一種用于檢測口蹄疫病毒通用型的引物、試劑盒、使用方法及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測口蹄疫病毒通用型的引物、試劑盒、使用方法及其應(yīng)用，所述的引物為引物對FMDU，其中，上游引物FMDUF：5′?GATGGCCTCAAAGACCC?3′，下游引物FMDUR：5′?GACTCGCCGTCCACTCT?3′。本發(fā)明試劑盒的使用方法包括患病動物新鮮樣品的采集，核酸提取；反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)，瓊脂糖凝膠電泳檢測。該方法特異性強、靈敏度高、操作簡便、省工省時，提高了檢測的準確性和特異性。本發(fā)明能快速、方便的檢測口蹄疫通用型毒株，可用于口蹄疫病毒流行病學調(diào)查與分析，具有廣闊的市場應(yīng)用前景和較大的經(jīng)濟效益。
【專利說明】
一種用于檢測口蹄疫病毒通用型的引物、試劑盒、使用方法及 其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于檢測口蹄疫病毒通用型的引物、試劑盒、使用方法及其應(yīng)用， 屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 口蹄疫（aphthae epizooticae;foot and mouth disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒 引起的一種人獸共患的急性、熱性、高度接觸性傳染病，其臨診特征是在口腔粘膜、四肢下 端及乳等處皮膚形成水皰和爛斑。該病傳播迅速，流行面廣，成年動物多取良性經(jīng)過，幼齡 動物多因心肌受損而死亡率較高?？谔阋邚V泛流行于世界各地，造成了巨大的經(jīng)濟損失，各 國政府及國際組織高度重視，被列為全球各國共同商定撲滅的頭號法定傳染病。隨著國際 貿(mào)易的日趨增加，物質(zhì)交流和國際交往越來越頻繁，給口蹄疫的預防和控制增加了難度，因 此世界各國都花費大量人力、物力和財力來研究、控制和消滅口蹄疫。
[0003] 口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth disease virus)屬于微RNA病毒科中的口蹄疫病毒 屬，是RNA病毒中最小的一個。口蹄疫病毒具有多型性、易變異的特點。根據(jù)其血清學特性， 可以分為7個血清型，即A、0、C、SAT1 (南非I)、SAT2(南非II型）、SAT3(南非III型）及Asia 1 型（亞洲1型）。各個血清型間無交叉免疫現(xiàn)象。每一個血清型又包含若干個亞型，同型各個 亞型之間也僅有部分交叉免疫性。該病毒的這種特性給口蹄疫的防制帶來了許多困難。
[0004] 口蹄疫病毒在患病動物的水皰液、水皰皮、淋巴液及發(fā)熱期血液內(nèi)的含量最高，其 次是各組織器官、分泌物、排泄物，可長期存在并向外排毒，退熱后病毒可以出現(xiàn)于乳、糞、 尿、淚、涎水及各臟器中?？谔阋卟《緦ν饨绛h(huán)境的抵抗力很強，耐干燥。在自然條件下，含 毒組織及污染的飼料、飲水、飼草、皮毛及土壤等所含病毒在數(shù)日乃至數(shù)周內(nèi)仍具有感染 性?？谔阋卟《緦λ岷蛪A都特別敏感，在PH3.0和pH9.0以上的緩沖液中，病毒感染性將瞬間 消失，2 %~4 %氫氧化鈉、3 %~5 %福爾馬林溶液、5%氨水、0.2%~0.5%過氧乙酸或5 % 次氯酸鈉等均為口蹄疫病毒良好的消毒劑。
[0005] 口蹄疫是一種傳染性極強的傳染病，一經(jīng)發(fā)生往往呈流行性，在牧區(qū)，多呈現(xiàn)大流 行，疫情一旦發(fā)生，可隨動物的流動迅速蔓延，經(jīng)過一定時期后疫情才逐漸平息?？谔阋呖?感染多種動物，偶蹄目動物易感性最尚，易感性尚低的順序依次為黃牛、奶牛、耗牛、水牛、 豬、羊、胳馬它。
[0006] 對于口蹄疫的防治目前尚無特效藥物療法，主要采取綜合防制措施及對癥療法。 最根本的辦法是消除患病動物、帶毒動物和徹底消毒，切斷傳播途徑。因此應(yīng)加強檢疫和口 蹄疫監(jiān)測，以防口蹄疫擴散。
