一種番鴨細(xì)小病毒lamp檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種番鴨細(xì)小病毒LAMP檢測試劑盒，該試劑盒包括：反應(yīng)液甲：含有10×等溫反應(yīng)緩存液、dNTPs、硫酸鎂、內(nèi)引物1、內(nèi)引物2、外引物1、外引物2及甜菜堿；反應(yīng)液乙：Bst DNA 聚合酶，反應(yīng)液丙：含雙抗的滅菌PBS。本發(fā)明提供的試劑盒最低檢測限為10fg，其靈敏性是RT?PCR的10倍。本發(fā)明試劑盒具有良好的特異性、靈敏性、快速高效、且結(jié)果判定簡單等優(yōu)點(diǎn)，能較好的滿足最番鴨細(xì)小病毒的現(xiàn)場檢測，為基層檢測提供了新的技術(shù)平臺(tái)，能較好的滿足目前對養(yǎng)殖場現(xiàn)場檢測的迫切需要。
【專利說明】
一種番鴨細(xì)小病毒LAMP檢測試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及病原微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體說是涉及一種番鴨細(xì)小病毒LAMP檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]番鴨細(xì)小病毒病是由番鴨細(xì)小病毒(Muscovy Duck Parvovirus，MDPV)引起的以腹瀉和喘氣為主要癥狀的急性或亞急性傳染病。該病主要危害30日齡以內(nèi)的雛番鴨，特別是1-3周齡的雛番鴨，因此俗稱“三周病”。該病傳播迅速，常造成整群發(fā)病并死亡，發(fā)病率和死亡率都很高。日齡較大的雛鴨一般癥狀較輕，病死率較低，但病愈后大部分生長發(fā)育受阻成為僵鴨，料肉比增大，已經(jīng)成為危害我國養(yǎng)鴨業(yè)發(fā)展最為嚴(yán)重的傳染病之一。
[0003]現(xiàn)階段，該病的傳統(tǒng)檢測方法有血清中和試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、ELISA等，但是這些檢測方法存在靈敏性低、周期長、重復(fù)性差、不易標(biāo)準(zhǔn)化等缺點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用中不易大范圍的推廣使用。現(xiàn)有的PCR以及熒光定量PCR檢測方法，一定程度上克服了上述的困難，但是往往需要使用昂貴的實(shí)驗(yàn)設(shè)備和試劑、經(jīng)過專門培訓(xùn)的的操作人員等諸多弊端，不能適應(yīng)基層獸醫(yī)站或養(yǎng)殖場臨床一線簡便、快速檢測的需要。
[0004]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediatedisothermal amplificat1n，LAMP)是利用一種具有鏈置換活性和瀑布式核酸擴(kuò)增功能的鏈置換DNA聚合酶(即Bst DNA聚合酶)，在等溫條件下進(jìn)行核酸的變形和自動(dòng)循環(huán)的鏈置換核酸擴(kuò)增反應(yīng)，整個(gè)反應(yīng)不需要特殊的儀器設(shè)備，一臺(tái)能夠控溫的水浴鍋就能完成。伴隨LAMP反應(yīng)的進(jìn)行，產(chǎn)生的焦磷酸根離子能夠與體系中添加的鎂離子形成乳白色的焦磷酸鎂沉淀，方便結(jié)果的判定，無須傳統(tǒng)核酸電泳染色紫外觀察的繁瑣步驟，不僅節(jié)省了時(shí)間也保護(hù)了操作者和環(huán)境。LAMP具有簡便、快速、靈敏、特異的優(yōu)勢，尤其適用于基層和現(xiàn)場一線對快速檢測的需要。本發(fā)明采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)研制一種番鴨細(xì)小病毒LAMP檢測試劑盒，具有十分重要的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)意義。
