一種馬鈴薯卷葉病毒rt-lamp檢測試劑盒及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物檢測領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種馬鈴薯卷葉病毒RT-LAMP 檢測試劑盒及檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 馬鈴薯是全世界最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，既可以作為人類的消費品、動物飼料，也 可以作為釀酒和提取淀粉的原料。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織統(tǒng)計，目前馬鈴薯是世界上僅次于小 麥、水稻和玉米的第四種主要農(nóng)作物。我國馬鈴薯的種植面積和產(chǎn)量居世界第一位。長期以 來，馬鈴薯多種病毒及類病毒對馬鈴薯生產(chǎn)造成了極大地威脅，是引起馬鈴薯品種退化的 主要原因，嚴(yán)重影響馬鈴薯的產(chǎn)量和質(zhì)量。其中馬鈴薯Y病毒和馬鈴薯卷葉病毒是危害最嚴(yán) 重的病毒。
[0003] 馬鈴薯卷葉病毒(potato leafroll virus，PLRV)是馬鈴薯卷葉病毒屬成員，以前 將其劃為黃癥病毒屬(Lureovirus)成員，分布于世界各馬鈴薯種植區(qū)。病毒粒體球狀，等軸 對稱，直徑24nm，基因組為正鏈RNA，基因組全長5882bp，其有6個ORFs。該病毒可通過種薯傳 播，在田間病毒嚴(yán)格蟲傳。病毒在寄主體內(nèi)含量低，主要集中于寄主維管束中，因此難于大 量提純，致使對該病毒的分子生物學(xué)研究進(jìn)展緩慢。
[0004] 大規(guī)模組織培養(yǎng)無病毒種薯生產(chǎn)是控制馬鈴薯病毒病的主要方法，而優(yōu)良種薯生 產(chǎn)要求建立快速、準(zhǔn)確、靈敏的病毒檢測技術(shù)。傳統(tǒng)的馬鈴薯病毒檢測鑒定方法為指示植物 法，即通過具有特征性的感染癥狀從而判斷是否存在病毒，而目前大多采用的診斷方法主 要是酶聯(lián)免疫檢測。雖然酶聯(lián)免疫檢測法比傳統(tǒng)的檢測方法靈敏度提高了許多，但仍然存 在不易檢測交叉感染的病毒和不能檢測休眠種薯中的病毒等方面的缺陷。因此分子生物學(xué) 技術(shù)成為馬鈴薯病毒檢測的發(fā)展方向。開發(fā)快速、準(zhǔn)確、高效的PLRV分子生物學(xué)檢測方法， 能夠監(jiān)控馬鈴薯種薯的質(zhì)量，快速鑒定田間植株病害，及時監(jiān)控發(fā)病情況，符合產(chǎn)業(yè)需求。
[0005] 環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是 近些年發(fā)展起來的一種新型的核酸擴增方法(見Notomi T等，Nucleic Acids Res.2000Jun 15;28(12):E63)，而逆轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(RT-LAMP)基于LAMP建立，其在反應(yīng)體系 中增加了逆轉(zhuǎn)錄酶，使RNA的逆轉(zhuǎn)錄和cDNA的LAMP擴增在同一試管中一步完成。此外，RT-LAMP還具有檢測速度快、操作簡單和靈敏度高等優(yōu)點:該技術(shù)依賴于能夠識別靶序列上6個 特異性區(qū)域的引物和具有解旋功能且呈瀑布式擴增的Bst DNA聚合酶，在等溫條件下可以 高效、快速和特異性地擴增靶序列。與RT-PCR相比，RT-LAMP的靈敏度顯著較高，優(yōu)勢明顯。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種馬鈴薯卷葉病毒RT-LAMP檢測試劑盒及檢測方法。 [0007]為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，在一個方面中，本發(fā)明提供了一種馬鈴薯卷葉病毒RT-LAMP檢測試劑盒，其包括4條特異性引物，所述引物的核苷酸序列如下所示：
[0008]外引物F3:AGGCGCGCTAACAGAGTT(SEQ ID N0:1)
[0009] 外引物B3:CCCGAAGGTGAAACTTCCTT(SEQ ID N0:2)
[0010] 內(nèi)引物FIP:GGCGATTGCCTCCTCTTCTACG-GCCAGTGGTTATGGTCACG(SEQ ID N0:3)
[0011] 內(nèi)引物BIP:AAGAACTGGAGTTCCCCGAGGA-GCCCATGAGGTTGTCCTTTG(SEQ ID N0:4)。