[0007] 目前，根據(jù)流行病學、臨診癥狀和病例剖檢特點可以做出口蹄疫的初步診斷，但確 診需要進行實驗室診斷。病毒的分離與鑒定和血清學診斷是實驗室診斷常用的方法，但較 費時費力，耗時較長。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種用于檢測口蹄疫病毒通用型的引物、試劑 盒、使用方法及其應(yīng)用，采用本發(fā)明的試劑盒，能夠在三個小時內(nèi)做出診斷，為口蹄疫臨床 診斷和分子流行病學調(diào)查提供一種有效的分子生物學診斷方法。
[0009] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種用于檢測口蹄疫病毒通用 型的引物，所述的引物為引物對FMDU，其中，
[0010] 上游引物FMDUF: 5' -GATGGCCTCAAAGACCC-3'
[0011] 下游引物FMDUR: 5' -GACTCGCCGTCCACTCT-3'。
[0012] -種用于檢測口蹄疫病毒通用型的試劑盒，所述的試劑盒包括引物對FMDU，其中，
[0013] 上游引物FMDUF: 5' -GATGGCCTCAAAGACCC-3'
[0014] 下游引物FMDUR: 5' -GACTCGCCGTCCACTCT-3'。
[0015] 所述的試劑盒還包括5XRT Buffer、dNTPs、Taq酶、RNA酶抑制劑、反轉(zhuǎn)錄酶、DEPC 水、裂解液和沖洗液。
[0016] 所述的試劑盒還包括陽性對照和陰性對照。
[0017] 所述的裂解液的組分為:羥基喹啉3~5 % (質(zhì)量分數(shù)）、磷酸三氯乙酯3.2~5.2μΜ、 異硫氰酸苯酯1.5~3.5μΜ、聚乙烯基吡咯烷酮1.3~3.5% (質(zhì)量分數(shù)）、氯化鈉0.3~0.5Μ和 朽1檬酸鈉〇. 6~0.9Μ。
[0018] 所述的沖洗液的組分為：三羥甲基氨基甲烷1 ΟμΜ，乙二胺四乙酸ΙμΜ，乙醇60~ 80% (體積分數(shù)）；ρΗ 7.0。
[0019] -種用于檢測口蹄疫病毒通用型的試劑盒的使用方法，包括以下步驟：
[0020] (1)樣品的米集 [0021] (2)樣品RNA的提取
[0022] (3)RT-PCR
[0023] 對樣品RNA進行RT-PCR擴增，反應(yīng)體系25yl:5XRT Buffer 5μ1、12.5μΜ dNTPs 5μ 1、125μΜ 上游引物FMDUF 和 125μΜ下游引物 FMDUR 各 2μ1、25υ/μ1 Taq酶 0.5μ1、2.5υ/μ1 RNA 酶 抑制劑 1μ1、2·5μΜ反轉(zhuǎn)錄酶lyl、DEPC水3·5μ1 和5ng/yl RNA 5μ1;
[0024] RT-PCR 擴增程序為：5〇1€3〇1^11，941€21^11;941€358,55 1€4〇8,721€358，共35個循 環(huán)；72°C5min;
[0025] (4)RT-PCR擴增產(chǎn)物的檢測
[0026] 將PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。
[0027] 所述的樣品的采集分為固體狀動物組織的采集或液體狀動物組織的采集;其中， [0028]固體狀動物組織的采集方法為:無菌采集動物組織病料0.1-100mg，裝入無 RNA酶 污染的離心管中備用；
[0029] 液體狀動物組織的采集分為分泌液的采集或血液的采集，分泌液的采集方法為： 用鼻咽拭子采集鼻咽液，裝入無 RNA酶污染的離心管中備用;血液的采集方法為:取全血、血 清或血漿10-1 〇〇μ 1，加入無 RNA酶污染的離心管中備用。
[0030] 所述的樣品RNA的提取，具體方法為：
[0031] (1)將固體狀的動物組織先進行研磨處理，液體狀的動物組織直接用于提取；
[0032] (2)在研磨后成糊狀的動物組織20-100mg或液體狀動物組織20-100μ1中，加裂解 液500μ1，12000rpm離心30s，分離出上清液；
