飲品中ε?聚賴氨酸含量和分子量的檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種飲品中ε?聚賴氨酸含量和分子量的檢測方法。本發(fā)明根據(jù)ε?聚賴氨酸聚陽離子的特征，使用大孔弱酸性陽離子D152從飲品中進行吸附提取，之后使用1 mol/L的鹽酸洗脫，能夠提取獲得飲品中95%的ε?聚賴氨酸，避免了飲品中其它物質對后續(xù)檢測造成的干擾；之后通過檢測提取的ε?聚賴氨酸在215 nm下的紫外吸收強度，計算獲得樣品中ε?聚賴氨酸的含量；通過檢測ε?聚賴氨酸在凝膠過濾色譜柱中的保留時間，計算獲得樣品中ε?聚賴氨酸的分子量。本發(fā)明所建立的飲品中ε?聚賴氨酸的高效液相檢測方法，能夠高效提取飲品中所含ε?聚賴氨酸，并且能夠同時檢測其中ε?聚賴氨酸的含量和分子量。
【專利說明】
飲品中ε-聚賴氨酸含量和分子量的檢測方法
技術領域
[0001]本發(fā)明涉及一種飲品中ε-聚賴氨酸含量和分子量的檢測方法。
【背景技術】
[0002]ε-聚賴氨酸最早于1977年Shima等篩選生物堿時發(fā)現(xiàn)的一種鏈霉菌次級代謝產物。它是由多個1-賴氨酸的α-羧基和ε-氨基通過酰胺鍵迭代連接而成的線性聚合物，其常見分子量為3.2-4.5 kDa，聚合度為25-35。ε-聚賴氨酸的pH耐受范圍寬，熱穩(wěn)定性較好，pH3.0時，100°C處理30 min或者120°C處理20 min，ε-聚賴氨酸仍具有生物活性。實驗證實ε-聚賴氨酸具有廣譜抑菌性，對革蘭氏陰性和陽性細菌均具有極強的抑制效果，對酵母菌、真菌乃至病毒也有抑制作用。并且該抑制效果與ε_聚賴氨酸分子量緊密相關，例如，ε_聚賴氨酸的聚合度小于9時(約1.17 kDa)基本無抑菌效果，ε-聚賴氨酸聚合度大于10(約1.30kDa)時則呈現(xiàn)出相應的抑菌效果。此外，毒理學研究和藥物動力學研究表明，適量范圍內的ε_聚賴氨酸對小鼠沒有毒性，不會在其組織和器官中積累，因此，ε-聚賴氨酸作為食品防腐劑是可以安全使用的。我國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會在2014年第5號文件中批準ε-聚賴氨酸及其鹽酸鹽作為新型食品添加劑可以在食品行業(yè)中使用。
[0003]但是如何從食品中高效、準確地檢測出添加的ε-聚賴氨酸的含量及其分子量都沒有報道。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的任務是提供一種飲品中ε_聚賴氨酸含量和分子量的檢測方法，實現(xiàn)本發(fā)明的技術方案如下；本發(fā)明所述的飲品中ε_聚賴氨酸的提取和檢測方法，具體步驟如下:
a).飲品中ε-聚賴氨酸的提取:取待測樣品10mL，將待測樣品70°C加熱10 min，10 000r/min離心10 min，然后收集上清液；
b).將Ig D152大孔弱酸性陽離子交換樹脂加入到收集的上清液中，之后將飲品上清液和D152大孔弱酸性陽離子交換樹脂的混合液以200 r/min的轉速攪拌混合5 !^!!，使得卜聚賴氨酸充分吸附在D152大孔弱酸性陽離子交換樹脂上；
c).使用Imol/L的鹽酸10 mL將ε-聚賴氨酸從D152大孔弱酸性陽離子交換樹脂上洗脫下來，洗脫液作為高效液相色譜檢測的對象；
d).高效液相色譜流動相配制:配制含0.01%硫酸的超純水溶液；
e).檢測條件:檢測過程中使用色譜柱為水相凝膠過濾色譜柱，流速為0.5mL/min，柱溫為30°C，樣品進樣量為20 yL，檢測時長為30 min，紫外檢測波長為215 nm;
f).將從飲品中提取獲得的ε_聚賴氨酸樣品進樣至高效液相色譜中。通過ε_聚賴氨酸在215 nm下的紫外吸收強度，計算獲得樣品中ε-聚賴氨酸的含量;通過樣品在凝膠色譜柱中的保留時間，計算獲得樣品中ε-聚賴氨酸的分子量。
[0005]g).e_聚賴氨酸分子量和其在凝膠過濾色譜柱中保留時間關系的標準曲線繪制:配制分子量為8、4、2、1 kDa的聚乙二醇標準溶液，分別通過高效液相色譜和示差折光檢測器檢測其在凝膠過濾色譜柱中的保留時間，之后制作樣品分子量和保留時間對應的標準曲線，其對應方程為Y=-0.908X+22.499,R2=0.9913，其中Y為1η(ε-聚賴氨酸分子量)，Χ為ε-聚賴氨酸在高效液相色譜中的保留時間；
