一種酶的固定化方法及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種簡便的方法用于重組酶的固定化，該方法利用重組蛋白的組氨酸標(biāo)簽與金屬離子親和層析樹脂專一性結(jié)合的特點(diǎn)，從而將酶固定于樹脂上，制備固定化酶。以羰基還原酶固定化酶連續(xù)生產(chǎn)手性醇，大幅度提高了時(shí)空產(chǎn)率。
【專利說明】
一種酶的固定化方法及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于酶固定化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種簡便的方法用于具有組氨酸標(biāo)簽的重組酶的固定化，并提供了羰基還原酶固定化酶應(yīng)用于生物催化生產(chǎn)手性醇的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]生物催化過程具有典型的優(yōu)勢，如反應(yīng)效率高、立體選擇性高以及反應(yīng)條件溫和、有機(jī)溶劑用量少，對環(huán)境友好等，已經(jīng)成為當(dāng)前綠色生物制造的一大潮流，并越來越廣泛地應(yīng)用于化學(xué)品生產(chǎn)。然而，天然酶往往存在一些不足，如穩(wěn)定性較差，生物催化反應(yīng)后與產(chǎn)物等形成難以分離的混合體系，這些缺點(diǎn)不利于酶在工業(yè)上的應(yīng)用。另外，酶成本高也是制約其應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一。利用酶的固定化技術(shù)可以重復(fù)利用酶，降低酶成本，增加酶的穩(wěn)定性，產(chǎn)物易分離，因而廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、精細(xì)化學(xué)品工業(yè)、醫(yī)藥、廢水處理等領(lǐng)域。
[0003]在酶的固定化研究中，合適的固定化載體是首要考慮的因素。除了傳統(tǒng)的固定化載體，近年來發(fā)展了基于金屬離子層析技術(shù)的固定化方法。該方法通過在固體材料上連接金屬離子作為配體，與蛋白質(zhì)的一些特異氨基酸如組氨酸、半胱氨酸、色氨酸等產(chǎn)生親和作用，從而將酶固定于載體上。目前應(yīng)用于酶固定化的這些載體均是實(shí)驗(yàn)室自己制備，工藝較為復(fù)雜，重復(fù)性難以保證，應(yīng)用范圍有限。
[0004]隨著重組蛋白純化技術(shù)的發(fā)展，商品化的金屬離子層析樹脂也快速發(fā)展，其特異性、蛋白載量、耐受還原劑能力、穩(wěn)定性、重復(fù)利用和再生能力等都得到了巨大改善。目前商品化的頂AC載體主要是N1-NTA和N1-1DA兩種，前者是以瓊脂糖或者其他基質(zhì)共價(jià)連接NTA基團(tuán)，NTA基團(tuán)與Ni形成四價(jià)螯合物，并留下Ni兩價(jià)用于與其他基團(tuán)結(jié)合。同樣作用的還有IDA基團(tuán)(亞氨基二乙酸)，但NTA相對比較耐還原劑，因此使用較多。
[0005]以商品化鎳離子親和層析樹脂直接用于具有組氨酸標(biāo)簽重組酶的固定化更加簡便，易獲得，重復(fù)性高，低成本和高效。該固定化方法可將重組蛋白的粗酶液直接與固定化材料結(jié)合，無須純化酶，且固定化材料可以反復(fù)再生利用，節(jié)約成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種固定化酶的方法及應(yīng)用，具體來說，利用重組酶蛋白具有組氨酸標(biāo)簽的特點(diǎn)，與金屬親和層析樹脂結(jié)合，從而將酶固定于樹脂上，制備固定化酶。同時(shí)，本發(fā)明還提供了羰基還原酶固定化酶在生物催化中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案詳述如下:
[0008]以具有組氨酸標(biāo)簽的重組酶酶液與金屬離子親和層析樹脂混合，使酶與樹脂充分結(jié)合，棄去酶液，得到固定化酶。