[0033] (3)將上清液轉(zhuǎn)入離心管中，加無水乙醇500μ1，分次轉(zhuǎn)到RNA純化柱上，12000rpm 離心30s，得到粗提的RNA;
[0034] (4)用沖洗液500μ1沖洗RNA純化柱，12000rpm離心30s;
[0035] (5)將RNA純化柱轉(zhuǎn)到另一離心管，加 DEPC水50yl，12000rpm離心30s，得到病毒及 組織基因組的RNA，于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0036] -種用于檢測口蹄疫病毒通用型的試劑盒在檢測口蹄疫病毒通用型方面的應(yīng)用。 [0037]本發(fā)明的有益效果
[0038] 1、本發(fā)明對核酸提取過程進行改進，即采用與現(xiàn)有試劑盒不同配方的裂解液和沖 洗液，大大縮短了核酸提取時間，使核酸的提取時間由原來的1-2小時縮短為2分鐘，節(jié)省了 核酸提取的時間，從而提高了試劑盒的使用效率，使試劑盒的檢驗更加快捷、經(jīng)濟。其中，本 發(fā)明的裂解液可以使樣品迅速裂解，釋放出RNA。沖洗液可有效除去蛋白質(zhì)、鹽類及雜質(zhì)等， 使所提取的RNA更加純凈。
[0039] 2、本發(fā)明根據(jù)口蹄疫病毒的3D基因組序列，設(shè)計能夠檢測口蹄疫病毒通用型的特 異性引物，同等條件下不能擴增口蹄疫其他血清型，具有很高的特異性。同時，本發(fā)明的試 劑盒具有很高的靈敏度，最低檢測限為〇. Ipg/μL。
[0040] 3、本發(fā)明提供了一種用于檢測口蹄疫病毒通用型試劑盒，該試劑盒能快速、準確 的檢測出口蹄疫病毒通用型毒株?？蓪谔阋吒腥镜膯蝹€樣品檢測，也可對臨床病例中混 合感染的檢測，可用于口蹄疫病毒病原普查、分子流行病學調(diào)查及疫苗篩選和監(jiān)測。
[0041] 4、本發(fā)明的方法是建立在分子生物學基礎(chǔ)上的，檢測中提供了陰性對照和陽性對 照，大大提高了檢測的準確度，降低假陽性的出現(xiàn)幾率，特異性較強，省時省力，該試劑盒將 檢測時間縮短至3小時，大大提高了工作效率。
[0042] 5、本發(fā)明特別適合于口蹄疫病毒感染的大量臨床樣本的快速診斷，可以為臨床和 科研上口蹄疫病防治和治療提供科學依據(jù)，而且對提高口蹄疫病毒病原的檢測、監(jiān)控、疫苗 研制等具有重要意義。
【附圖說明】
[0043]圖1為RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖；其中，泳道Μ代表DL 2000DNA Marker(從上到下依次為2000bp、lOOObp、750bp、500bp、250bp、100bp)，泳道 1-7分別代表口 蹄疫病毒A型、0型、C型、SAT1 (南非I)、SAT2(南非II型）、SAT3(南非III型)及Asial型(亞洲1 型）陰性對照;泳道8-14分別代表口蹄疫病毒A型、0型、C型、SAT1 (南非I)、SAT2(南非II型）、 SAT3(南非III型)及Asial型(亞洲1型)樣品。
【具體實施方式】
[0044]以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細說明。
[0045]本發(fā)明所用的聚乙烯基吡咯烷酮的相對分子量為40000。
[0046] 本發(fā)明所用的羥基喹啉為2-羥基喹啉。
[0047] 實施例1用于檢測口蹄疫病毒通用型的試劑盒
[0048] 1、引物的設(shè)計
[0049] 根據(jù)口蹄疫病毒通用型的基因序列，設(shè)計引物對FMDU，其中，
[0050] 上游引物FMDUF: 5' -GATGGCCTCAAAGACCC-3' (SEQ ID N0 · 1)
[0051] 下游引物FMDUR:5/-GACTCGCCGTCCACTCT-3 /(SEQIDN0·2)。
[0052] 2、RNA 的提取
[0053] 以黃牛為實驗動物，提取樣品RNA，包括以下步驟：
[0054] (1)樣品的米集
[0055]采集黃牛全血100μΙ，加入無 RNA酶污染的離心管中備用。
[0056] (2)樣品RNA的提取