[0012] 進(jìn)一步地，本發(fā)明的試劑盒還包括反應(yīng)緩沖液、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、Bst DNA聚合酶和核 酸染料，其中所述反應(yīng)緩沖液由2mM dNTP、10 X ThermoPo 1反應(yīng)緩沖液、0.6mM甜菜堿和6mM Mg2+組成。
[0013]在本發(fā)明的試劑盒中，優(yōu)選外引物F3和外引物B3的濃度均為0.2μπι〇1/μ1，內(nèi)引物 FIP和內(nèi)引物ΒΙΡ的濃度均為1.2μπιο1/μ1。
[0014] 在本發(fā)明的試劑盒中，優(yōu)選核酸染料為SYBR Green I。
[0015] 進(jìn)一步地，本發(fā)明的試劑盒還可以包括RNA提取試劑以及陽性對照和陰性對照。
[0016] 在另一個方面中，本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明的試劑盒對馬鈴薯卷葉病毒進(jìn)行檢 測的方法。
[0017] 本發(fā)明的馬鈴薯卷葉病毒RT-LAMP檢測試劑盒和檢測方法針對PLRV的包膜蛋白編 碼基因的6個區(qū)域設(shè)計特異性和靈敏度高的4條引物，且一步完成逆轉(zhuǎn)錄和擴增步驟，假陽 性率低、快速、高效，且通過肉眼觀察顏色變化即可判定結(jié)果，無需電泳和紫外觀察等步驟， 無需使用熱循環(huán)儀等儀器，成本低、操作簡單、鑒定簡便，適于進(jìn)行PLRV的基礎(chǔ)實驗室和田 間檢測。
【具體實施方式】
[0018] 以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0019] 實施例1馬鈴薯卷葉病毒RT-LAMP檢測試劑盒的制備
[0020] 1.1試劑
[0021]引物由天根生化科技(北京)有限公司合成;Bst DNA聚合酶和lOXThermoPol反應(yīng) 緩沖液購自NEB;AMV逆轉(zhuǎn)錄酶購自Promega公司；SYBR Green I和TRIZ0L Reagent購自 Invitrogen;其余PCR所需試劑購自Sigma。
[0022] 1.2試劑盒的制備：
[0023] 反應(yīng)緩沖液，按照以下配方配制：2mM dNTP、10 X ThermoPol反應(yīng)緩沖液、0.6mM甜 菜喊和6mM Mg2+;
[0024] 4條特異性引物：外引物F3,其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；外引物B3,其核苷 酸序列如SEQ ID N0:2所示；內(nèi)引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示，內(nèi)引物BIP，其 核苷酸序列如SEQ ID如:4所示。其中外引物？3和外引物83的濃度為0.2以111〇1/^1，內(nèi)引物 FIP和內(nèi)引物BIP的濃度為1.2μπιο1/μ1。
[0025] 2U的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶；
[0026] 8U的Bst DNA聚合酶；
[0027] 核酸染料：1000 X SYBR Green I;
[0028] 陽性對照：馬鈴薯卷葉病毒基因組DNA;
[0029] 陰性對照：100mM Tris-HCl(pH 8.0)和50mM EDTA。
[0030] 實施例2馬鈴薯卷葉病毒特異性檢測
[0031] 2 · 1RT-LAMP 特異性檢測
[0032] 待測樣品為采自河北永年蔬菜基地的馬鈴薯葉片，包括經(jīng)ELISA法鑒定已感染 PLRV的6份樣品以及已感染馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯A病毒和黃瓜花葉病毒的各2 份樣品。
[0033] 使用實施例1制備的試劑盒按照以下步驟對上述樣品進(jìn)行檢測：
[0034] 1.利用TRIZOL Reagent提取待測樣品RNA，具體方法如下：
[0035] (1)剪下適量葉片，充分研磨，再加 lml Trizol Reagent充分研磨，室溫放置5min;
[0036] (2)加入氯仿200μ1，充分振蕩15sec，室溫放置2-3min后，12000 Xg，4°C離心 lOmin；
[0037] (3)取上層水相至新管中，加入等體積異丙醇，室溫放置30min，12000 X g，4°C離心 lOmin，棄上清液；
[0038] (4)沉淀用DEPC水配置的75 %乙醇洗滌，7500 X g，4°C離心5min，棄上清液；
[0039] (5)真空干燥RNA沉淀，加入DEPC水40μ1溶解RNA。