[0005]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供“一種番鴨細(xì)小病毒LAMP檢測試劑盒”，該試劑盒具有特異性強(qiáng)、靈敏性高、不易造成污染、操作簡便、成本低廉、快速得出結(jié)果的番鴨細(xì)小病毒LAMP檢測試劑盒，以滿足基層和現(xiàn)場對快速檢測番鴨細(xì)小病毒的需要。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的主要技術(shù)方案是，一種番鴨細(xì)小病毒LAMP檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括:
反應(yīng)液甲:含有10X等溫反應(yīng)緩存液、dNTPs、硫酸鎂、內(nèi)引物1、內(nèi)引物2、外引物1、外引物2及甜菜堿；
反應(yīng)液乙:Bst DNA聚合酶，
反應(yīng)液丙:含雙抗的滅菌I3BS。
[0008]進(jìn)一步的技術(shù)方案是，所述10X等溫反應(yīng)緩存液含有pH值為8.8的三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽、氯化鉀、硫酸銨、硫酸鎂及I %曲拉通X-1OO。
[0009]進(jìn)一步的技術(shù)方案是，試劑盒中包括:
反應(yīng)液甲:含有10 X等溫反應(yīng)緩存液、1mM dNTPs、25mM硫酸鎂、20μΜ的內(nèi)引物1、20μΜ的內(nèi)引物2、20μΜ的外引物1、20μΜ的外引物2及5Μ甜菜堿；
反應(yīng)液乙:Bst DNA聚合酶8U/yL;
反應(yīng)液丙:含雙抗的滅菌I3BS;
所述內(nèi)引物I序列為:
CGCTCCCTACATATTGAGGGTTATACAGTTCTGGACATTACTAAAAATCG所述內(nèi)引物2序列為:CAACAAAAGAAATGCCATATGGCTCCTCGGCTATGTTGGTCT所述外引物 I 序列為:AGACTATTTGATTGGAAAAGACC所述外引物2序列為:GGTACAGCATGGGCAATA。
[0010]進(jìn)一步的技術(shù)方案是，所述10X等溫反應(yīng)緩存液含有200mM pH值為8.8的三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽、10mM氯化鉀、10mM硫酸銨、20mM硫酸鎂和及I %曲拉通X-100。
[0011]進(jìn)一步的技術(shù)方案是，所述反應(yīng)液甲每管23yL，其組成為:10XBstbuffer 2.5μL、10mM dNTPs4.5yL、5M Betainel.5yL、25mM MgS044.5yL^20yM FIP/BIP2.5μ?、20μΜ F3/B30.5yL、|—A4yL。
[0012]本發(fā)明還公開了采用上述試劑盒的檢測方法，該檢測方法包括如下步驟:
(1)DNA的提取:
1)、用滅菌棉拭子旋轉(zhuǎn)插入鴨泄殖腔采集糞便殘?jiān)胺置谖铮?br> 2)、取出后投放于含雙抗的滅菌PBS反應(yīng)液丙所在離心管中，輕輕搖動(dòng)使其溶解；
3)、4°C、12000rpm離心15min，取上清，再用0.22μηι微孔濾膜過濾；
4)、參照EasyPureviral DNA/RNA kit提取試劑盒說明書，對步驟3)中的病毒液進(jìn)行核酸抽提，所得即為待檢DNA樣品；
(2)PCR擴(kuò)增:
25yL體系:23yL反應(yīng)液甲，Bst DNA聚合酶IyL及模板IyL混勻，短暫離心構(gòu)成25yL反應(yīng)體系；
PCR反應(yīng)條件:將水浴鍋預(yù)熱至60°C，反應(yīng)管半浸入水中，恒溫反應(yīng)60min，水浴鍋加熱至85°C滅活5min，取出反應(yīng)管觀察結(jié)果；
(3)判斷結(jié)果:
肉眼觀察反應(yīng)管清晰度判定，如反應(yīng)管渾濁呈淡乳白色，則說明待檢樣品中含有番鴨細(xì)小病毒;如果反應(yīng)管保持澄清透明，說明待檢樣品不含番鴨細(xì)小病毒。
[0013]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn):
1、由于本發(fā)明所設(shè)計(jì)采用的兩對特異性引物來自番鴨細(xì)小病毒基因中高度保守的區(qū)段，采用該引物對能準(zhǔn)確、快速、方便的判別病料中是否含有番鴨細(xì)小病毒。
[0014]2、特異性強(qiáng):所檢測的陰性對照病毒均無陽性結(jié)果出現(xiàn)，與PCR結(jié)果相一致。
[0015]3、靈敏度高:普通PCR檢測最低限度為10fg數(shù)量級(jí)，而采用本發(fā)明檢測方法，檢測限最低可達(dá)到I Ofg，是普通PCR的1倍。
[0016]4、時(shí)效性強(qiáng):普通PCR檢測整個(gè)過程在3-4 h左右才能得出判斷結(jié)果，而采用本發(fā)明檢測方法，只需1.5小時(shí)即可做出判斷結(jié)果。
[0017]5、環(huán)保無污染:普通PCR結(jié)束后還要進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，使用EB等對人和環(huán)境造成損害的染料，而采用本發(fā)明檢測方法，無需昂貴的PCR儀，只需能夠控溫的普通水浴鍋即可，反應(yīng)結(jié)束后可直接通過肉眼觀察溶液是否變渾濁而直接判定。同時(shí)有效地避免了因?yàn)殚_蓋造成的氣溶膠污染，確保了每次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
【附圖說明】
[0018]圖1是應(yīng)用本發(fā)明番鴨細(xì)小病毒LAMP檢測試劑盒的檢測方法特異性試驗(yàn)結(jié)果圖。
[0019]其中:M、DL2000 DNA Marker，1、番鴨細(xì)小病毒，2、鴨瘟病毒，3、鴨肝炎病毒，4、新城疫病毒，5、小鸛痕病毒。
[0020]圖2— I是應(yīng)用本發(fā)明番鴨細(xì)小病毒LAMP檢測試劑盒的檢測方法敏感性試驗(yàn)結(jié)果圖。
[0021]圖2— 2是應(yīng)用本發(fā)明番鴨細(xì)小病毒LAMP檢測試劑盒的檢測方法敏感性試驗(yàn)量化結(jié)果圖。
其中:M、DL2000 DNA Marker，N、negative(陰性對照)，1、10ng/yL，2、lng/yL，3、10pg/yL，4、10pgAiL，5、lpgAiL，6、100fgAiL，7、10fgAiL，8、lfgAiL。
[0022]圖3— I是PCR方法檢測番鴨細(xì)小病毒敏感性試驗(yàn)結(jié)果圖。
[0023]圖3— 2是PCR方法檢測番鴨細(xì)小病毒敏感性試驗(yàn)量化結(jié)果圖。
其中:M、DL2000 DNA Marker，N、negative(陰性對照)，1、10ng/yL，2、lng/yL，3、10pg/yL，4、10pgAiL，5、lpgAiL，6、100fgAiL，7、10fgAiL，8，lfgAiL。
[0024]圖4是番鴨細(xì)小病毒LAMP檢測試劑盒陰性及陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)。
[0025]圖中:陽性結(jié)果對應(yīng)管中液體呈現(xiàn)淡乳白色，陰性結(jié)果對應(yīng)管中液體呈現(xiàn)原有的澄清透明狀態(tài)。
【具體實(shí)施方式】
[0026]下面通過非限制性實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，理解本發(fā)明。
[0027]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0028]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明均可從商業(yè)途徑得到。
實(shí)施例