[0057] (a)在采集的100μΙ全血中，加裂解液500yl，12000rpm離心30s，分離出上清液； [0058] (c)將上清液轉(zhuǎn)入離心管中，加無水乙醇500μ1，分次轉(zhuǎn)到RNA純化柱上，12000rpm 離心30s，得到粗提的RNA;
[0059] (d)用沖洗液500μ1沖洗RNA純化柱，12000rpm離心30s;
[0060] (e)將RNA純化柱轉(zhuǎn)到另一離心管，加 DEPC水50yl，12000rpm離心30s，得到病毒及 組織基因組的RNA，于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0061] 3、RT_PCR
[0062] 以樣品RNA為模板，進行RT-PCR擴增，同時以豬水皰病病毒為陰性對照，以各血清 型RNA為陽性對照，提取陰性對照和陽性對照樣品的RNA，RT-PCR擴增(方法同黃牛全血樣品 RNA的提?。?，反應(yīng)體系25yl:5XRT Buffer 5μ1、12.5μΜ dNTPs 5μ1、125μΜ上游引物FMDUF 和 125μΜ下游引物 FMDUR各 2μ1、25υ/μ1 Taq酶 0.5μ1、2.5υ/μ1 RNA酶抑制劑 ΙμL、2.5μΜ反轉(zhuǎn) 錄酶lyl、DEPC水3·5μ1 和5ng/yl RNA 5μ1。
[0063] RT-PCR 擴增程序為：5〇1€3〇1^11，941€21^11;941€358,55 1€4〇8,721€358，共35個循 環(huán)；72°C5min。
[0064] 4、RT-PCR擴增產(chǎn)物的檢測
[0065] 取RT-PCR擴增產(chǎn)物5μ1和Loading Buffer 5μ1混勻，加到含EB的1.0%的瓊脂糖凝 膠中，同時加入陰性對照、陽性對照的RT-PCR擴增產(chǎn)物和DL2000DNA Marker，電壓為120V， 電泳35min，然后在凝膠成像儀中觀察結(jié)果。
[0066] 實施例2用于檢測口蹄疫病毒通用型的試劑盒的應(yīng)用
[0067] 采用實施例1的試劑盒檢測口蹄疫病毒A型，其中，本實施例的裂解液的組分為:羥 基喹啉3% (質(zhì)量分數(shù)）、磷酸三氯乙酯3.2μΜ、異硫氰酸苯酯3.5μΜ、聚乙烯基吡咯烷酮1.3% (質(zhì)量分數(shù)）、氯化鈉0.3Μ和檸檬酸鈉0.9Μ。沖洗液的組分為:三羥甲基氨基甲烷10μΜ，乙二 胺四乙酸ΙμΜ，乙醇60% (體積分數(shù)）；pH 7.0。本實施例的實驗動物為確診攜帶口蹄疫病毒A 型的黃牛，以豬水皰病病毒為陰性對照，以口蹄疫病毒A型為陽性對照(結(jié)果見圖1)。
[0068] 實施例3用于檢測口蹄疫病毒通用型的試劑盒的應(yīng)用
[0069] 采用實施例1的試劑盒檢測口蹄疫病毒0型，其中，本實施例的裂解液的組分為羥 基喹啉5% (質(zhì)量分數(shù)）、磷酸三氯乙酯4μΜ、異硫氰酸苯酯2.5μΜ、聚乙烯基吡咯烷酮2% (質(zhì) 量分數(shù)）、氯化鈉0.5Μ和檸檬酸鈉0.6Μ。沖洗液的組分為三羥甲基氨基甲烷10μΜ，乙二胺四 乙酸ΙμΜ，乙醇80 % (體積分數(shù)）；pH 7.0。本實施例的實驗動物為確診攜帶口蹄疫病毒0型的 黃牛，以豬水皰病病毒為陰性對照，以口蹄疫病毒〇型為陽性對照(結(jié)果見圖1)。
[0070] 實施例4用于檢測口蹄疫病毒通用型的試劑盒的應(yīng)用
[0071] 采用實施例1的試劑盒檢測口蹄疫病毒C型，其中，本實施例的裂解液的組分為羥 基喹啉4 % (質(zhì)量分數(shù)）、磷酸三氯乙酯5.2μΜ、異硫氰酸苯酯1.5μΜ、聚乙烯基吡咯烷酮3.5 % (質(zhì)量分數(shù)）、氯化鈉0.4Μ和檸檬酸鈉0.8Μ。沖洗液的組分為三羥甲基氨基甲烷ΙΟμΜ，乙二胺 四乙酸ΙμΜ，乙醇70 % (體積分數(shù)）;pH 7.0。本實施例的實驗動物為確診攜帶口蹄疫病毒C型 的黃牛，以豬水皰病病毒為陰性對照，以口蹄疫病毒C型為陽性對照(結(jié)果見圖1)。
[0072] 實施例5用于檢測口蹄疫病毒通用型的試劑盒的應(yīng)用
