一種含人Rad51C啟動子的載體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種含人Rad51C啟動子的載體及其應(yīng)用，包括Rad51C啟動子序列和編碼具有腫瘤治療作用的效應(yīng)蛋白的核酸序列，Rad51C啟動子序列如SEQ?IDNo：1所示，編碼具有腫瘤治療作用的效應(yīng)蛋白的核酸序列的轉(zhuǎn)錄過程由Rad51C啟動子調(diào)控；本發(fā)明還公開了該核酸序列在治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一種含人Rad51C啟動子的核酸序列，并通過分子克隆的手段將Rad51C啟動子和編碼DTA的開放閱讀框整合構(gòu)成的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染進入細(xì)胞，能夠明顯殺傷腫瘤細(xì)胞，而對正常細(xì)胞基本無影響。
【專利說明】一種含人Rad51C啟動子的載體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種載體及其應(yīng)用，尤其是涉及一種含人Rad51C啟動子的載體及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤治療的目的在于能夠選擇性地殺傷或者清除惡性增殖細(xì)胞而不對正常細(xì)胞造成傷害。在2000年，有文獻(xiàn)報道根據(jù)端粒酶hTER和hTERT在腫瘤細(xì)胞中具有活性而在正常細(xì)胞中沒有活性的特點，利用hTER和hTERT的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列來調(diào)控外源毒性基因在膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)，從而選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞。隨后Christopher等人利用重組酶蛋白Rad51在腫瘤細(xì)胞中的高表達(dá)的 特點，也成功實現(xiàn)了在體內(nèi)體外，轉(zhuǎn)錄水平上靶向抗腫瘤的治療。
[0003]重組酶Rad51是大腸桿菌RecA的同源蛋白質(zhì)，它通過介導(dǎo)DNA鏈配對以及鏈交換而參與DNA的同源重組修復(fù)。在人類中Rad51有5種家族成員XRCC2、XRCC3、Rad51B /Rad51Ll、Rad51C / Rad51L2、Rad51D / Rad51L3，它們對于形成 DNA 損傷誘導(dǎo)的 Rad51foci的組裝是必須的。它們形成兩個復(fù)合體，輔助Rad51進行DNA雙鏈斷裂中的同源重組修復(fù)，并且依賴于BRCA-1和BRCA-2途徑輔助。這一同源同組修復(fù)過程還需要其他的蛋白Rad52，Rad54，Rad55，Rad57，RPA的幫助。因此這些蛋白質(zhì)也有可能具有與Rad51相同的表達(dá)特異性，也存在潛在的靶向抗腫瘤的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種含人Rad51C啟動子的載體及其應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn):
[0006]一種含人Rad51C啟動子的載體，包括Rad51C啟動子序列和編碼具有腫瘤治療作用的效應(yīng)蛋白的核酸序列，所述的Rad51C啟動子序列如SEQ ID No:1所示,與序列相同或者具有90%相似性的序列均為該專利的保護范圍。
[0007]所述的編碼具有腫瘤治療作用的效應(yīng)蛋白的核酸序列的轉(zhuǎn)錄過程由Rad51C啟動子調(diào)控。
[0008]所述的Rad51C啟動子序列為人類的Rad51C蛋白的啟動子序列。
[0009]所述的具有腫瘤治療作用的效應(yīng)蛋白為有毒蛋白。
[0010]所述的有毒蛋白包括白喉毒素蛋白A鏈(DTA)、蓖麻毒蛋白、凋亡家族蛋白caspase3、caspase6、caspase7、caspase8。白喉毒素蛋白 A鏈(DTA)是ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶，能夠抑制真核生物蛋白合成，具有高毒性和廣毒性，可以通過組織特異性表達(dá)殺傷腫瘤細(xì)胞；蓖麻毒蛋白(ricin)是蓖麻種子中的一種毒蛋白，它由分子量分別為32KD和34KD的A、B兩條鏈組成，分別為效應(yīng)鏈和連接鏈，是真核細(xì)胞核糖體失活蛋白，可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成,具有很強的細(xì)胞毒性；凋亡蛋白家族的成員caspase3、caspase6、caspase7、caspase8是能夠引起細(xì)胞程序性死亡的蛋白酶。也可以應(yīng)用于特異性殺傷腫瘤細(xì)胞。[0011 ] 作為優(yōu)選，所述的有毒蛋白為白喉毒素蛋白A鏈。當(dāng)有毒蛋白為白喉毒素蛋白A鏈時，該載體的序列如SEQ ID No:2所示。
