一種酶的固定化方法及應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種簡便的方法用于重組酶的固定化，該方法利用重組蛋白的組氨酸標簽與金屬離子親和層析樹脂專一性結合的特點，從而將酶固定于樹脂上，制備固定化酶。以羰基還原酶固定化酶連續(xù)生產(chǎn)手性醇，大幅度提高了時空產(chǎn)率。
【專利說明】
一種酶的固定化方法及應用
技術領域
[0001]本發(fā)明屬于酶固定化技術領域，具體涉及一種簡便的方法用于具有組氨酸標簽的重組酶的固定化，并提供了羰基還原酶固定化酶應用于生物催化生產(chǎn)手性醇的方法。
【背景技術】
[0002]生物催化過程具有典型的優(yōu)勢，如反應效率高、立體選擇性高以及反應條件溫和、有機溶劑用量少，對環(huán)境友好等，已經(jīng)成為當前綠色生物制造的一大潮流，并越來越廣泛地應用于化學品生產(chǎn)。然而，天然酶往往存在一些不足，如穩(wěn)定性較差，生物催化反應后與產(chǎn)物等形成難以分離的混合體系，這些缺點不利于酶在工業(yè)上的應用。另外，酶成本高也是制約其應用的關鍵因素之一。利用酶的固定化技術可以重復利用酶，降低酶成本，增加酶的穩(wěn)定性，產(chǎn)物易分離，因而廣泛應用于食品工業(yè)、精細化學品工業(yè)、醫(yī)藥、廢水處理等領域。
[0003]在酶的固定化研究中，合適的固定化載體是首要考慮的因素。除了傳統(tǒng)的固定化載體，近年來發(fā)展了基于金屬離子層析技術的固定化方法。該方法通過在固體材料上連接金屬離子作為配體，與蛋白質的一些特異氨基酸如組氨酸、半胱氨酸、色氨酸等產(chǎn)生親和作用，從而將酶固定于載體上。目前應用于酶固定化的這些載體均是實驗室自己制備，工藝較為復雜，重復性難以保證，應用范圍有限。
[0004]隨著重組蛋白純化技術的發(fā)展，商品化的金屬離子層析樹脂也快速發(fā)展，其特異性、蛋白載量、耐受還原劑能力、穩(wěn)定性、重復利用和再生能力等都得到了巨大改善。目前商品化的頂AC載體主要是N1-NTA和N1-1DA兩種，前者是以瓊脂糖或者其他基質共價連接NTA基團，NTA基團與Ni形成四價螯合物，并留下Ni兩價用于與其他基團結合。同樣作用的還有IDA基團(亞氨基二乙酸)，但NTA相對比較耐還原劑，因此使用較多。
[0005]以商品化鎳離子親和層析樹脂直接用于具有組氨酸標簽重組酶的固定化更加簡便，易獲得，重復性高，低成本和高效。該固定化方法可將重組蛋白的粗酶液直接與固定化材料結合，無須純化酶，且固定化材料可以反復再生利用，節(jié)約成本。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種固定化酶的方法及應用，具體來說，利用重組酶蛋白具有組氨酸標簽的特點，與金屬親和層析樹脂結合，從而將酶固定于樹脂上，制備固定化酶。同時，本發(fā)明還提供了羰基還原酶固定化酶在生物催化中的應用。
[0007]本發(fā)明的技術方案詳述如下:
[0008]以具有組氨酸標簽的重組酶酶液與金屬離子親和層析樹脂混合，使酶與樹脂充分結合，棄去酶液，得到固定化酶。
[0009]所述具有組氨酸標簽的重組酶包括在N-端，或者在C-端，或者在這兩端均有組氨酸的酶，組氨酸的數(shù)量為6?1個。
[0010]所述具有組氨酸標簽的重組酶可以與金屬離子親和層析樹脂專一性結合，因此本發(fā)明采用純酶或者粗酶液能達到同樣的效果。
[0011]所述的金屬離子親和層析樹脂為:Ni2+、Co2+、Cu2+等金屬離子與瓊脂糖交聯(lián)而成的親和樹脂，可以與具有組氨酸標簽的酶共價結合，優(yōu)選N1-NTA或者N1-1DA。
[0012]所述的結合條件優(yōu)選為4?25°C，50?100rpm，0.5?5h。
[0013]本發(fā)明還提供了羰基還原酶ChKRED20固定化酶在生物催化中的應用。
[0014]羰基還原酶ChKRED20固定化酶的生物催化體系為:
[0015]緩沖液、異丙醇、NAD+、固定化酶和底物。
