一種可同時檢測四種弧菌的多重lamp方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及大菱解弧菌、創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌和魚腸道弧菌的檢測方法，具體設(shè) 及大菱解弧菌、創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌和魚腸道弧菌的多重LAMP檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 大菱解弧菌(Vibrio scophthalmi)是一種革蘭氏陰性菌，呈短桿狀，現(xiàn)已知該菌 是大菱解、牙解等重要經(jīng)濟魚類的致病菌，病魚癥狀為皮膚變黑、肝臟和小腸出血、并伴有 腹水和腹脹;創(chuàng)傷弧菌(V化rio vulnificus)是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌，主要分布于近海海 洋環(huán)境中，是水產(chǎn)養(yǎng)殖郵、蟹和牡頗等水生動物中最常見、流行最廣、危害最嚴重的致病菌 之一；副溶血弧菌(V化rio化rahemolyticus)，為革蘭氏陰性桿菌，呈弧狀、桿狀、絲狀等多 種形狀，廣泛存在于海水和海產(chǎn)品中，是我國沿海地區(qū)常見的食物中毒病原菌;魚腸道弧菌 (Vibrio ichthyoenteri)是水產(chǎn)養(yǎng)殖中新發(fā)現(xiàn)的一種革蘭氏陰性致病菌，呈桿狀，兩端純 圓，散在或成雙，無芽抱，可感染大菱解（ScophthaImusmaximus )、牙解（ParaIichthyS olivaceus)、石蝶化areius bicoloratus)等多種名貴海水養(yǎng)殖魚類，造成嚴重的經(jīng)濟損 失。
[0003] 目前，針對大菱解弧菌、創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌和魚腸道弧菌的檢測技術(shù)主要是 PCR法、DNA雜交法和菌落雜交法。然而，由于運些方法通常需要昂貴的儀器設(shè)備，且操作繁 瑣、費時費力，很難推廣應(yīng)用。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是2000年由Notomi等人發(fā)明的一種新的病原核酸檢測技術(shù)，該技術(shù) 根據(jù)祀序列設(shè)計四條特異性引物，可W特異性識別祀序列的六個特定區(qū)域，在等溫條件下， 通過Bst DNA聚合酶的鏈置換和鏈延伸作用，可W在1小時內(nèi)對祀序列實現(xiàn)IO9倍的擴增，擴 增產(chǎn)物加入巧光染料SYBR Green I后，陽性結(jié)果變?yōu)榫G色，陰性無變化，可W通過肉眼直接 觀察。已經(jīng)有關(guān)于創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌的單重LAMP檢測方法，但多重LAMP比單重LAMP更 加快速、簡便等特點，適合基層養(yǎng)殖場對病原的快速檢測。然而，由于引物之間的相互干擾、 多重LAMP檢測條件的優(yōu)化、W及檢測結(jié)果分析等方面的難度和復(fù)雜性，至今尚未有報道能 同時檢測所述四種水產(chǎn)養(yǎng)殖致病菌的多重LAMP方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了一種大菱解弧菌、創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌和魚腸道弧菌的多重LAMP 的檢測方法，目的是實現(xiàn)對大菱解弧菌、創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌和魚腸道弧菌進行特異、靈 敏、快速、簡便的現(xiàn)場檢測。改善原有檢測技術(shù)繁瑣、費時的弊端。