[0073] 實施例5的試劑盒使用方法與實施例2的試劑盒基本相同，不同之處在于:本實施 例的實驗動物為確診攜帶口蹄疫病毒SAT1型的黃牛，以豬水皰病病毒為陰性對照，以口蹄 疫病毒SAT1型為陽性對照(結(jié)果見圖1)。
[0074] 實施例6用于檢測口蹄疫病毒通用型的試劑盒的應(yīng)用
[0075] 實施例6的試劑盒使用方法與實施例2的試劑盒基本相同，不同之處在于:本實施 例的實驗動物為確診攜帶口蹄疫病毒SAT2型的黃牛，以豬水皰病病毒為陰性對照，以口蹄 疫病毒SAT2型為陽性對照(結(jié)果見圖1)。
[0076] 實施例7用于檢測口蹄疫病毒通用型的試劑盒的應(yīng)用
[0077] 實施例7的試劑盒使用方法與實施例2的試劑盒基本相同，不同之處在于:本實施 例的實驗動物為確診攜帶口蹄疫病毒SAT3型的黃牛，以豬水皰病病毒為陰性對照，以口蹄 疫病毒SAT3型為陽性對照(結(jié)果見圖1)。
[0078] 實施例8用于檢測口蹄疫病毒通用型的試劑盒的應(yīng)用
[0079] 實施例8的試劑盒使用方法與實施例2的試劑盒基本相同，不同之處在于:本實施 例的實驗動物為確診攜帶口蹄疫病毒Asial型的黃牛，以豬水皰病病毒為陰性對照，以口蹄 疫病毒Asial型為陽性對照(結(jié)果見圖1)。
[0080] 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，本發(fā)明分別攜帶口蹄疫病毒A型、0型、C型、SAT1 (南非 I)、SAT2(南非II型）、SAT3(南非III型）和Asial型（亞洲1型）的黃牛樣品RNA的RT-PCR擴增 產(chǎn)物均在335bp出現(xiàn)條帶，與預期相符，說明本發(fā)明的RT-PCR試劑盒具有良好的特異性。
[0081] 使用本發(fā)明實施例2的試劑盒提取不同樣品的基因組RNA，對提取的基因組RNA的 濃度和純度進行測定，結(jié)果見下表。
[0082] 表本發(fā)明試劑盒提取的基因組RNA濃度和純度的測定結(jié)果
[0084] 注：RNA濃度單位為ng/μL;吸光度比值為RNA在260nm和280nm處的吸光度比值 (260/280)，通過吸光度比值來判斷RNA的純度，從上表可以看出，吸光度值在1.8~2.0之 間，說明提取的RNA純度較好。
[0085] 表中樣品1、2、3、4、5、6、7分別為使用該試劑盒從100μΙ血清中提取約1. OOyg、1.09 yg、l .09yg、l .08yg、l .02yg、l .09yg、l .05yg基因組RNA。
[0086]將提取的 RNA 取 lyg/μL 作 10 倍系列稀釋，分別取 lyg/μL、lOOng/μΙ、lOng/μΙ、lng/μ 1、lOOpg/μΙ、lOpg/μΙ、lpg/μL、0 · lpg/μL、0 · Olpg/μL、0 · OOlpg/μΙ RNA進行RT-PCR-步法進 行擴增，結(jié)果表明本發(fā)明對口蹄疫病毒7個血清型的最低檢測限約為o.lpg/μL，這比普通的 RT-PCR兩步法的敏感性（1 pg/μ 1)高出10倍。
【主權(quán)項】
1. 一種用于檢測口蹄疫病毒通用型的引物，其特征在于，所述的引物為引物對FMDU，其 中， 上游引物FMDUF: 5' -GATGGCCTCAAAGACCC-3' 下游引物FMDUR: 5' -GACTCGCCGTCCACTCT-3'。2. -種用于檢測口蹄疫病毒通用型的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包括引物對 FMDU，其中， 上游引物FMDUF: 5' -GATGGCCTCAAAGACCC-3' 下游引物FMDUR: 5' -GACTCGCCGTCCACTCT-3'。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于檢測口蹄疫病毒通用型的試劑盒，其特征在于，所述的試 劑盒還包括5 X RT Buffer、dNTPs、Taq酶、RNA酶抑制劑、反轉(zhuǎn)錄酶、DEPC水、裂解液和沖洗 液。