[0016]緩沖液為磷酸鉀緩沖液或者Tris-HCl緩沖液。磷酸鉀(磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀)緩沖液 100mM，pH 7.0?8.0c3Tris-HCl緩沖液為25mM Tris、50mM NaCl，pH 8.0。
[0017]異丙醇濃度10%?80% (v/v)。
[0018]NAD+濃度0.2 ?0.5g/l。
[0019]固定化酶酶量，指含有的目標酶(羰基還原酶0110^020)純酶量，濃度1?1(^/1。
[0020]底物溶解于異丙醇中，優(yōu)選終濃度10?400g/l。
[0021]優(yōu)選反應條件為30?50°C。
[0022]本發(fā)明的有益效果:
[0023](I)以金屬離子親和層析樹脂直接用于具有組氨酸標簽重組酶的固定化更加簡便，低成本和高效。該固定化方法可將重組蛋白的粗酶液直接與固定化材料結合，無須純化酶。與傳統(tǒng)固定化方法相比，該方法所用的固定化材料可以反復再生利用，節(jié)約成本。且金屬離子層析樹脂可以直接購買、易獲得，重復性好，易于推廣使用。
[0024](2)本發(fā)明首次以商品化N1-NTA或N1-1DA為載體用于羰基還原酶的固定化，并連續(xù)反應制備手性醇，大幅度提尚了時空廣率。
【附圖說明】
[0025]附圖為固定床連續(xù)反應裝置示意圖
【具體實施方式】
[0026]以下結合實施實例對本發(fā)明做進一步說明，需要指出的是，本實施例僅用于解釋本發(fā)明，而非對本發(fā)明范圍的限制。
[0027 ] 實施例1羰基還原酶ChKRED20固定化酶的制備
[0028]羰基還原酶ChKRED20(NCBI登錄號:KC342020)重組菌的構建方法、異源表達、酶純化等為本領域常規(guī)方法。在該酶基因的兩端分別加入酶切位點為EcoR I和Sal I，連入同樣雙酶切后的pET 28a( + )載體片段，得到重組質粒pET 28a_ChKRED20，并轉入大腸桿菌BL21(DE3)中構建重組菌。該基因在大腸桿菌中異源表達后的酶在N-端具有6個組氨酸，構成了組氨酸標簽，可以與金屬親和樹脂結合。
[0029]羰基還原酶ChKRED20的誘導表達:挑取重組菌單克隆至LB(含卡那霉素50yg/ml)培養(yǎng)基中，37°C、200rpm，培養(yǎng)16h作為種子液，再以1%的接種量轉接至TB(含卡那霉素50μg/ml)培養(yǎng)基中，37 °C、200rpm，培養(yǎng)3h，加入IPTG誘導(終濃度為0.2mM)，30 °C繼續(xù)培養(yǎng)至24h。離心(8000印111，4°(:，101^11)收集菌體，生理鹽水洗滌(0.8%，《八)洗滌2次，離心，獲得濕菌體。
[0030]將上述獲得的濕菌體重懸于緩沖液中(1mM Tris，300mM NaCl，1mM咪唑，pH8.0)，經(jīng)高壓均質機破碎后，冷凍離心(12000rpm，4°C，20min)，得到的上清液即為粗酶液。粗酶液以鎳親和層析樹脂純化，得到純酶。蛋白純化過程為本領域的一般方法。
[0031]純化蛋白所用的緩沖液如下。
[0032]結合液:10mMTris,300mM NaCl，1mM咪唑(pH8.0)
[0033]漂洗液:10mMTris,300mM NaCl，20mM咪唑(ρΗ8.0)
[0034]洗脫液:10mMTris，300mM NaCl，250mM咪唑(ρΗ8.0)
[0035]將洗脫得到的ChKRED20酶液進行2次透析，第一次透析緩沖液為:25mM Tris，50mMNaCl，2mM DTT ,ImM EDTA，pH8.0，4°C，lOOrpm，12h。第二次透析的緩沖液為 25mM Tris，50mMNaCl，pH8.0，4°C，100rpm，12h。
[0036]將透析后得到的純酶液(濃度4.25mg/ml)50ml與用緩沖液平衡的5mlN1-NTA樹脂(Genscript，南京金斯瑞生物科技有限公司)混合，4°C，10rpm結合3h。樹脂的平衡的緩沖液組分為:1mM Tris，300mM NaCl，1mM咪唑(pH8.0)。之后棄去酶液，得到固定化酶。測定酶液中殘余酶濃度為0.85mg/ml，因此計算出結合的酶量為17Omg。
