一種鈦表面接枝ε-聚賴氨酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物材料技術(shù)領(lǐng)域，更加具體地說(shuō)，涉及一種生物純鈦(Ti)表面接枝ε -多聚賴氨酸(ε -PL)的方法，主要應(yīng)用于抗菌生物材料領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]鈦及鈦合金材料由于其良好的生物相容性，耐磨性，以及與人骨接近的彈性模量等，被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)用材料，如血管支架，牙種植體，人工關(guān)節(jié)等。生物材料相關(guān)感染是目前臨床種植體最重要的并發(fā)癥之一，感染一旦發(fā)生常常很難治療從而不得不去除種植體進(jìn)行二次手術(shù)。生物材料相關(guān)感染高發(fā)有兩個(gè)主要原因:第一，細(xì)菌粘附到種植體表面后會(huì)形成菌斑，菌斑里的細(xì)菌對(duì)宿主免疫力和抗菌治療有很高的抵抗力很難去除；第二，由于目前種植體的生物活性仍非很理想，種植體與周圍骨組織之間有一層無(wú)血管的纖維層，導(dǎo)致免疫細(xì)胞或通過(guò)全身給藥的抗生素難以到達(dá)種植體表面。因此，具有更好骨傳導(dǎo)特性從而能去除無(wú)血管纖維層以提高局部抵抗力，同時(shí)具有長(zhǎng)期抗菌特性以防止菌斑形成的表面涂層非常有必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，通過(guò)羥基(-0Η)和羧基(-C00H)官能團(tuán)的偶合，將ε -PL接枝到羥基化的純鈦上，制備出具有抗菌性的涂層，此種制備方法，操作方便，成本低廉，費(fèi)用低，耗時(shí)短，是一種高效經(jīng)濟(jì)的制備方法，可以改善鈦合金植入器械的抗菌性能。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)目的通過(guò)下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):
[0005]一種鈦表面接枝ε -聚賴氨酸的方法，按照下述步驟進(jìn)行:
[0006]步驟I，將金屬鈦進(jìn)行表面羥基化，選擇將純鈦放入5Μ (moI/DNaOH水溶液中，然后將其放在80°C恒溫水浴中進(jìn)行堿處理工藝，處理時(shí)間為6h，將堿處理完的鈦片在去離子水中超聲處理5min，在空氣中干燥；選擇將試樣命名為T1-OH。
[0007]步驟2，配制4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖水溶液，其中4-羥乙基哌嗪乙磺酸的濃度為20mM (mmol/L), NaCl為75mM，并利用NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH為7.4，利用4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖水溶液配置ε-聚賴氨酸溶液，所述ε-聚賴氨酸濃度為I 一 10mg/ml，將羥基化的鈦片放到該溶液進(jìn)行接枝，反應(yīng)時(shí)間為24— 40h，取出漂洗干燥，選擇將試樣命名為T1-ε-PL0
[0008]在進(jìn)行步驟I羥基化之前，選擇鈦片經(jīng)400#、1200#、2500#水砂紙依次打磨至表面光滑，無(wú)明顯缺陷，將打磨好的試樣依次在、無(wú)水乙醇、去離子水中超聲清洗，室溫下干燥。采用ε -聚賴氨的數(shù)均分子量為3600— 4500。
[0009]采用VERTEX80傅里葉變換紅外儀分析材料表面的官能團(tuán)組成和鍵合狀況，掃描范圍為4000-400CHT1，如附圖1所示。相對(duì)于Ti, T1-OH的FTIR譜線在1632cm_\3721cm_1兩處出現(xiàn)峰位，其中1632cm—1處吸收峰較為尖銳，是羥基(O-H)的伸縮振動(dòng)特征峰，同時(shí)也表明堿處理后，純鈦表面引入了羥基，3721CHT1處吸收峰較寬，是羥基與羥基之間形成的氫鍵的紅外特征峰。在T1- ε -PL的紅外譜線中，新出現(xiàn)的1653CHT1峰位是ε -聚賴氨酸的特征峰，為氨基(-NH2)的伸縮振動(dòng)峰，由于酯類物質(zhì)的在1300?1050cm-1區(qū)域有C-O的特征峰，1059cm-1峰位可能是脫水后形成的C-O的伸縮振動(dòng)峰。
[0010]細(xì)菌粘附實(shí)驗(yàn)選取大腸桿菌E.coli (革蘭氏陰性)和金黃色葡萄球菌S.aureus(革蘭氏陽(yáng)性)作為模型細(xì)菌，分別用T1、T1-0H、T1- ε -PL試樣對(duì)其的抗粘附作用進(jìn)行表征。實(shí)驗(yàn)所用容器和試樣在進(jìn)行粘附實(shí)驗(yàn)之前進(jìn)行滅菌。所用細(xì)菌濃度選為lXlOeCFUml—1，取50 μ I滴在試樣上，在37°C下培養(yǎng)6h。取出試樣后，用PBS沖洗3次，然后用2.5%戊二醛在4°C下固定lh，最后用依次用30%，50%，70%，80%，90%，95%，100%的梯度酒精進(jìn)行脫水處理后在變色硅膠提供的的干燥環(huán)境中保存，為SEM測(cè)試做準(zhǔn)備(采用HITACHIS-4800掃描電子顯微鏡)。