[0009]所述具有組氨酸標(biāo)簽的重組酶包括在N-端，或者在C-端，或者在這兩端均有組氨酸的酶，組氨酸的數(shù)量為6?1個(gè)。
[0010]所述具有組氨酸標(biāo)簽的重組酶可以與金屬離子親和層析樹脂專一性結(jié)合，因此本發(fā)明采用純酶或者粗酶液能達(dá)到同樣的效果。
[0011]所述的金屬離子親和層析樹脂為:Ni2+、Co2+、Cu2+等金屬離子與瓊脂糖交聯(lián)而成的親和樹脂，可以與具有組氨酸標(biāo)簽的酶共價(jià)結(jié)合，優(yōu)選N1-NTA或者N1-1DA。
[0012]所述的結(jié)合條件優(yōu)選為4?25°C，50?100rpm，0.5?5h。
[0013]本發(fā)明還提供了羰基還原酶ChKRED20固定化酶在生物催化中的應(yīng)用。
[0014]羰基還原酶ChKRED20固定化酶的生物催化體系為:
[0015]緩沖液、異丙醇、NAD+、固定化酶和底物。
[0016]緩沖液為磷酸鉀緩沖液或者Tris-HCl緩沖液。磷酸鉀(磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀)緩沖液 100mM，pH 7.0?8.0c3Tris-HCl緩沖液為25mM Tris、50mM NaCl，pH 8.0。
[0017]異丙醇濃度10%?80% (v/v)。
[0018]NAD+濃度0.2 ?0.5g/l。
[0019]固定化酶酶量，指含有的目標(biāo)酶(羰基還原酶0110^020)純酶量，濃度1?1(^/1。
[0020]底物溶解于異丙醇中，優(yōu)選終濃度10?400g/l。
[0021]優(yōu)選反應(yīng)條件為30?50°C。
[0022]本發(fā)明的有益效果:
[0023](I)以金屬離子親和層析樹脂直接用于具有組氨酸標(biāo)簽重組酶的固定化更加簡便，低成本和高效。該固定化方法可將重組蛋白的粗酶液直接與固定化材料結(jié)合，無須純化酶。與傳統(tǒng)固定化方法相比，該方法所用的固定化材料可以反復(fù)再生利用，節(jié)約成本。且金屬離子層析樹脂可以直接購買、易獲得，重復(fù)性好，易于推廣使用。
[0024](2)本發(fā)明首次以商品化N1-NTA或N1-1DA為載體用于羰基還原酶的固定化，并連續(xù)反應(yīng)制備手性醇，大幅度提尚了時(shí)空廣率。
【附圖說明】
[0025]附圖為固定床連續(xù)反應(yīng)裝置示意圖
【具體實(shí)施方式】
[0026]以下結(jié)合實(shí)施實(shí)例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，需要指出的是，本實(shí)施例僅用于解釋本發(fā)明，而非對本發(fā)明范圍的限制。
[0027 ] 實(shí)施例1羰基還原酶ChKRED20固定化酶的制備
[0028]羰基還原酶ChKRED20(NCBI登錄號:KC342020)重組菌的構(gòu)建方法、異源表達(dá)、酶純化等為本領(lǐng)域常規(guī)方法。在該酶基因的兩端分別加入酶切位點(diǎn)為EcoR I和Sal I，連入同樣雙酶切后的pET 28a( + )載體片段，得到重組質(zhì)粒pET 28a_ChKRED20，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中構(gòu)建重組菌。該基因在大腸桿菌中異源表達(dá)后的酶在N-端具有6個(gè)組氨酸，構(gòu)成了組氨酸標(biāo)簽，可以與金屬親和樹脂結(jié)合。
[0029]羰基還原酶ChKRED20的誘導(dǎo)表達(dá):挑取重組菌單克隆至LB(含卡那霉素50yg/ml)培養(yǎng)基中，37°C、200rpm，培養(yǎng)16h作為種子液，再以1%的接種量轉(zhuǎn)接至TB(含卡那霉素50μg/ml)培養(yǎng)基中，37 °C、200rpm，培養(yǎng)3h，加入IPTG誘導(dǎo)(終濃度為0.2mM)，30 °C繼續(xù)培養(yǎng)至24h。離心(8000印111，4°(:，101^11)收集菌體，生理鹽水洗滌(0.8%，《八)洗滌2次，離心，獲得濕菌體。