[0005] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用W下技術(shù)方案予W實現(xiàn)：1、提供4組LAMP引物序列， 大菱解弧菌長度分別為49bp，43bp，ISbp，20bp的核巧酸序列，分別命名為111成斗1?、111成-BIP、1UXR-F3、1UXR-B3;創(chuàng)傷弧菌長度分別為45bp，46bp，20bp，19bp的核巧酸序列，分別命 名為metal Ioprotease-FIP、metalIoprotease-BIP、metalIoprotease-F3、 metal lop;rotease-B3;長度分別為47bp，44bp，19bp，2化P的核巧酸序列，分別命名為ompA- FIP、ompA-BIP、ompA-F3、ompA-B3;魚腸道弧菌長度分別為 46bp，46bp，18bp，19bp 的核巧酸 序列，分別命名為ToxR-FIP、ToxR-BIP、ToxR-F3、ToxR-B3。2、配置LAMP反應(yīng)體系，通過LAMP 反應(yīng)程序?qū)我粯悠纺０暹M行擴增，四種引物按比例加入，確定最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件； 3、反應(yīng)產(chǎn)物的鑒定:2%瓊脂糖凝膠電泳;酶切分析;產(chǎn)物加入SYBR Green I，觀察反應(yīng)管中 顏色變化。具體包括如下步驟：
[0006] 1、設(shè)計LAMP引物：根據(jù)GeneBank中已知的大菱解弧菌IuxR基因（GenBank : JN684209.1)，創(chuàng)傷弧菌的metalIoprotease基因（GenBank:呪0548.1)，副溶血弧菌的ompA 基因（GenBank:JTGT01000603.1)和魚腸道弧菌的ToxR基因（GenBank:KT265743)作為祀序 列，通過Primer Explore V4在線設(shè)計軟件設(shè)計四條特異性引物，對于大菱解弧菌，在FIP的 Flc和F2之間添加EcorI酶切位點，在BIP的Blc和B2之間添加-TTTT-連接子;對于魚腸道弧 菌，在FIP的Flc和F2之間添加EcorV酶切位點，在BIP的Blc和B2之間添加-TTTT-連接子，對 于V. vulnificus,在BIP的Blc和B2之間添加BamHI酶切位點，在FIP的Flc和F2之間添加-TTTT-連接子；V.par址aemolyticus，在BIP的Blc和B2之間添加PstI酶切位點，在FIP的Flc 和F2之間添加-TTTT-連接子，設(shè)計W下四組LAMP引物：
[0007] 表1:多重LAMP引物組
[000引 [0009]
[0010] 2、配制LAMP反應(yīng)體系
[0011] LAMP反應(yīng)體系各組分含量：總體系25iil，包括Bst DNA聚合酶IiU(SOOOU), 10 X BstDNABuffer2.5i^l，PCR級甜菜堿化l(5M)，dNTPs(2.5mMeach)2.5山，DNA模板化l，F(xiàn)IP/ BIP各0.化1 (1.6iiM) ,F3/B3各0.化1 (0.化M)，加雙蒸水使反應(yīng)體系總體積達到。
[0012] 3、LAMP反應(yīng)體系擴增:將上述反應(yīng)體系進行擴增反應(yīng)，反應(yīng)溫度58到65°C，反應(yīng)時 間為15到90min.
[OOU] 4、擴增產(chǎn)物檢測：2%瓊脂糖凝膠電泳;酶切分析;產(chǎn)物加入SYBR Green I，觀察反 應(yīng)管中顏色變化。
[0014] 本發(fā)明提供的同時檢測四種致病菌的多重LAMP檢測方法，有W下優(yōu)勢：
[0015] -、靈敏度高對創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌的檢測可低至8CFU/山，比普通PCR高100- 1000倍。
[0016] 二、特異性強所需的特異性引物分別根據(jù)大菱解弧菌IuxR基因、創(chuàng)傷弧菌的 metal Ioprotease基因、副溶血弧菌的ompA基因和魚腸道弧菌的ToxR基因的六個不同區(qū)域 進行設(shè)計，特異性比常規(guī)PCR強。
[0017] S、檢測時間短化左右即可獲得檢測結(jié)果，比普通PCR省時。
[0018] 四、儀器設(shè)備要求低不需要PCR儀等昂貴儀器，產(chǎn)物可W進行電泳，也可W直接加 入SYBR Green I染料，觀察顏色變化，從而確定反應(yīng)與否。
[0019] 五、操作簡單、結(jié)果易觀察：整個檢測過程不設(shè)及復(fù)雜儀器設(shè)備，產(chǎn)物加入SYBR Green I染料，可W直接用肉眼觀察判斷。
[0020] 綜上所述，本發(fā)明具有比現(xiàn)有的PCR技術(shù)檢測大菱解弧菌、創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌 和魚腸道弧菌的方法，有更高的特異性、靈敏度和便捷性，并且可W在實際生產(chǎn)中用于現(xiàn)場 檢測，有利于及時發(fā)現(xiàn)魚類養(yǎng)殖中的大菱解弧菌、創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌和魚腸道弧菌。