[0011]圖2和圖3分別是大腸桿菌E.coli和金黃色葡萄球菌S.aureus在T1、T1-OH,T1- ε -PL表面培養(yǎng)6h后的SEM圖片，可以看出，相比于Ti，T1-OH使大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的粘附能力均減弱，這是由于堿處理之后，材料表面的親水性增加，而親水性是不利于細(xì)菌的粘附。T1-ε-PL由于聚賴氨酸的存在，它的抗粘附性是最強(qiáng)的。研究表明ε-聚賴氨酸對(duì)革蘭式陽(yáng)性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌都有比較明顯的抑菌活性，分子中的氨基在水溶液中質(zhì)子化后帶正電，而細(xì)菌體表面一般是帶負(fù)電的，所以能夠比較容易的附著在菌體表面，進(jìn)而通過(guò)破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、抑制呼吸，影響蛋白質(zhì)合成等作用殺死細(xì)菌。
【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1為本發(fā)明中T1、T1-0H、T1-ε-PL的FTIR圖譜，其中I代表鈦(Ti)試樣，2代表輕基化的鈦(Ti)試樣,3代表接枝ε -聚賴氨酸的鈦(Ti)試樣。
[0013]圖2為大腸桿菌在不同試樣培養(yǎng)6h之后的SEM圖,其中(a)代表鈦(Ti)試樣,(b)代表羥基化的鈦(Ti)試樣T1-OH，(c)代表接枝ε -聚賴氨酸的鈦(Ti)試樣T1- ε -PL0
[0014]圖3為金黃色葡萄球菌在不同試樣培養(yǎng)6h之后的SEM圖，其中(a)代表鈦(Ti)試樣，(b)代表羥基化的鈦(Ti)試樣T1-OH，(c)代表接枝ε -聚賴氨酸的鈦(Ti)試樣T1-ε-PL0
【具體實(shí)施方式】
[0015]下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。使用材料為1mmX 14mmX Imm的純鈦片(純度為99.9%)作為試樣，無(wú)水乙醇(C2H6O,天津市華東試劑廠)，氫氧化鈉(NaOH，天津市華東試劑廠)，ε -聚賴氨(ε -Polylysine，天津聯(lián)星生物試劑公司)，4_羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES，天津聯(lián)星生物試劑公司)，氯化鈉(NaCl，天津聯(lián)星生物試劑公司)，變色硅膠(天津聯(lián)星生物試劑公司)，磷酸緩沖液(PBS，天津聯(lián)星生物試劑公司)，戊二醛(C5H8O2,美國(guó) Sigma-aldrich 公司)，梯度酒精(30%，50%, 70%, 80%, 90%, 95%，100%)?？咕鷮?shí)驗(yàn)中所用細(xì)菌為革蘭氏陰性大腸桿菌E.coli (天津醫(yī)科大學(xué)提供)和革蘭氏陽(yáng)性金黃色葡萄球菌S.aureus (天津醫(yī)科大學(xué)提供)。培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基，其組成為胰蛋白胨(10g/L)、酵母提取物(5g/L)、氯化鈉(NaCl，10/L)，固體培養(yǎng)基則需另加瓊脂(15/L)。實(shí)驗(yàn)中所涉及的藥品均為分析純級(jí)。
[0016]在進(jìn)行步驟I羥基化之前，選擇鈦片經(jīng)400#、1200#、2500#水砂紙依次打磨至表面光滑，無(wú)明顯缺陷，將打磨好的試樣依次在、無(wú)水乙醇、去離子水中超聲清洗，室溫下干燥。
[0017]實(shí)施例1
[0018]步驟I，將金屬鈦進(jìn)行表面羥基化，選擇將純鈦放入5M (mol/UNaOH水溶液中，然后將其放在80°C恒溫水浴中進(jìn)行堿處理工藝，處理時(shí)間為6h，將堿處理完的鈦片在去離子水中超聲處理5min，在空氣中干燥；
[0019]步驟2，配制4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖水溶液，其中4-羥乙基哌嗪乙磺酸的濃度為20mM(mmol/L)，NaCl為75mM，并利用NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH為7.4，利用4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖水溶液配置ε -聚賴氨酸溶液,所述ε -聚賴氨酸濃度為lmg/ml，將羥基化的鈦片放到該溶液進(jìn)行接枝，反應(yīng)時(shí)間為40h,取出漂洗干燥。
[0020]實(shí)施例2
[0021]步驟I，將金屬鈦進(jìn)行表面羥基化，選擇將純鈦放入5M (mol/UNaOH水溶液中，然后將其放在80°C恒溫水浴中進(jìn)行堿處理工藝，處理時(shí)間為6h，將堿處理完的鈦片在去離子水中超聲處理5min，在空氣中干燥；