[0037]上述固定化酶用20ml異丙醇溶液平衡固定化酶30min，異丙醇濃度為20%，v/v，配置于緩沖液中，緩沖液為25mM Tris、50mM NaCl，pH 8.0。
[0038]由于羰基還原酶ChKRED20具有6個組氨酸標簽，可以N1-NTA專一性結合，因此本發(fā)明采用粗酶液與N1-NTA樹脂結合可以達到同樣的效果。
[0039]實施例2羰基還原酶ChKRED20固定化酶與純酶生物催化效率的比較
[0040](I)純酶的反應體系:磷酸鉀緩沖液中(10mM，pH 7.0)包含以下組分，1 % (v/v)異丙醇，0.2g/l NAD+，2g/l ChKRED20純酶以及底物2-氯-l-(3，4-二氟苯基)乙酮，濃度100g/lo4(TC，200rpmo
[0041](2)固定化酶的反應體系:固定化酶的制備方法同實施例1。固定化酶2g/l(該濃度指的是固定化酶中含有的目標酶量)，其余條件同純酶反應體系。
[0042]反應初期的催化效率兩者無明顯差別(反應時間Ih，轉化率45%左右)，隨著時間的延長，固定化酶的催化效率比純酶高。反應時間為14h時，固定化酶的轉化率為98 %，而純酶的轉化率只有94%。因此，固定化酶可以忍受較高濃度的底物，其在生物催化體系中的失活速度更慢，從而表現(xiàn)出在相同時間內更高的轉化率。
[0043]以上生物催化反應得到的產(chǎn)物(S)-2_氯-1-(3，4_二氟苯基)乙醇，ee值〉99%。
[0044]實施例3羰基還原酶ChKRED20固定化酶催化不同濃度的底物
[0045]固定化酶制備時以粗酶液代替純酶液，其余同實施例1。
[0046]反應體系:磷酸鉀緩沖液中(100mM，pH7.0)，10% (v/v)異丙醇，0.2g/l NAD+，5g/I ChKRED20固定化酶(含有的目標酶量)，以及底物2-氯-1 - (3，4-二氟苯基)乙酮。反應條件為 40°C，200rpm。
[0047]底物濃度為50g/l，完全轉化(轉化率>99%)需要的時間為6h;濃度為100g/l，完全轉化需要的時間為1h;底物濃度為150g/l，完全轉化的時間為24h。時空產(chǎn)率(Space timeyield)在底物濃度為100g/l最高，為10g/(l.h)。當?shù)孜餄舛壤^續(xù)增加到200g/l，24h內轉化率為92%。
[0048]以上生物催化反應得到的產(chǎn)物(S)-2_氯-1-(3，4_二氟苯基)乙醇，ee值〉99%。
[0049]實施例4羰基還原酶ChKRED20固定化酶單批次生物催化
[0050]固定化酶的制備方法同實施例1。
[0051 ] (I)底物為3，5雙三氟甲基苯乙酮
[0052]反應體系:磷酸鉀緩沖液中(100mM，pH 7.0)，40% (v/v)異丙醇，0.2g/l NADMg/I ChKRED20固定化酶(含有的目標酶量)，以及底物3，5雙三氟甲基苯乙酮，濃度400g/l。反應條件:30 °C，200rpm，24h。
[0053]將單次反應結束后的固定化酶回收，再次用于下一輪生物催化反應。前4輪反應的轉化率>95%，第5輪反應的轉化率為94% ;第6輪反應的轉化率為92%。
[0054]上述生物催化反應得到產(chǎn)物為(R)-3，5_雙三氟甲基苯乙醇，ee值〉99.9%。
[0055](2)底物為2-氯-1-(3，4_ 二氟苯基)乙酮
[0056]反應體系:磷酸鉀緩沖液中(100mM，pH7.0)，10% (v/v)異丙醇，0.2g/l of NAD+，5g/l ChKRED20固定化酶(含有的目標酶量)，以及底物2-氯-l-(3，4-二氟苯基)乙酮，濃度150g/l。反應條件:40°C，200rpm，24h。
[0057]將單次反應結束后的固定化酶回收，再次用于下一輪生物催化反應。在前4批次反應中，反應時間為1h就能達到轉化率99%以上；固定化酶重復利用8批次，其活力仍能保持90%以上，展示了良好的催化能力和穩(wěn)定性，具有連續(xù)生物催化的潛力。
[0058]以上生物催化反應得到的產(chǎn)物(S)-2_氯-1-(3，4_二氟苯基)乙醇，ee值〉99%。