[0030]將上述獲得的濕菌體重懸于緩沖液中(1mM Tris，300mM NaCl，1mM咪唑，pH8.0)，經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)破碎后，冷凍離心(12000rpm，4°C，20min)，得到的上清液即為粗酶液。粗酶液以鎳親和層析樹脂純化，得到純酶。蛋白純化過程為本領(lǐng)域的一般方法。
[0031]純化蛋白所用的緩沖液如下。
[0032]結(jié)合液:10mMTris,300mM NaCl，1mM咪唑(pH8.0)
[0033]漂洗液:10mMTris,300mM NaCl，20mM咪唑(ρΗ8.0)
[0034]洗脫液:10mMTris，300mM NaCl，250mM咪唑(ρΗ8.0)
[0035]將洗脫得到的ChKRED20酶液進(jìn)行2次透析，第一次透析緩沖液為:25mM Tris，50mMNaCl，2mM DTT ,ImM EDTA，pH8.0，4°C，lOOrpm，12h。第二次透析的緩沖液為 25mM Tris，50mMNaCl，pH8.0，4°C，100rpm，12h。
[0036]將透析后得到的純酶液(濃度4.25mg/ml)50ml與用緩沖液平衡的5mlN1-NTA樹脂(Genscript，南京金斯瑞生物科技有限公司)混合，4°C，10rpm結(jié)合3h。樹脂的平衡的緩沖液組分為:1mM Tris，300mM NaCl，1mM咪唑(pH8.0)。之后棄去酶液，得到固定化酶。測定酶液中殘余酶濃度為0.85mg/ml，因此計(jì)算出結(jié)合的酶量為17Omg。
[0037]上述固定化酶用20ml異丙醇溶液平衡固定化酶30min，異丙醇濃度為20%，v/v，配置于緩沖液中，緩沖液為25mM Tris、50mM NaCl，pH 8.0。
[0038]由于羰基還原酶ChKRED20具有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽，可以N1-NTA專一性結(jié)合，因此本發(fā)明采用粗酶液與N1-NTA樹脂結(jié)合可以達(dá)到同樣的效果。
[0039]實(shí)施例2羰基還原酶ChKRED20固定化酶與純酶生物催化效率的比較
[0040](I)純酶的反應(yīng)體系:磷酸鉀緩沖液中(10mM，pH 7.0)包含以下組分，1 % (v/v)異丙醇，0.2g/l NAD+，2g/l ChKRED20純酶以及底物2-氯-l-(3，4-二氟苯基)乙酮，濃度100g/lo4(TC，200rpmo
[0041](2)固定化酶的反應(yīng)體系:固定化酶的制備方法同實(shí)施例1。固定化酶2g/l(該濃度指的是固定化酶中含有的目標(biāo)酶量)，其余條件同純酶反應(yīng)體系。
[0042]反應(yīng)初期的催化效率兩者無明顯差別(反應(yīng)時(shí)間Ih，轉(zhuǎn)化率45%左右)，隨著時(shí)間的延長，固定化酶的催化效率比純酶高。反應(yīng)時(shí)間為14h時(shí)，固定化酶的轉(zhuǎn)化率為98 %，而純酶的轉(zhuǎn)化率只有94%。因此，固定化酶可以忍受較高濃度的底物，其在生物催化體系中的失活速度更慢，從而表現(xiàn)出在相同時(shí)間內(nèi)更高的轉(zhuǎn)化率。
[0043]以上生物催化反應(yīng)得到的產(chǎn)物(S)-2_氯-1-(3，4_二氟苯基)乙醇，ee值〉99%。
[0044]實(shí)施例3羰基還原酶ChKRED20固定化酶催化不同濃度的底物
[0045]固定化酶制備時(shí)以粗酶液代替純酶液，其余同實(shí)施例1。
[0046]反應(yīng)體系:磷酸鉀緩沖液中(100mM，pH7.0)，10% (v/v)異丙醇，0.2g/l NAD+，5g/I ChKRED20固定化酶(含有的目標(biāo)酶量)，以及底物2-氯-1 - (3，4-二氟苯基)乙酮。反應(yīng)條件為 40°C，200rpm。