h).ε-聚賴氨酸含量和紫外波長215 nm處吸收強度對應的標準曲線繪制:配制濃度為10、5、2.5、1、0.5、0.25 mg/L的ε-聚賴氨酸標準溶液，分別通過上述高效液相色譜方法檢測其在215 nm下的紫外吸收值。之后制作ε-聚賴氨酸濃度和在215 nm紫外吸收值相對應的標準曲線，其對應方程為Y=1.31 X 10—3 X + 7.02X10-2，R2=0.9945，Y為ε-聚賴氨酸濃度，X為樣品在215 nm下的吸收值。
[0006]與現(xiàn)有技術比較，本發(fā)明根據(jù)ε_聚賴氨酸聚陽離子的特征，使用大孔弱酸性陽離子D152從飲品中進行吸附提取，之后使用I mol/L的鹽酸洗脫，能夠提取獲得飲品中95%的ε_聚賴氨酸，避免了飲品中其它物質對后續(xù)檢測造成的干擾;之后通過檢測提取的ε_聚賴氨酸在215 nm下的紫外吸收強度，計算獲得樣品中ε-聚賴氨酸的含量;通過檢測ε-聚賴氨酸在凝膠過濾色譜柱中的保留時間，計算獲得樣品中ε-聚賴氨酸的分子量。本發(fā)明所建立的飲品中ε_聚賴氨酸的高效液相檢測方法，能夠高效提取飲品中所含ε-聚賴氨酸，并且能夠同時檢測其中ε_聚賴氨酸的含量和分子量，該方法具有靈敏度高、特異性強、自動化程度高、快速簡便、無污染、重現(xiàn)性好等特點，適宜普遍推廣和批量檢測。
【附圖說明】
[0007]圖1是表示1η(ε_聚賴氨酸平均分子量)和高效液相上保留時間的線性關系圖；
圖2是表示高效液相上的紫外峰吸收面積和ε-聚賴氨酸濃度的線性關系圖；
圖3是表示飲品中ε -聚賴氨酸在高效液相上的實際出峰圖。
[0008]【具體實施方式】:
以下進一步說明本發(fā)明。
[0009]本發(fā)明所述的一種飲品中ε-聚賴氨酸含量和分子量的檢測方法，具體步驟如下:
a.飲品中ε-聚賴氨酸的提取:取待測樣品10mL，將待測樣品70°C加熱10 min，10 000r/min離心10 min，然后收集上清液；
b.將Ig D152大孔弱酸性陽離子交換樹脂加入到收集的上清液中，之后將飲品上清液和D152大孔弱酸性陽離子交換樹脂的混合液以200 r/min的轉速攪拌混合5 min，使得ε-聚賴氨酸充分吸附在D152大孔弱酸性陽離子交換樹脂上；
c.使用Imol/L的鹽酸10 mL將ε-聚賴氨酸從D152大孔弱酸性陽離子交換樹脂上洗脫下來，洗脫液作為高效液相色譜檢測的對象；
d.高效液相色譜流動相配制:配制含0.01%硫酸的超純水溶液；
e.檢測條件:檢測過程中使用色譜柱為水相凝膠過濾色譜柱，流速為0.5mL/min，柱溫為30°C，樣品進樣量為20 yL，檢測時長為30 min，紫外檢測波長為215 nm;
f.將從飲品中提取獲得的ε-聚賴氨酸樣品進樣至高效液相色譜中。通過卜聚賴氨酸在215 nm下的紫外吸收強度，計算獲得樣品中ε-聚賴氨酸的含量;通過樣品在凝膠色譜柱中的保留時間，計算獲得樣品中ε-聚賴氨酸的分子量。
[0010]g.e-聚賴氨酸分子量和其在凝膠過濾色譜柱中保留時間關系的標準曲線繪制:配制分子量為8、4、2、1 kDa的聚乙二醇標準溶液，分別通過高效液相色譜和示差折光檢測器檢測其在凝膠過濾色譜柱中的保留時間，之后制作樣品分子量和保留時間對應的標準曲線，其對應方程為Y=-0.908X+22.499,R2=0.9913，其中Y為1η(ε-聚賴氨酸分子量)，Χ為ε-聚賴氨酸在高效液相色譜中的保留時間；
h.ε-聚賴氨酸含量和紫外波長215 nm處吸收強度對應的標準曲線繪制:配制濃度為10、5、2.5、1、0.5、0.25 mg/L的ε-聚賴氨酸標準溶液，分別通過上述高效液相色譜方法檢測其在215 nm下的紫外吸收值。之后制作ε-聚賴氨酸濃度和在215 nm紫外吸收值相對應的標準曲線，其對應方程為Y=1.31 X 10—3 X + 7.02X10-2，R2=0.9945，Y為ε-聚賴氨酸濃度，X為樣品在215 nm下的吸收值。
[0011]
結果評價:
a.使用該方法能夠提取獲得飲品中95%的ε-聚賴氨酸。例如向飲品中添加終濃度為10mg/L的ε-聚賴氨酸，使用該提取方法計算得到的ε-聚賴氨酸含量為9.5 mg/L。