[0059]實施例5羰基還原酶ChKRED20以N1-1DA載體制備固定化酶
[0060]羰基還原酶ChKRED20酶的制備方法同實施例1。將得到的純酶液(濃度4.25mg/ml)50ml與用緩沖液平衡的5ml N1-1DA樹脂(品牌為BBI)混合，4°C，10rpm結合3h。樹脂的平衡的緩沖液組分為:1mM Tris,300mM NaCl，1mM咪唑(pH8.0)。之后棄去酶液，得到固定化酶。測定酶液中殘余酶濃度為0.73mg/ml，因此計算出結合的酶量為176mg。
[0061]反應體系為:磷酸鉀緩沖液中(100mM，pH 7.0)，40% (v/v)異丙醇，0.2g/l NAD+，固定化酶2g/l (含有的目標酶量)，以及底物3，5雙三氟甲基苯乙酮，濃度10(^/1。30°(:，200rpm。反應時間15h，轉化率99.8%，得到產(chǎn)物為(R)-3，5-雙三氟甲基苯乙醇，ee值〉99.9%0
[0062]實施例6具有8個組氨酸標簽的羰基還原酶ChKRED20固定化酶生物催化
[0063]利用定點突變的方法在羰基還原酶ChKRED20的N-端6個組氨酸之后再突變2個氨基酸為組氨酸，得到8個組氨酸標簽的酶ChKRED20-His 8。
[0064]羰基還原酶ChKRED20_His8異源表達、固定化酶的制備方法同實施例1。反應體系為:磷酸鉀緩沖液中(10mM，pH 7.0)，10 % (v/v)異丙醇，0.2g/l NAD+，固定化酶2g/l (含有的目標酶量)，以及底物2-氯-l-(3，4-二氟苯基)乙酮，濃度lOOg/ljOt:，200rpm，24h。反應時間18h，轉化率99%，得到產(chǎn)物(S)-2-氯-1-(3，4-二氟苯基)乙醇，ee值>99%。
[0065]實施例7羰基還原酶ChKRED20固定化酶填充床反應器連續(xù)生物催化
[0066]填充床反應器的示意圖如附圖所示，固定化酶置于反應器底部，底物反應液通過栗從上端進入，產(chǎn)物混合物從下端流出。該裝置通過夾套控溫，使床層維持恒定的溫度。
[0067]底物反應液為:高濃度底物(溶解于異丙醇中，占總反應液體積的70%)，NAD+(0.2g/1)，緩沖液(Tris 25mM，NaCl 50mM，pH8.0)。反應體系中加入NiS〇4、DTT等，可以提高填充床反應器反應體系的穩(wěn)定性。
[0068]填充床連續(xù)反應中，緩沖液均為Tris 25mM，NaCl 50mM，pH8.0，以下實施例相同。
[0069]產(chǎn)物混合物為:高濃度產(chǎn)物(溶解于異丙醇)，NAD+，緩沖液以及生成的丙酮和未完全轉化的少量底物。
[0070](I)底物為3，5_雙三氟甲基苯乙酮，濃度為100g/l，填充床固定化酶酶量160mg(含有的目標酶量)，固定化酶體積4.5ml，反應溫度40°C。反應液組分為底物溶解于異丙醇中(占70 %體積)，NAD+ (0.2g/1)，緩沖液(占30 %體積)。
[0071]時空產(chǎn)率(Space Time Yield，STY)又稱時空收率或時空得率。指在給定反應條件下，單位時間內，單位體積(或質量)催化劑能獲得某一產(chǎn)物量。它是衡量催化劑活性大小及反應器裝置生產(chǎn)能力的標志之一。
[0072]時空產(chǎn)率=產(chǎn)物量/(床層體積*時間)。
[0073]流速為0.5ml/min時，轉化率99.7%,計算的時空產(chǎn)率為664g/( 1.h)。流速為
0.8ml/min時，轉化率99.3%，計算的時空產(chǎn)率為1059g/(l.h)。流速為0.9ml/min時，轉化率95 %，計算的時空產(chǎn)率為1140g/(l.h)o時空效率為自由酶生物催化的100倍。
[0074]以流速為0.8ml/min進行填充床生物催化反應，連續(xù)反應72h，轉化率保持>99%。
[0075]以上生物催化反應得到的產(chǎn)物為(R)-3，5_雙三氟甲基苯乙醇，ee值〉99.9%。
[0076](2)底物為2-氯-1-(3，4-二氟苯基)乙酮，濃度5(^/1，填充床固定化酶酶量16011^(含有的目標酶量)，固定化酶體積4.5ml，反應溫度40°C。反應液組分為:底物溶解于異丙醇中(占70 %體積)，NAD+ (0.2g/1)，緩沖液(占30 %體積)。