[0047]底物濃度為50g/l，完全轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)化率>99%)需要的時(shí)間為6h;濃度為100g/l，完全轉(zhuǎn)化需要的時(shí)間為1h;底物濃度為150g/l，完全轉(zhuǎn)化的時(shí)間為24h。時(shí)空產(chǎn)率(Space timeyield)在底物濃度為100g/l最高，為10g/(l.h)。當(dāng)?shù)孜餄舛壤^續(xù)增加到200g/l，24h內(nèi)轉(zhuǎn)化率為92%。
[0048]以上生物催化反應(yīng)得到的產(chǎn)物(S)-2_氯-1-(3，4_二氟苯基)乙醇，ee值〉99%。
[0049]實(shí)施例4羰基還原酶ChKRED20固定化酶單批次生物催化
[0050]固定化酶的制備方法同實(shí)施例1。
[0051 ] (I)底物為3，5雙三氟甲基苯乙酮
[0052]反應(yīng)體系:磷酸鉀緩沖液中(100mM，pH 7.0)，40% (v/v)異丙醇，0.2g/l NADMg/I ChKRED20固定化酶(含有的目標(biāo)酶量)，以及底物3，5雙三氟甲基苯乙酮，濃度400g/l。反應(yīng)條件:30 °C，200rpm，24h。
[0053]將單次反應(yīng)結(jié)束后的固定化酶回收，再次用于下一輪生物催化反應(yīng)。前4輪反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率>95%，第5輪反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率為94% ;第6輪反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率為92%。
[0054]上述生物催化反應(yīng)得到產(chǎn)物為(R)-3，5_雙三氟甲基苯乙醇，ee值〉99.9%。
[0055](2)底物為2-氯-1-(3，4_ 二氟苯基)乙酮
[0056]反應(yīng)體系:磷酸鉀緩沖液中(100mM，pH7.0)，10% (v/v)異丙醇，0.2g/l of NAD+，5g/l ChKRED20固定化酶(含有的目標(biāo)酶量)，以及底物2-氯-l-(3，4-二氟苯基)乙酮，濃度150g/l。反應(yīng)條件:40°C，200rpm，24h。
[0057]將單次反應(yīng)結(jié)束后的固定化酶回收，再次用于下一輪生物催化反應(yīng)。在前4批次反應(yīng)中，反應(yīng)時(shí)間為1h就能達(dá)到轉(zhuǎn)化率99%以上；固定化酶重復(fù)利用8批次，其活力仍能保持90%以上，展示了良好的催化能力和穩(wěn)定性，具有連續(xù)生物催化的潛力。
[0058]以上生物催化反應(yīng)得到的產(chǎn)物(S)-2_氯-1-(3，4_二氟苯基)乙醇，ee值〉99%。
[0059]實(shí)施例5羰基還原酶ChKRED20以N1-1DA載體制備固定化酶
[0060]羰基還原酶ChKRED20酶的制備方法同實(shí)施例1。將得到的純酶液(濃度4.25mg/ml)50ml與用緩沖液平衡的5ml N1-1DA樹脂(品牌為BBI)混合，4°C，10rpm結(jié)合3h。樹脂的平衡的緩沖液組分為:1mM Tris,300mM NaCl，1mM咪唑(pH8.0)。之后棄去酶液，得到固定化酶。測定酶液中殘余酶濃度為0.73mg/ml，因此計(jì)算出結(jié)合的酶量為176mg。
[0061]反應(yīng)體系為:磷酸鉀緩沖液中(100mM，pH 7.0)，40% (v/v)異丙醇，0.2g/l NAD+，固定化酶2g/l (含有的目標(biāo)酶量)，以及底物3，5雙三氟甲基苯乙酮，濃度10(^/1。30°(:，200rpm。反應(yīng)時(shí)間15h，轉(zhuǎn)化率99.8%，得到產(chǎn)物為(R)-3，5-雙三氟甲基苯乙醇，ee值〉99.9%0
[0062]實(shí)施例6具有8個(gè)組氨酸標(biāo)簽的羰基還原酶ChKRED20固定化酶生物催化
[0063]利用定點(diǎn)突變的方法在羰基還原酶ChKRED20的N-端6個(gè)組氨酸之后再突變2個(gè)氨基酸為組氨酸，得到8個(gè)組氨酸標(biāo)簽的酶ChKRED20-His 8。
