于含有50yg/mL卡那霉素的 5mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C快速振蕩培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)物以1 %接種量轉(zhuǎn)接至含有50μ g/mL卡那霉素的50mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C快速振蕩培養(yǎng)至菌液ODsoo?達到0.4左右。加入 IPTG至其終濃度為0.25mM，繼續(xù)于16°C培養(yǎng)20h，12000r/min離心5min收集菌體沉淀。
[0049] 采用50mMHEPES，pH7.5緩沖液重懸并洗滌菌體沉淀，再加入適量50mMHEPES，pH 7.5緩沖液重懸菌體沉淀，置于冰上用超聲波破碎細(xì)胞。超聲波細(xì)胞破碎儀的參數(shù)設(shè)置如 下:超聲波功率為25 %，超聲波破碎時間為3sec，間歇6sec。超聲波處理菌體細(xì)胞至菌體懸 液變?yōu)榫坏娜芤?，采用SDS-PAGE檢測重組蛋白質(zhì)的表達情況。
[0050] 將目的蛋白質(zhì)所位于的細(xì)胞可溶成分于80°C保溫2h，12000r/min離心30min，去除 沉淀，收集上清。然后采用桿菌肽親和層析柱對上清中目的蛋白質(zhì)進行純化，用20% (v/v) 異丙醇洗脫緩沖液洗脫，即得到純化后的重組蛋白酶Pfsp和Pfsp-m。利用SDS-PAGE檢測重 組蛋白酶的純度，并采用Bradford法測定重組蛋白酶的濃度。SDS-PAGE檢測結(jié)果表明，蛋白 酶Pfsp及其突變體Pfsp-m均在大腸桿菌中成功表達，并且經(jīng)桿菌肽親和層析可以獲得純度 達90%以上的重組蛋白酶。
[00511實施例3蛋白酶Pfsp和蛋白酶突變體Pfsp-m的部分性質(zhì)分析 [0052] (1)蛋白酶酶活測定方法
[0053]以酪蛋白為底物測定蛋白酶酶活。按照如下表格中所示的反應(yīng)體系進行反應(yīng)。
[0054]
[0055] 待反應(yīng)完成后，從90°C水浴鍋中取出樣品，立即置于冰水混合物中使其迅速冷卻， 隨后加入40%TCA終止反應(yīng)。室溫放置15min后，12000r/min離心10min，吸取200yL上清轉(zhuǎn)移 到新的1.5mL Eppendorf管中，后依次加入lmL福林酚試劑和200yL 0.5M Na2C03后40°C顯色 20min，測定樣品的A66〇nm。根據(jù)酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線定義上述反應(yīng)體系中每分鐘釋放lyg酪氨酸 所需要的酶量為一個酶活單位(U)。
[0056] (2)蛋白酶Pf sp和蛋白酶突變體Pf sp-m的最適反應(yīng)溫度
[0057]以酪蛋白為底物，分別于20°C~115°C下測定蛋白酶Pfsp和突變體Pfsp-m的絕對 酶活，并以絕對酶活對溫度作圖，獲得溫度對這兩種重組蛋白酶的酶活影響的曲線，確定其 最適反應(yīng)溫度。其結(jié)果表明，Pfsp的最適反應(yīng)溫度為90°C，在此溫度下的絕對酶活力為 1396.24U/mg;突變體Pfsp-m的最適反應(yīng)溫度為105 °C，在此溫度下的絕對酶活力為 7547.35U/mg。并且突變體Pfsp-m于90°C絕對酶活由對照（Pfsp)的1396.24U/mg提高至 6823.32U/mg，提高了4.89倍。由此可見，突變體Pfsp-m的最適反應(yīng)溫度和高溫活性得到了 明顯的提尚。
[0058] (3)蛋白酶Pf sp和蛋白酶突變體Pf sp-m的熱穩(wěn)定性
[0059]將酶液于90°C保溫，分時間梯度取出部分樣品測定酶活力，計算相對酶活。將未處 理的酶液的酶活定義為100%，并以相對酶活的百分比對時間作圖，評價酶的熱穩(wěn)定性。測 定結(jié)果如圖3所示，突變體Pfsp-m于90 °C半衰期由對照（突變前）的6h延長至28h，提高了 4.67倍。以上穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明，蛋白酶突變體Pfsp-m具有更強的熱穩(wěn)定性。
[0000] (4)化學(xué)試劑對蛋白酶Pf sp和蛋白酶突變體Pf sp-m酶活性的影響
[0061] 向酶液中補加不同濃度的化學(xué)試劑，以酪蛋白為底物測定蛋白酶酶活。將未處理 的酶液的酶活定義為100%，計算相對酶活。測定結(jié)果如表二所示，與Pfsp相比，突變體 Pfsp-m耐受表面活性劑、變性劑以及金屬離子螯合劑的能力明顯提高;此外，還原劑對Pfsp 和突變體Pfsp-m的酶活基本無影響。
[0062] 表二化學(xué)試劑對蛋白酶活性的影響
[0063]
[0064]