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于檢測口蹄疫病毒通用型的試劑盒，其特征在于，所述的試 劑盒還包括陽性對照和陰性對照。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于檢測口蹄疫病毒通用型的試劑盒，其特征在于，所述的裂 解液的組分為:羥基喹啉3~5 % (質(zhì)量分數(shù)）、磷酸三氯乙酯3.2~5.2μΜ、異硫氰酸苯酯1.5 ~3.5μΜ、聚乙烯基吡咯烷酮1.3~3.5 % (質(zhì)量分數(shù)）、氯化鈉0.3~0.5Μ和檸檬酸鈉 O . 6~ 0.9Μ〇6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于檢測口蹄疫病毒通用型的試劑盒，其特征在于，所述的沖 洗液的組分為：三羥甲基氨基甲烷1〇μΜ，乙二胺四乙酸ΙμΜ，乙醇60~80 % (體積分數(shù)）；pH 7.0〇7. -種如權(quán)利要求3所述的用于檢測口蹄疫病毒通用型的試劑盒的使用方法，其特征 在于，包括以下步驟： (1) 樣品的采集 (2) 樣品RNA的提取 (3) RT-PCR 對樣品RNA進行RT-PCR擴增，反應(yīng)體系25μ1: 5 XRT Buffer 5μ1、12.5μΜ dNTPs 5μ1、 125μΜ上游引物FMDUF和 125μΜ下游引物FMDUR各2μ1、25U/yl Taq酶0.5μ1、2.5U/yl RNA酶抑 制劑 1μ1、2·5μΜ反轉(zhuǎn)錄酶lyl、DEPC水3·5μ1 和5ng/yl RNA 5μ1; RT-PCR擴增程序為：50°C 30min，94°C 2min;94°C 35s，55°C 40s，72°C 35s，共35個循 環(huán)；72°C 5min; (4) RT-PCR擴增產(chǎn)物的檢測 將PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于檢測口蹄疫病毒通用型的試劑盒的使用方法，其特征在 于，所述的樣品的采集分為固體狀動物組織的采集或液體狀動物組織的采集;其中， 固體狀動物組織的采集方法為:無菌采集動物組織病料O.l-lOOmg，裝入無 RNA酶污染 的離心管中備用； 液體狀動物組織的采集分為分泌液的采集或血液的采集，分泌液的采集方法為：用鼻 咽拭子采集鼻咽液，裝入無 RNA酶污染的離心管中備用;血液的采集方法為:取全血、血清或 血漿10-100μ 1，加入無 RNA酶污染的離心管中備用。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的用于檢測口蹄疫病毒通用型的試劑盒的使用方法，其特征在 于，所述的樣品RNA的提取，具體方法為： (1) 將固體狀的動物組織先進行研磨處理，液體狀的動物組織直接用于提?。? (2) 在研磨后成糊狀的動物組織20-100mg或液體狀動物組織20-100μ1中，加裂解液500 μL，12000rpm離心30s，分離出上清液； (3) 將上清液轉(zhuǎn)入離心管中，加無水乙醇500μ1，分次轉(zhuǎn)到RNA純化柱上，12000rpm離心 30s，得到粗提的RNA; (4) 用沖洗液500μ1沖洗RNA純化柱，12000rpm離心30s; (5) 將RNA純化柱轉(zhuǎn)到另一離心管，加 DEPC水50yl，12000rpm離心30s，得到病毒及組織 基因組的RNA，于-20 °C保存?zhèn)溆谩?0. -種如權(quán)利要求2-6任一項所述的用于檢測口蹄疫病毒通用型的試劑盒在檢測口 蹄疫病毒通用型方面的應(yīng)用。
【文檔編號】C12R1/93GK105950783SQ201610343263
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月23日
【發(fā)明人】李海利, 白獻曉, 蘭亞莉, 徐照學, 王璟, 師志海
【申請人】河南省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所