[0029]實(shí)施例1:番鴨細(xì)小病毒LAMP檢測試劑盒的配制
一種番鴨細(xì)小病毒LAMP檢測試劑盒包括:反應(yīng)液甲:含有10 X等溫反應(yīng)緩存液、1mMdNTPs、25mM硫酸鎂、20μΜ的內(nèi)引物1、20μΜ的內(nèi)引物2、20μΜ的外引物1、20μΜ的外引物2、
5Μ甜菜堿。
[0030]所述10 X等溫反應(yīng)緩存液含有200mM pH值為8.8的三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽、10mM氯化鉀、10mM硫酸銨、20mM硫酸鎂和I %曲拉通X-100。
[0031]其中，反應(yīng)液甲每管23yL，其組成為:10XBstbuffer 2.5yL、10mM dNTPs4.5yL、5M Betainel.5yL、25mM MgS(k4.5μ?、20μΜ FIP/BIP2.5μ?、20μΜ F3/B30.5yL、雙蒸水4yL。
[0032]內(nèi)引物I序列為:
CGCTCCCTACATATTGAGGGTTATACAGTTCTGGACATTACTAAAAATCG 內(nèi)引物2序列為:
CAACAAAAGAAATGCCATATGGCTCCTCGGCTATGTTGGTCT外引物 I 序列為:AGACTATTTGATTGGAAAAGACC外引物2序列為:GGTACAGCATGGGCAATA反應(yīng)液乙:Bst DNA聚合酶8U/yL，
反應(yīng)液丙:含雙抗的滅菌PBS。(直接購買即可)
實(shí)施例2:采用上述試劑盒的檢測方法，該檢測方法包括如下步驟:
(1)DNA的提取:
1)、用滅菌棉拭子旋轉(zhuǎn)插入鴨泄殖腔采集糞便殘?jiān)胺置谖铮?br> 2)、取出后投放于含雙抗的滅菌PBS反應(yīng)液丙所在離心管中，輕輕搖動(dòng)使其溶解；
3)、4°C、12000rpm離心15min，取上清，再用0.22μηι微孔濾膜過濾；
4)、參照EasyPureviral DNA/RNA kit提取試劑盒說明書，對步驟3)中的病毒液進(jìn)行核酸抽提，所得即為待檢DNA樣品；
(2)PCR擴(kuò)增:
25yL體系:23yL反應(yīng)液甲，Bst DNA聚合酶IyL及模板IyL混勻，短暫離心構(gòu)成25yL反應(yīng)體系；
PCR反應(yīng)條件:將水浴鍋預(yù)熱至60°C，反應(yīng)管半浸入水中，恒溫反應(yīng)60min，水浴鍋加熱至85°C滅活5min，取出反應(yīng)管觀察結(jié)果；
(3)結(jié)果判斷:
1)肉眼判斷法:肉眼觀察反應(yīng)管清晰度判定，如反應(yīng)管渾濁呈淡乳白色，則說明待檢樣品中含有番鴨細(xì)小病毒;如果反應(yīng)管保持澄清透明，說明待檢樣品不含番鴨細(xì)小病毒。
[0033]
2)瓊脂糖凝膠電泳判定法:瓊脂糖凝膠電泳，如對應(yīng)泳道出現(xiàn)特異性的梯形條帶，則說明待檢樣品中含有番鴨細(xì)小病毒;如對應(yīng)泳道未出現(xiàn)特異性的梯形條帶，則說明待檢樣品不含番鴨細(xì)小病毒。
[0034]經(jīng)多次重復(fù)，肉眼觀察法不僅克服了瓊脂糖凝膠電泳法在操作過程中存在的費(fèi)事費(fèi)力等諸多弊端，而且在結(jié)果判定上兩種判定結(jié)果也完全一致。
[0035]實(shí)施例3:LAMP檢測法的特異性試驗(yàn)
如圖1所示:分別取IyL番鴨細(xì)小病毒、新城疫病毒、鴨肝炎病毒、小鵝瘟病毒和鴨瘟病毒的核酸為模板，按照實(shí)施例2中番鴨細(xì)小病毒LAMP反應(yīng)程序進(jìn)行反應(yīng)并觀察結(jié)果。
[0036]結(jié)果見圖1，對番鴨細(xì)小病毒的檢測為陽性結(jié)果(有特異性梯形條帶)，而對新城疫病毒、鴨肝炎病毒、小鵝瘟病毒和鴨瘟病毒的檢測均為陰性(無特異性梯形條帶)。
[0037]實(shí)施例4: LAMP檢測法的靈敏性試驗(yàn)
將番鴨細(xì)小病毒DNA按 10 倍遞增稀釋成 10ng/yL、lngAiL、100pgAiL、10pgAiL、lpgAiL、100fg/yL、1fg/yL、Ifg/yL。