[0012]b.不同分子量(8、4、2、1 kDa)的ε-聚賴氨酸樣品的出峰時間和ε-聚賴氨酸分子量的對數(shù)值呈現(xiàn)出很好的線性關系，其對應方程為Y=-0.908Χ+22.499, R2=0.9913，其中Y為In(ε_聚賴氨酸分子量)，Χ為ε-聚賴氨酸在高效液相色譜中的保留時間(圖1)。
[0013]c.不同濃度(10、5、2.5、1、0.5、0.25 mg/L)的ε-聚賴氨酸樣品對應的高效液相上的紫外峰吸收值和ε_聚賴氨酸濃度呈現(xiàn)出很好的線性關系，其對應方程為Y=1.31 X 10—3 X+ 7.02X10-2，R2=0.9945，Y為ε-聚賴氨酸濃度，X為樣品在215 nm下的吸收值(圖2)。
[0014]d.以添加有2 mg/L ε_聚賴氨酸的果粒橙飲料為測定對象，按照上述方法進行ε_聚賴氨酸提取后，進樣至高效液相色譜，其保留時間為15.420 min,215 nm處的紫外吸收值為1451(圖3)。根據(jù)保留時間計算出的平均分子量為4.21 kDa(實際值為4.15 kDa)，根據(jù)215 nm下紫外吸收值，計算獲得的ε-聚賴氨酸濃度約為1.9 mg/L(實際值為2 mg/L)。因此，該方法具有很高的準確性。
[0015]創(chuàng)新點:
ε_聚賴氨酸具有聚陽離子的特性，因此弱酸性陽離子交換樹脂能吸附飲品中ε_聚賴氨酸，可進行飲品中ε_聚賴氨酸的提取，避免飲品中其它物質對測量產生的影響。
[0016]本檢測方法，能夠同時檢測ε-聚賴氨酸的含量和分子量。
[0017]檢測過程中高效液相色譜的流動相中含有硫酸和水，硫酸的含量為0.01%，流動相流速為0.5 mL/min，柱溫為30°C，檢測時長為30 min，紫外檢測波長為215 nm。
[0018]本方法適用于飲品中ε-聚賴氨酸的檢測，包括果汁、啤酒等。
【主權項】
1.飲品中ε-聚賴氨酸含量和分子量的檢測方法，其特征在于，所述的檢測方法，具體步驟如下: a).飲品中ε-聚賴氨酸的提取:取待測樣品10mL，將待測樣品70°C加熱10 min，10 000r/min離心10 min，然后收集上清液； b).將Ig D152大孔弱酸性陽離子交換樹脂加入到收集的上清液中，之后將飲品上清液和D152大孔弱酸性陽離子交換樹脂的混合液以200 r/min的轉速攪拌混合5 !^!!，使得卜聚賴氨酸充分吸附在D152大孔弱酸性陽離子交換樹脂上； c).使用Imol/L的鹽酸10 mL將ε-聚賴氨酸從D152大孔弱酸性陽離子交換樹脂上洗脫下來，洗脫液作為高效液相色譜檢測的對象； d).高效液相色譜流動相配制:配制含0.01%硫酸的超純水溶液； e).檢測條件:檢測過程中使用色譜柱為水相凝膠過濾色譜柱，流速為0.5 mL/min，柱溫為30°C，樣品進樣量為20 yL，檢測時長為30 min，紫外檢測波長為215 nm; f).將從飲品中提取獲得的卜聚賴氨酸樣品進樣至高效液相色譜中； 通過ε-聚賴氨酸在215 nm下的紫外吸收強度，計算獲得樣品中ε-聚賴氨酸的含量;通過樣品在凝膠色譜柱中的保留時間，計算獲得樣品中聚賴氨酸的分子量； g).e_聚賴氨酸分子量和其在凝膠過濾色譜柱中保留時間關系的標準曲線繪制:配制分子量為8、4、2、1 kDa的聚乙二醇標準溶液，分別通過高效液相色譜和示差折光檢測器檢測其在凝膠過濾色譜柱中的保留時間，之后制作樣品分子量和保留時間對應的標準曲線，其對應方程為Y=-0.908X+22.499，R2=0.9913，其中Y為1η( ε-聚賴氨酸分子量)，X為ε-聚賴氨酸在高效液相色譜中的保留時間； h).ε -聚賴氨酸含量和紫外波長215 n m處吸收強度對應的標準曲線繪制:配制濃度為10、5、2.5、1、0.5、0.25 mg/L的ε-聚賴氨酸標準溶液，分別通過上述高效液相色譜方法檢測其在215 nm下的紫外吸收值； 之后制作ε -聚賴氨酸濃度和在215 nm紫外吸收值相對應的標準曲線，其對應方程為Y=1.31X10-3 X + 7.02X10-2，R2=0.9945，Y為ε-聚賴氨酸濃度，X為樣品在215 nm下的吸收值。
【文檔編號】G01N30/02GK106053669SQ201610557994
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月15日
【發(fā)明人】劉友華, 徐虹, 陳永煊, 馮小海, 李莎, 許召賢, 余清
【申請人】福建省產品質量檢驗研究院