[0022]步驟2，配制4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖水溶液，其中4-羥乙基哌嗪乙磺酸的濃度為20mM(mmol/L)，NaCl為75mM，并利用NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH為7.4，利用4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖水溶液配置ε-聚賴氨酸溶液，所述ε-聚賴氨酸濃度為10mg/ml，將羥基化的鈦片放到該溶液進(jìn)行接枝，反應(yīng)時(shí)間為24h，取出漂洗干燥。
[0023]實(shí)施例3
[0024]步驟I，將金屬鈦進(jìn)行表面羥基化，選擇將純鈦放入5M (moI/DNaOH水溶液中，然后將其放在80°C恒溫水浴中進(jìn)行堿處理工藝，處理時(shí)間為6h，將堿處理完的鈦片在去離子水中超聲處理5min，在空氣中干燥；
[0025]步驟2，配制4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖水溶液，其中4-羥乙基哌嗪乙磺酸的濃度為20mM(mmol/L)，NaCl為75mM，并利用NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH為7.4，利用4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖水溶液配置ε-聚賴氨酸溶液，所述ε -聚賴氨酸濃度為5mg/ml，將羥基化的鈦片放到該溶液進(jìn)行接枝，反應(yīng)時(shí)間為30h，取出漂洗干燥。
[0026]以上對(duì)本發(fā)明做了示例性的描述，應(yīng)該說(shuō)明的是，在不脫離本發(fā)明的核心的情況下，任何簡(jiǎn)單的變形、修改或者其他本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠不花費(fèi)創(chuàng)造性勞動(dòng)的等同替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種鈦表面接枝ε-聚賴氨酸的方法，其特征在于，按照下述步驟進(jìn)行: 步驟I，將金屬鈦進(jìn)行表面羥基化，選擇將純鈦放入5mol/LNaOH水溶液中，然后將其放在80°C恒溫水浴中進(jìn)行堿處理工藝，處理時(shí)間為6h，將堿處理完的鈦片在去離子水中超聲處理5min，在空氣中干燥； 步驟2，配制4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖水溶液，其中4-羥乙基哌嗪乙磺酸的濃度為20mmol/L, NaCl濃度為75mmol/L，并利用NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH為7.4，利用4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖水溶液配置ε -聚賴氨酸溶液，將羥基化的鈦片放到該溶液進(jìn)行接枝，取出漂洗干燥，所述ε -聚賴氨的數(shù)均分子量為3600— 4500。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鈦表面接枝聚賴氨酸的方法，其特征在于，在所述步驟2中，利用4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖水溶液配置的ε -聚賴氨酸溶液的濃度為I一1mg/ml，將羥基化的鈦片放到該溶液進(jìn)行接枝反應(yīng)時(shí)間為24— 40h。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鈦表面接枝聚賴氨酸的方法，其特征在于，在進(jìn)行步驟I羥基化之前，選擇鈦片經(jīng)400#、1200#、2500#水砂紙依次打磨至表面光滑，無(wú)明顯缺陷，將打磨好的試樣依次在、無(wú)水乙醇、去離子水中超聲清洗，室溫下干燥。
4.如權(quán)利要求1一3之一所述的一種鈦表面接枝ε-聚賴氨酸的方法在抗菌中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，選擇大腸桿菌和金黃色葡萄球菌。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鈦表面接枝ε-聚賴氨酸的方法，通過(guò)羥基和羧基官能團(tuán)的偶合，將ε-聚賴氨酸接枝到羥基化的純鈦上，制備出具有抗菌性的涂層，此種制備方法，操作方便，成本低廉，費(fèi)用低，耗時(shí)短，是一種高效經(jīng)濟(jì)的制備方法,可以改善鈦合金植入器械的抗菌性能。
【IPC分類】A61L27-54, A61L27-34, C23C22-68, A61L31-16, A61L27-06, A61L31-10, A61L31-02
【公開號(hào)】CN104667347
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201310636438
【發(fā)明人】王志鴻, 楊賢金, 崔振鐸, 朱勝利, 李朝陽(yáng), 梁硯琴
【申請(qǐng)人】天津大學(xué)
【公開日】2015年6月3日
【申請(qǐng)日】2013年12月2日