[0040] 2.在PCR管中制備25μ1的RT-LAMP反應(yīng)體系，其包括外引物F3 ΙμL、外引物Β3 ΙμL、 內(nèi)引物FIP ΙμL、內(nèi)引物ΒΙΡ ΙμL、反應(yīng)緩沖液2.5yl、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶lyl、Bst DNA聚合酶ΙμL、 模板2μ1，加水補充至25μ1，并以馬鈴薯卷葉病毒基因組DNA作為陽性對照，以100mM Tris-HC1 pH 8.0和50mM EDTA作為陰性對照；
[0041 ] 3. LAMP反應(yīng):將步驟2的PCR管于63°C恒溫反應(yīng)80min，隨后80°C 5min失活；
[0042] 4.結(jié)果判讀:在步驟3的所得反應(yīng)產(chǎn)物中加入ΙμL SYBR Green I，如反應(yīng)液顏色為 橙色，表示結(jié)果為陰性，樣品中不含PLRV;如反應(yīng)液顏色為綠色，表示結(jié)果為陽性，樣品中含 有PLRV〇
[0043] 2.2檢測結(jié)果
[0044] 6份PLRV樣品的PCR管中均呈現(xiàn)綠色，而馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯A病毒 和黃瓜花葉病毒的PCR顯色結(jié)果均為陰性，表明所設(shè)計的4條特異性引物能夠準(zhǔn)確地將PLRV 與其余常見的感染馬鈴薯的病毒區(qū)分開來，具有很強的特異性。
[0045] 實施例3馬鈴薯卷葉病毒靈敏度檢測
[0046] 3 · 1RT-LAMP 靈敏度檢測
[0047] 取實施例2中鑒定結(jié)果為馬鈴薯卷葉病毒陽性的RNA樣品，并以10倍濃度系列稀釋 法稀釋成l〇〇fg-l〇〇ng共7個梯度。
[0048] RT-LAMP反應(yīng)及結(jié)果判讀步驟同實施例2的步驟2-4。
[0049] 3.2檢測結(jié)果
[0050] 除了 DNA濃度為100fg的PCR管顯示橙色之外，其余濃度的PCR管中均呈現(xiàn)綠色，表 明本發(fā)明的檢測方法的最低檢測極限達(dá)到lpg DNA，靈敏度很高。
【主權(quán)項】
1. 一種馬鈴薯卷葉病毒RT-LAMP檢測試劑盒，包括4條特異性引物，所述引物的核苷酸 序列為： 外引物F3:AGGCGCGCTAACAGAGTT(SEQ ID N0:1) 外引物B3:CCCGAAGGTGAAACTTCCTT(SEQ ID NO:2) 內(nèi)引物FIP:GGCGATTGCCTCCTCTTCTACG-GCCAGTGGT TATGGTCACG(SEQ ID N0:3) 內(nèi)引物BIP:AAGAACTGGAGTTCCCCGAGGA-GCCCATGA GGTTGTCCTTTG(SEQ ID N0:4)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其進(jìn)一步包括反應(yīng)緩沖液、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、Bst DNA聚 合酶和核酸染料。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其中所述反應(yīng)緩沖液由2mM dNTP、10 X ThermoPol反 應(yīng)緩沖液、〇. 6mM甜菜堿和6mM Mg2+組成。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其中所述核酸染料為SYBR Green I。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的試劑盒，其進(jìn)一步包括RNA提取試劑以及陽性對照和 陰性對照。6. 使用權(quán)利要求1-5任一項所述的試劑盒對馬鈴薯卷葉病毒進(jìn)行檢測的方法。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種馬鈴薯卷葉病毒RT-LAMP檢測試劑盒，其包括4條特異性引物、反應(yīng)緩沖液、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、Bst？DNA聚合酶和核酸染料。本發(fā)明還涉及馬鈴薯卷葉病毒RT-LAMP檢測方法。使用本發(fā)明的試劑盒及檢測方法能夠準(zhǔn)確地將馬鈴薯卷葉病毒和易侵染馬鈴薯的其他植物病毒區(qū)分開來，具有特異性強、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點。
【IPC分類】C12Q1/70, C12Q1/68, C12R1/94
【公開號】CN105567876
【申請?zhí)枴緾N201610130521
【發(fā)明人】劉杰
【申請人】劉杰
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2016年3月7日