[0038]分別取IyL各稀釋度數(shù)的番鴨細(xì)小病毒DNA為模板，按照前述番鴨細(xì)小病毒LAMP反應(yīng)程序進(jìn)行反應(yīng)并觀察結(jié)果。
[0039]結(jié)果見圖2 — 1、圖2 — 2，番鴨細(xì)小病毒LAMP檢測方法的檢測限為10fg。
[0040]實(shí)施例5:PCR擴(kuò)增及結(jié)果對照番鴨細(xì)小病毒PCR反應(yīng)組成如下:
50yL反應(yīng)體系:含25mM MgSO4 2.5yL,10XPCR buffer 5yL,10mM dNTPs 2yL，Taq 聚合酶(51])0.541^，
上游引物:5- TATGGATCCATGGCAGAGGGAGGAAGC -3 IyL，
下游引物:5- TAAGAGCTCCAGATTCTGAGTCAAATACC -3 IyL，
不同濃度番鴨細(xì)小病毒0嫩模板(10呢/^、1即/^、10(^/4^、1(^/^、]^/^、100把/yL、10fgAiL、lfgAiL)lyL，35yL 雙蒸水。
[0041 ] PCR反應(yīng)條件:940C預(yù)變性2分鐘，然后進(jìn)入94 V變性I分鐘，57 °C退火I分鐘，72°C延伸I分鐘的循環(huán)，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后再經(jīng)72°C延伸10分鐘。
[0042]結(jié)果見圖3 — 1、圖3 — 2，番鴨細(xì)小病毒PCR檢測方法的檢測限為lOOfg。
[0043]番鴨細(xì)小病毒LAMP結(jié)果見圖3 — 1、圖3 — 2，番鴨細(xì)小病毒PCR檢測方法的檢測限為10fg0
[0044]番鴨細(xì)小病毒LAMP檢測可視化結(jié)果，番鴨細(xì)小病毒LAMP檢測反應(yīng)結(jié)束后，直接肉眼觀察，結(jié)果見圖4，陽性結(jié)果對應(yīng)管中液體呈現(xiàn)淡乳白色，陰性結(jié)果對應(yīng)管中液體呈現(xiàn)原有的澄清透明狀態(tài)。
[0045]番鴨細(xì)小病毒LAMP檢測法的檢測限為1fg，而PCR檢測法的檢測限為lOOfg，可見本發(fā)明LAMP檢測法比PCR檢測法更為靈敏，完全可以替代傳統(tǒng)的PCR檢測方法。
[0046]實(shí)施例6:臨床病料檢測從2015年3月到2016年I月，共收集來自國家水禽基因庫的50個(gè)樣品，利用本發(fā)明的試劑盒對50份樣品進(jìn)行檢測診斷，診斷結(jié)果顯示，僅有6例為番鴨細(xì)小病毒，陽性率為12%ο同時(shí)分別采用RT-PCR法和ELISA法進(jìn)行檢測，結(jié)果陽性率與試劑盒檢出陽性率一致。
[0047]綜上所述，本發(fā)明所設(shè)計(jì)采用的兩對特異性引物來自番鴨細(xì)小病毒基因中高度保守的區(qū)段，建立一種LAMP檢測番鴨細(xì)小病毒的方法。通過上述實(shí)驗(yàn)實(shí)施例證明，該試劑盒及方法具有靈敏性高、其靈敏性是RT-PCR的10倍，特異性好的特點(diǎn)，是一種成本低、檢測準(zhǔn)確、操作快速、方便的番鴨細(xì)小病毒LAMP檢測試劑盒，為基層檢測提供了新的技術(shù)平臺(tái)，能較好的滿足目前對養(yǎng)殖場現(xiàn)場檢測的迫切需要。
[0048]
[
序列表
〈110〉江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院
〈120〉一種番鴨細(xì)小病毒LAMP檢測試劑盒
〈160〉 6
〈210〉 I
〈211〉 50
〈212〉 DNA
〈213〉內(nèi)引物I
〈400〉 CGCTCCCTACATATTGAGGGTTATACAGTTCTGGACATTACTAAAAATCG〈210〉 2〈211〉 42〈212〉DNA
〈213〉內(nèi)引物2
〈400〉CAACAAAAGAAATGCCATATGGCTCCTCGGCTATGTTGGTCT