[0064]羰基還原酶ChKRED20_His8異源表達(dá)、固定化酶的制備方法同實(shí)施例1。反應(yīng)體系為:磷酸鉀緩沖液中(10mM，pH 7.0)，10 % (v/v)異丙醇，0.2g/l NAD+，固定化酶2g/l (含有的目標(biāo)酶量)，以及底物2-氯-l-(3，4-二氟苯基)乙酮，濃度lOOg/ljOt:，200rpm，24h。反應(yīng)時(shí)間18h，轉(zhuǎn)化率99%，得到產(chǎn)物(S)-2-氯-1-(3，4-二氟苯基)乙醇，ee值>99%。
[0065]實(shí)施例7羰基還原酶ChKRED20固定化酶填充床反應(yīng)器連續(xù)生物催化
[0066]填充床反應(yīng)器的示意圖如附圖所示，固定化酶置于反應(yīng)器底部，底物反應(yīng)液通過栗從上端進(jìn)入，產(chǎn)物混合物從下端流出。該裝置通過夾套控溫，使床層維持恒定的溫度。
[0067]底物反應(yīng)液為:高濃度底物(溶解于異丙醇中，占總反應(yīng)液體積的70%)，NAD+(0.2g/1)，緩沖液(Tris 25mM，NaCl 50mM，pH8.0)。反應(yīng)體系中加入NiS〇4、DTT等，可以提高填充床反應(yīng)器反應(yīng)體系的穩(wěn)定性。
[0068]填充床連續(xù)反應(yīng)中，緩沖液均為Tris 25mM，NaCl 50mM，pH8.0，以下實(shí)施例相同。
[0069]產(chǎn)物混合物為:高濃度產(chǎn)物(溶解于異丙醇)，NAD+，緩沖液以及生成的丙酮和未完全轉(zhuǎn)化的少量底物。
[0070](I)底物為3，5_雙三氟甲基苯乙酮，濃度為100g/l，填充床固定化酶酶量160mg(含有的目標(biāo)酶量)，固定化酶體積4.5ml，反應(yīng)溫度40°C。反應(yīng)液組分為底物溶解于異丙醇中(占70 %體積)，NAD+ (0.2g/1)，緩沖液(占30 %體積)。
[0071]時(shí)空產(chǎn)率(Space Time Yield，STY)又稱時(shí)空收率或時(shí)空得率。指在給定反應(yīng)條件下，單位時(shí)間內(nèi)，單位體積(或質(zhì)量)催化劑能獲得某一產(chǎn)物量。它是衡量催化劑活性大小及反應(yīng)器裝置生產(chǎn)能力的標(biāo)志之一。
[0072]時(shí)空產(chǎn)率=產(chǎn)物量/(床層體積*時(shí)間)。
[0073]流速為0.5ml/min時(shí)，轉(zhuǎn)化率99.7%,計(jì)算的時(shí)空產(chǎn)率為664g/( 1.h)。流速為
0.8ml/min時(shí)，轉(zhuǎn)化率99.3%，計(jì)算的時(shí)空產(chǎn)率為1059g/(l.h)。流速為0.9ml/min時(shí)，轉(zhuǎn)化率95 %，計(jì)算的時(shí)空產(chǎn)率為1140g/(l.h)o時(shí)空效率為自由酶生物催化的100倍。
[0074]以流速為0.8ml/min進(jìn)行填充床生物催化反應(yīng)，連續(xù)反應(yīng)72h，轉(zhuǎn)化率保持>99%。
[0075]以上生物催化反應(yīng)得到的產(chǎn)物為(R)-3，5_雙三氟甲基苯乙醇，ee值〉99.9%。
[0076](2)底物為2-氯-1-(3，4-二氟苯基)乙酮，濃度5(^/1，填充床固定化酶酶量16011^(含有的目標(biāo)酶量)，固定化酶體積4.5ml，反應(yīng)溫度40°C。反應(yīng)液組分為:底物溶解于異丙醇中(占70 %體積)，NAD+ (0.2g/1)，緩沖液(占30 %體積)。
[0077]流速為0.08ml/min時(shí)，轉(zhuǎn)化率99.1%,計(jì)算的時(shí)空產(chǎn)率為53g/( 1.h)。流速為
0.09ml/min時(shí)，轉(zhuǎn)化率99.1 %，計(jì)算的時(shí)空產(chǎn)率為60g/(l.h)。流速為0.10ml/min時(shí)，轉(zhuǎn)化率90%，計(jì)算的時(shí)空產(chǎn)率為60g/(l.h)。時(shí)空產(chǎn)率為自由酶生物催化的5倍以上。