[0065]實施例4蛋白酶Pfsp和蛋白酶突變體Pfsp-m的角蛋白酶酶活分析
[0066] 角蛋白酶酶活測定參照"蛋白酶酶活測定方法"，將底物替換為1%可溶性角蛋白， 分別于60 °C~100 °C下測定蛋白酶Pfsp和突變體Pfsp-m的絕對酶活，并以絕對酶活對溫度 作圖。其結(jié)果表明，蛋白酶Pfsp和突變體Pfsp-m均能夠降解角蛋白；與Pfsp相比，突變體 Pfsp-m的角蛋白酶酶活明顯提高，突變體Pfsp-m于90 °C絕對角蛋白酶酶活由對照（突變前） 的 111 6.99U/mg提高至6140.99U/mg，提高了 5.50倍。
[0067] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，任何熟悉本技術(shù) 領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā) 明的保護范圍的內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護范圍應(yīng)該以權(quán)利要求所界定的保護范圍為準(zhǔn)。
【主權(quán)項】
1. 一種高溫活性和熱穩(wěn)定性提高的蛋白酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1 所示。2. -種編碼權(quán)利要求1所述的蛋白酶的基因。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所 不。4. 一種能表達生產(chǎn)權(quán)利要求1所述的蛋白酶的載體。5. -種能表達生產(chǎn)權(quán)利要求1所述的蛋白酶的基因工程菌。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白酶的制備方法，其特征在于，以氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示的蛋白酶Pfsp為出發(fā)序列，將第113位谷氨酸替換為谷氨酰胺、第189位丙氨酸替換為 天冬酰胺、第456位天冬氨酸替換為天冬酰胺、第458位天冬氨酸替換為天冬酰胺、第470位 天冬氨酸替換為天冬酰胺。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，具體步驟如下： 1) 根據(jù)Pyrococcus furiosus的蛋白酶Pfsp的基因序列，其基因序列如SEQ ID N0:4所 示，采用化學(xué)全合成的方法合成優(yōu)化的基因后，將其克隆到質(zhì)粒pET-26b(+)中，構(gòu)建重組質(zhì) 粒； 2) 利用SWISS-M0DEL軟件對蛋白酶Pf sp進行模擬，獲得蛋白酶Pf sp的三級結(jié)構(gòu)； 3) 通過BLASTP搜索比對，找出與蛋白酶Pfsp在氨基酸序列上高度相似的蛋白質(zhì)；采用 ClustalW2程序?qū)@些蛋白質(zhì)進行序列比對;通過對蛋白酶Pfsp的氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu) 進行分析，確定要突變的氨基酸位點，分別為第113位谷氨酸、第189位丙氨酸、第456位天冬 氨酸、第458位天冬氨酸和第470位天冬氨酸； 4) 設(shè)計突變引物，對蛋白酶Pf sp的氨基酸序列進行定點突變，將所述位點的氨基酸進 行替換，獲得含有蛋白酶突變體基因序列的重組載體； 5) 將含有蛋白酶突變體基因序列的重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21-C〇d〇nPlus(DE3)-RIL，誘導(dǎo)表達，獲得蛋白酶突變體Pf sp-m，即高溫活性和熱穩(wěn)定性提高的蛋白酶。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白酶在洗滌劑工業(yè)、飼料、肥料、紡織、制革工業(yè)、醫(yī)藥領(lǐng)域 的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K38/48GK106085990SQ201610410742
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月12日 公開號201610410742.0, CN 106085990 A, CN 106085990A, CN 201610410742, CN-A-106085990, CN106085990 A, CN106085990A, CN201610410742, CN201610410742.0
【發(fā)明人】曾靜, 袁林, 郭建軍, 郭浩, 王林庚
【申請人】江西省科學(xué)院微生物研究所, 江西鑫維生物技術(shù)有限公司