〈210〉3
〈211〉23
〈212〉DNA
〈213〉外引物I
〈400〉A(chǔ)GACTATTTGATTGGAAAAGACC
〈210〉4
〈211〉18
〈212〉DNA
〈213〉外引物2
〈400〉GGTACAGCATGGGCAATA
〈210〉5
〈211〉27
〈212〉DNA
〈213〉PCR上游引物
〈400〉TATGGATCCATGGCAGAGGGAGGAAGC
〈210〉6
〈211〉29
〈212〉DNA
〈213〉PCR下游引物
〈400〉TAAGAGCTCCAGATTCTGAGTCAAATACC 。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種番鴨細(xì)小病毒LAMP檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括: 反應(yīng)液甲:含有1X等溫反應(yīng)緩存液、dNTPs、硫酸鎂、內(nèi)引物1、內(nèi)引物2、外引物1、外引物2及甜菜堿； 反應(yīng)液乙:Bst DNA聚合酶， 反應(yīng)液丙:含雙抗的滅菌PBS。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種番鴨細(xì)小病毒LAMP檢測試劑盒，其特征在于，所述1X等溫反應(yīng)緩存液含有PH值為8.8的三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽、氯化鉀、硫酸銨、硫酸鎂及1 %曲拉通X-100。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種番鴨細(xì)小病毒LAMP檢測試劑盒，其特征在于，試劑盒中包括: 反應(yīng)液甲:含有10 X等溫反應(yīng)緩存液、1mM dNTPs、25mM硫酸鎂、20μΜ的內(nèi)引物1、20μΜ的內(nèi)引物2、20μΜ的外引物1、20μΜ的外引物2及5Μ甜菜堿； 反應(yīng)液乙:Bst DNA聚合酶8U/yL; 反應(yīng)液丙:含雙抗的滅菌PBS; 所述內(nèi)引物I序列為: CGCTCCCTACATATTGAGGGTTATACAGTTCTGGACATTACTAAAAATCG 所述內(nèi)引物2序列為: CAACAAAAGAAATGCCATATGGCTCCTCGGCTATGTTGGTCT 所述外引物I序列為: AGACTATTTGATTGGAAAAGACC 所述外引物2序列為: GGTACAGCATGGGCAATA 。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種番鴨細(xì)小病毒LAMP檢測試劑盒，其特征在于，所述10X等溫反應(yīng)緩存液含有200mM pH值為8.8的三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽、10mM氯化鉀、10mM硫酸銨、20mM硫酸鎂和及I %曲拉通X-100。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種番鴨細(xì)小病毒LAMP檢測試劑盒，其特征在于，所述反應(yīng)液甲每管23yL，其組成為:10XBst buffer 2.5yL、10mM dNTPs4.5yL、5M Betainel.5yL、25mMMgS044.5yL、20yM FIP/BIP2.5yL、20yM F3/B30.5yL、雙蒸水4yL。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105950786SQ201610347110
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月24日
【發(fā)明人】王永娟, 朱善元, 胡成, 左偉勇, 王安平, 洪偉鳴, 吳雙, 秦楓
【申請人】江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院