[0078]以流速為0.09ml/min進(jìn)行填充床生物催化反應(yīng)，連續(xù)反應(yīng)24h，轉(zhuǎn)化率>98%。
[0079]以上生物催化反應(yīng)得到的產(chǎn)物(S)-2_氯-1-(3，4_二氟苯基)乙醇，ee值〉99%。
[0080](3)底物為4-氯乙酰乙酸乙酯，濃度320g/l，填充床固定化酶酶量160mg(含有的目標(biāo)酶量)，固定化酶體積4.5ml，反應(yīng)溫度40 0C。
[0081]&.反應(yīng)液組分為:底物溶解于異丙醇中(占70%體積)，嫩0+(0.28/1)，緩沖液(占30%體積)。
[0082]流速為0.6ml/min時(shí)，轉(zhuǎn)化率99%，ee值>99%，計(jì)算的時(shí)空產(chǎn)率為2534g/(l.h)。
[0083]b.反應(yīng)液組分為:底物溶解于異丙醇中(占70%體積)，NAD+(0.2g/l)，5mM NiSO4，2mM DTT，緩沖液(占30 %體積)。
[0084]流速為0.6ml/min時(shí)，轉(zhuǎn)化率99%，ee值>99%，計(jì)算的時(shí)空產(chǎn)率為2534g/(l.h)。時(shí)空產(chǎn)率為自由酶催化的8倍左右。
[0085]以上生物催化反應(yīng)得到的產(chǎn)物(S)-4_氯-3-輕基丁酸乙酯，ee值〉99%。
[0086]實(shí)施例8突變體M135固定化酶填充床反應(yīng)器連續(xù)生物催化
[0087]突變體酶為羰基還原酶ChKRED20耐熱性突變體M135(Appl Microb1lB1technol.2016.100(8): 3567-3575)。固定化酶的制備方法同實(shí)施例1。
[0088]底物為2-氯-l-(3，4-二氟苯基)乙酮，濃度50g/l，填充床固定化酶酶量130mg(含有的目標(biāo)酶量)，固定化酶體積4ml，反應(yīng)溫度50°C。反應(yīng)液組分為:底物溶解于異丙醇中(占70 % 體積)，NAD+ (0.2g/l)，緩沖液(占 30 %體積)。緩沖液為Tris 25mM，NaCl 50mM，pH8.0。
[0089]流速為0.12ml/min時(shí)，轉(zhuǎn)化率99%，計(jì)算的時(shí)空產(chǎn)率為90g/(l.h)。連續(xù)反應(yīng)30h，轉(zhuǎn)化率保持>98%。
[0090]以上生物催化反應(yīng)得到的產(chǎn)物(S)-2_氯-1-(3，4_ 二氟苯基)乙醇，ee值〉99%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種酶的固定化方法，其特征是利用重組酶蛋白具有組氨酸標(biāo)簽的特點(diǎn)，與金屬親和層析樹脂專一性結(jié)合，從而將酶固定于樹脂上，制備固定化酶。2.權(quán)利要求1所述的酶的固定化方法在羰基還原酶固定化酶生產(chǎn)手性醇中的應(yīng)用。3.權(quán)利要求1所述的酶的固定化方法，其特征是固定化酶的制備步驟為:重組酶酶液與金屬離子親和層析樹脂混合，使酶與樹脂充分接觸后進(jìn)行結(jié)合，棄去酶液，得到固定化酶。4.權(quán)利要求1所述的酶的固定化方法，其特征是具有組氨酸標(biāo)簽的重組酶包括在N-端，或者在C-端，或者在這兩端均有組氨酸的酶，組氨酸的數(shù)量為6?10個(gè)。5.權(quán)利要求1所述的酶的固定化方法，其特征是金屬離子親和層析樹脂為:Ni2+、Co2+、Cu2+等金屬離子與瓊脂糖交聯(lián)而成的親和樹脂，可以與具有組氨酸標(biāo)簽的酶共價(jià)結(jié)合。6.權(quán)利要求1和3所述的結(jié)合條件為4?25°C，50?100rpm，0.5?5h。7.權(quán)利要求3所述的酶的固定化方法，其特征是重組酶酶液為純酶或者粗酶液。8.權(quán)利要求5所述的金屬離子親和層析樹脂為N1-NTA或者N1-1DA。
【文檔編號】C12N11/04GK105969757SQ201610395274
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年6月3日
【發(fā)明人】吳中柳, 劉艷
【申請人】中國科學(xué)院成都生物研究所