【附圖說明】
[0021 ] 圖1反應(yīng)溫度優(yōu)化:溫度梯度從左往右依次58°C到65 °C8個梯度1，3,5,7,9，11，13， 15分別為58°C，59°C，60°C，6TC，62°C，63°C，64°C，65°C的陰性對照；2,4,6,8，10，12，14，16 分別為58 °C，59 °C，60 °C，6rC，62 °C，63 °C，64°C，65 °C 加模板。
[0022] M: marker，A:大菱解弧菌，B:創(chuàng)傷弧菌，C:副溶血弧菌，D:魚腸道弧菌。
[0023] 圖 2 反應(yīng)時間優(yōu)化：1-6 分別代表 15min，30min，45min，60min，75min，90min;
[0024] M為marker，A:大菱解弧菌，B:創(chuàng)傷弧菌，C:副溶血弧菌，D:魚腸道弧菌。
[0025] 圖3 LAMP擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜及酶切分析：
[00%] A:大菱解弧菌，B:創(chuàng)傷弧菌，C:副溶血弧菌，D:魚腸道弧菌；
[0027] 泳道1:EcoRV酶切，2:Pst I酶切，3:BamHI酶切，4:EcoRI酶切，5:緩沖液對照，M為 marker > O
[002引圖4靈敏度比較:A-D分別為大菱解弧菌、創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌、魚腸道弧菌的PCR 檢測結(jié)果，E-H分別為大菱解弧菌、創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌、魚腸道弧菌的LAMP檢測結(jié)果；
[0029] 泳道M:Marker，泳道 1-8:1.6 X l〇6c即AU-1.6 X l〇-iCFU/iU依次 10倍比稀釋的細 菌模板。
[0030] 圖5 SYBR Green I顯色反應(yīng):對用大菱解弧菌、創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌和魚腸道弧 菌四種細菌人工感染的大菱解魚的肝、腎、脾、血進行多重LAMP擴增，產(chǎn)物加入SYBR Green I，感染組顯示綠色，對照組無變化。
[0031] A:感染大菱解弧菌;B:感染創(chuàng)傷弧菌C:感染副溶血弧菌D:感染魚腸道弧菌；
[0032] 離屯、管1，3,5,7分別為健康組的脾、腎、肝、血;2,4,6,8分別為感染組的脾、腎、肝、 血。
[0033] 圖6多重LAMP檢測方法的應(yīng)用：平板計數(shù)法結(jié)合多重LAMP確定四種細菌在不同組 織中的檢出率
[0034] A:感染大菱解弧菌;B:感染創(chuàng)傷弧菌C:感染副溶血弧菌D:感染魚腸道弧菌。
【具體實施方式】
[0035] W下結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。
[0036] 實施例1大菱解弧菌、創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌和魚腸道弧菌多重LAMP方法的建立
[0037] 1材料:dNTPs、BstDNA聚合酶(含10X緩沖液）、PCR級甜菜堿等。
[003引 2方法
[0039] 2.1引物設(shè)計與合成
[0040] 根據(jù)GeneBank中已知的大菱解弧菌IuxR基因（GenBank: JN684209.1)，創(chuàng)傷弧菌的 metalloprotease基因（GenBank:U50548.1)，副溶血弧菌的 ompA基因（GenBank : JTGT01000603.1)和魚腸道弧菌的ToxR基因（GenBank:KT265743)作為祀序列，設(shè)計四條特 異性引物。對于大菱解弧菌，在FIP的Flc和F2之間添加EcorI酶切位點，在BIP的Blc和B2之 間添加-TTTT-連接子;對于魚腸道弧菌，在FIP的Flc和F2之間添加EcorV酶切位點，在BIP的 Blc和B2之間添加-Tm-連接子，對于V. vulnificus,在BIP的Blc和B2之間添加BamHI酶切 位點，在FIP的Flc和F2之間添加-TTTT-連接子;V. par址aemolyticus，在BIP的Blc和B2之間 添加PstI酶切位點，在FIP的Flc和F2之間添加-TTTT-連接子，設(shè)計并合成如表1所示四組 LAMP引物。
[0041 ] 2.2LAMP擴增條件的優(yōu)化
[0042] 優(yōu)化反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間。檢測所用的模板用煮沸裂解