[0077]流速為0.08ml/min時，轉化率99.1%,計算的時空產(chǎn)率為53g/( 1.h)。流速為
0.09ml/min時，轉化率99.1 %，計算的時空產(chǎn)率為60g/(l.h)。流速為0.10ml/min時，轉化率90%，計算的時空產(chǎn)率為60g/(l.h)。時空產(chǎn)率為自由酶生物催化的5倍以上。
[0078]以流速為0.09ml/min進行填充床生物催化反應，連續(xù)反應24h，轉化率>98%。
[0079]以上生物催化反應得到的產(chǎn)物(S)-2_氯-1-(3，4_二氟苯基)乙醇，ee值〉99%。
[0080](3)底物為4-氯乙酰乙酸乙酯，濃度320g/l，填充床固定化酶酶量160mg(含有的目標酶量)，固定化酶體積4.5ml，反應溫度40 0C。
[0081]&.反應液組分為:底物溶解于異丙醇中(占70%體積)，嫩0+(0.28/1)，緩沖液(占30%體積)。
[0082]流速為0.6ml/min時，轉化率99%，ee值>99%，計算的時空產(chǎn)率為2534g/(l.h)。
[0083]b.反應液組分為:底物溶解于異丙醇中(占70%體積)，NAD+(0.2g/l)，5mM NiSO4，2mM DTT，緩沖液(占30 %體積)。
[0084]流速為0.6ml/min時，轉化率99%，ee值>99%，計算的時空產(chǎn)率為2534g/(l.h)。時空產(chǎn)率為自由酶催化的8倍左右。
[0085]以上生物催化反應得到的產(chǎn)物(S)-4_氯-3-輕基丁酸乙酯，ee值〉99%。
[0086]實施例8突變體M135固定化酶填充床反應器連續(xù)生物催化
[0087]突變體酶為羰基還原酶ChKRED20耐熱性突變體M135(Appl Microb1lB1technol.2016.100(8): 3567-3575)。固定化酶的制備方法同實施例1。
[0088]底物為2-氯-l-(3，4-二氟苯基)乙酮，濃度50g/l，填充床固定化酶酶量130mg(含有的目標酶量)，固定化酶體積4ml，反應溫度50°C。反應液組分為:底物溶解于異丙醇中(占70 % 體積)，NAD+ (0.2g/l)，緩沖液(占 30 %體積)。緩沖液為Tris 25mM，NaCl 50mM，pH8.0。
[0089]流速為0.12ml/min時，轉化率99%，計算的時空產(chǎn)率為90g/(l.h)。連續(xù)反應30h，轉化率保持>98%。
[0090]以上生物催化反應得到的產(chǎn)物(S)-2_氯-1-(3，4_ 二氟苯基)乙醇，ee值〉99%。
【主權項】
1.一種酶的固定化方法，其特征是利用重組酶蛋白具有組氨酸標簽的特點，與金屬親和層析樹脂專一性結合，從而將酶固定于樹脂上，制備固定化酶。2.權利要求1所述的酶的固定化方法在羰基還原酶固定化酶生產(chǎn)手性醇中的應用。3.權利要求1所述的酶的固定化方法，其特征是固定化酶的制備步驟為:重組酶酶液與金屬離子親和層析樹脂混合，使酶與樹脂充分接觸后進行結合，棄去酶液，得到固定化酶。4.權利要求1所述的酶的固定化方法，其特征是具有組氨酸標簽的重組酶包括在N-端，或者在C-端，或者在這兩端均有組氨酸的酶，組氨酸的數(shù)量為6?10個。5.權利要求1所述的酶的固定化方法，其特征是金屬離子親和層析樹脂為:Ni2+、Co2+、Cu2+等金屬離子與瓊脂糖交聯(lián)而成的親和樹脂，可以與具有組氨酸標簽的酶共價結合。6.權利要求1和3所述的結合條件為4?25°C，50?100rpm，0.5?5h。7.權利要求3所述的酶的固定化方法，其特征是重組酶酶液為純酶或者粗酶液。8.權利要求5所述的金屬離子親和層析樹脂為N1-NTA或者N1-1DA。
【文檔編號】C12N11/04GK105969757SQ201610395274
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年6月3日
【發(fā)明人】吳中柳, 劉艷
【申請人】中國科學院成都生物研究所