[0012]一種含人Rad51C啟動子的載體在治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0013]通過腫瘤細(xì)胞中特異性高表達(dá)的Rad51C的啟動子驅(qū)動有毒蛋白DTA在腫瘤細(xì)胞中的高表達(dá)而針對性地殺傷腫瘤細(xì)胞。DTA的開放式閱讀框序列如SEQ IDNo:3所示。
[0014]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一種含人Rad51C啟動子的核酸序列，并提供了該核酸序列在治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。將Rad51C啟動子和編碼DTA的開放閱讀框整合構(gòu)成的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染進入細(xì)胞，能夠明顯殺傷腫瘤細(xì)胞，而對正常細(xì)胞基本無影響。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1-1為Rad51、Rad51C、Rad51D和Rad52的mRNA在14株細(xì)胞中的表達(dá)水平分析結(jié)果;
[0016]圖1-2為Rad51B、Rad51C、Rad51D和Rad52的mRNA在正常細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞系的表達(dá)水平統(tǒng)計學(xué)差異分析結(jié)果；
[0017]圖2-1 為 Western blot 結(jié)果圖；
[0018]圖2-2為Rad51C蛋白質(zhì)和Actin蛋白質(zhì)的表達(dá)條帶進打量化，并用內(nèi)參進打標(biāo)準(zhǔn)化分析結(jié)果；
[0019]圖2-3為Rad51C在正常細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞系的表達(dá)水平Mann-whitney檢驗分析
結(jié)果;
[0020]圖3-1為pRad5IC-EGFP質(zhì)粒構(gòu)建流程圖；
[0021]圖3-2為pRad5IC-Luc質(zhì)粒構(gòu)建流程圖；
[0022]圖3-3為pRad5IC-DTA質(zhì)粒構(gòu)建流程圖；
[0023]圖4-1 為 pRad5IC-EGFP 質(zhì)粒的圖譜；
[0024]圖4-2為pRad51C_EGFP質(zhì)粒中EGFP在14株細(xì)胞中的表達(dá)情況；
[0025]圖4-3為對正常細(xì)胞組和腫瘤細(xì)胞組中的EGFP的表達(dá)進行差異分析結(jié)果；
[0026]圖4-4為pRad51C_Luc質(zhì)粒的圖譜；
[0027]圖4-5為pRad51C_Luc質(zhì)粒中Luc在14株細(xì)胞中的表達(dá)情況；
[0028]圖4-6為對正常細(xì)胞組和腫瘤細(xì)胞組中的Luc的表達(dá)進行差異分析結(jié)果；
[0029]圖5-1為pRad5IC-DTA質(zhì)粒的圖譜；
[0030]圖5-2為pRad51C_DTA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染以后對細(xì)胞存活率的影響。
【具體實施方式】
[0031]下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明進行詳細(xì)說明。
[0032]實施例
[0033]一、Real-time-PCR(實時定量 PCR)
[0034]通過實時定量PCR的方法比較Rad51的同系物在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況。
[0035]Rad51 的同系物包括 Rad51B、Rad51C、Rad51D、Rad52。
[0036]其中正常細(xì)胞組:WIT和MRT是肺成纖維細(xì)胞，MJT是皮膚成纖維細(xì)胞，HMECUHMEC2、HMEC3、HMEC4是乳腺上皮細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞組=Hela是人類宮頸癌細(xì)胞，GP2-293則是人胚腎細(xì)胞，HT1080是人類纖維肉瘤細(xì)胞，MCF-7、MDA-MB-231、HCC1954、T47D則是人乳腺
上皮癌細(xì)胞。
[0037]實時定量PCR具體方法如下:
[0038]取對數(shù)生長期的細(xì)胞,用Tr1-reagent (sigma)裂解細(xì)胞,按照使用說明提取RNA,用Nanodrop檢測濃度和質(zhì)量,隨后取I μ gRNA,與隨機引物、gDNAremover、反轉(zhuǎn)錄酶及相應(yīng)的buffer (緩沖液)等(北京全式基因，AT311)混合，25°C孵育10分鐘，42°C孵育30分鐘，85°C加熱5分鐘使酶失活，得到cDNA并檢測濃度，稀釋后進行Real time PCR反應(yīng)。針對Rad51B、Rad51C、Rad51D 和 Rad52 設(shè)計引物(見表 I)，Real time PCR 反應(yīng)采用 50ng cDNA與相應(yīng)的引物，與Takara的SYBERGreen試劑盒按照比例相混合，ABI7500系統(tǒng)檢測。每個基因?qū)?yīng)的Ct值都用內(nèi)參基因GAPDH校準(zhǔn)，得到相應(yīng)的表達(dá)量。
[0039]Rad51的同系物在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況如圖1_1與圖1_2所示，圖1-1是Rad51B、Rad51C、Rad51D和Rad52的mRNA在上述14株細(xì)胞中的表達(dá)水平。圖1_2是對Rad51B、Rad51C、Rad51D和Rad52的mRNA在正常細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞系的表達(dá)水平的比較，使用Mann-whitney進行統(tǒng)計學(xué)差異分析。
[0040]由實驗結(jié)果可以看到，Rad51B、Rad51C、Rad51D和Rad52在腫瘤細(xì)胞組中的表達(dá)水平普遍高于正常細(xì)胞組，通過Mann-whitney檢驗,發(fā)現(xiàn)Rad51C的表達(dá)在腫瘤細(xì)胞組上調(diào)明顯，與正常細(xì)胞組相比，統(tǒng)計學(xué)差異極其顯著(p〈0.01)。因而選擇Rad51C為研究目標(biāo)進行
下一步實驗。
[0041]表1Real time-PCR 引物
[0042]
【權(quán)利要求】
1.一種含人Rad5ic啟動子的載體，其特征在于，包括Rad51C啟動子序列和編碼具有腫瘤治療作用的效應(yīng)蛋白的核酸序列，所述的Rad51C啟動子序列如SEQ ID No:1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種含人Rad51C啟動子的載體，其特征在于，所述的編碼具有腫瘤治療作用的效應(yīng)蛋白的核酸序列的轉(zhuǎn)錄過程由Rad51C啟動子調(diào)控。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種含人Rad51C啟動子的載體，其特征在于，所述的Rad51C啟動子序列為人類的Rad51C蛋白的啟動子序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種含人Rad51C啟動子的載體，其特征在于，所述的具有腫瘤治療作用的效應(yīng)蛋白為有毒蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種含人Rad51C啟動子的載體，其特征在于，所述的有毒蛋白包括白喉毒素蛋白A鏈、蓖麻毒蛋白、凋亡家族蛋白caspase3、caspase6、caspase7、caspase8。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種含人Rad51C啟動子的載體，其特征在于，所述的有毒蛋白為白喉毒素蛋白A鏈。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種含人Rad51C啟動子的載體,其特征在于,該載體的序列如 SEQ ID No:2 所示。
8.—種如權(quán)利要求1~7任一所述的含人Rad51C啟動子的載體在治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P35/00GK103952440SQ201310415502
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2013年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月12日
【發(fā)明者】許艷, 曹艷, 毛志勇 申請人:同濟大學(xué)