一種水稻莖葉強表達啟動子safes7及其應用
【專利摘要】本發(fā)明提供一種水稻莖葉強表達啟動子SAFES7及其應用。本發(fā)明從水稻中發(fā)現(xiàn)、分離并鑒定了該啟動子的序列。具體而言，本發(fā)明通過DNA重組技術(shù)，構(gòu)建由該水稻莖葉強表達啟動子SAFES7驅(qū)動GUS報告基因的轉(zhuǎn)化載體，通過模式作物的轉(zhuǎn)化實驗，鑒定了該啟動子的特點是，驅(qū)動目的基因在莖、葉、葉鞘等組織中表達，而在根、胚、胚乳細胞中不表達。對這類啟動子的研究和應用，不僅有助于闡述相關(guān)基因的生物學功能，而且在作物基因工程中使用此類啟動子為作物轉(zhuǎn)基因安全性研究提供了材料基礎(chǔ)和多種選擇。
【專利說明】
-種水稻莖葉強表達啟動子SAFES7及其應用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)和作物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種水稻莖葉強表達啟 動子SAFES7及其應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 啟動子是基因表達調(diào)控的重要順式元件，轉(zhuǎn)錄因子與之結(jié)合從而激活或抑制基因 的轉(zhuǎn)錄，因此啟動子是基因表達所必需的，在很大程度上決定了目的基因的表達模式。利用 特異型啟動子精確控制目的基因產(chǎn)物生成的時間、位置和數(shù)量，對提高目的基因表達的針 對性和時效性非常重要，節(jié)約能量，減少代謝負擔，減少其他性狀的不利影響，也是提高轉(zhuǎn) 基因植物風險防控能力的重要方面。
[0003] 莖在植物生長發(fā)育過程中起著傳輸養(yǎng)料和支撐等作用，葉片則是植物光合作用的 器官，莖葉在固定和能量利用方面起到十分重要的作用。莖葉特異啟動子可W用來分析莖 葉的發(fā)生、分化過程，研究莖葉特異啟動子的調(diào)控機理對于碳同化過程的理解和應用具有 重要的價值，利用其調(diào)節(jié)植物代謝來滿足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需要。莖葉都是植物病蟲害的主要侵 襲部位，利用莖葉特異啟動子，驅(qū)動BT等抗病蟲基因僅在病原菌繁殖或害蟲取食的莖葉部 位表達，不在根和種子等部位表達，不僅可提高目的基因表達產(chǎn)物的量，還可最大限度減輕 對植物其他代謝途徑的不利影響。
[0004] 但是，目前所報道的針對莖葉特異性表達的啟動子并不多見，因此，有必要發(fā)掘出 更多、表達特異性更強的莖葉啟動子，W應用在作物生產(chǎn)中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種驅(qū)動外源基因在水稻莖、葉、葉銷表達的啟動子、獲得含 有該啟動子序列的轉(zhuǎn)化子W及該啟動子的應用。
[0006] 為了實現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供一種水稻莖葉強表達啟動子SAFES7,其特 征在于，所述水稻莖葉強表達啟動子SAFES7包含：
[0007] (a)序列表中SEQ ID NO: 1所示的核巧酸序列;或者 [000引（b)序列表中SEQ ID NO:2所示的核巧酸序列;或者
[0009] (C)在序列表中SEQ ID NO: 1所示的核巧酸序列中添加一個或多個核巧酸后所獲 得的核巧酸序列;或者
[0010] (d)在序列表中SEQ ID N0:2所示的核巧酸序列中添加一個或多個核巧酸后所獲 得的核巧酸序列;或者
[0011] (e)與序列表中SEQ ID N0:1所示的核巧酸序列具有至少90%同源性的核巧酸序 列;或者
[001^ (f)與序列表中SEQ ID N0:2所示的核巧酸序列具有至少90%同源性的核巧酸序 列;或者
[0013] (g)在序列表中SEQ ID NO: 1所示的核巧酸序列中取代一個或多個核巧酸后所獲 得的核巧酸序列;或者
[0014] 化)在序列表中SEQ ID N0:2所示的核巧酸序列中取代一個或多個核巧酸后所獲 得的核巧酸序列;或者
[0015] (i)在序列表中SEQ ID NO: 1所示的核巧酸序列缺失一個或多個核巧酸后所獲得 的核巧酸序列;或者
[0016] (j)在序列表中SEQ ID NO: 2所示的核巧酸序列缺失一個或多個核巧酸后所獲得 的核巧酸序列;或者
[0017] 化)與帶有序列表SEQ ID NO: 1中所示的核巧酸序列的植物雜交后所獲得的相應 產(chǎn)物的對應核巧酸序列;或者
[0018] (1)與帶有序列表SEQ ID N0:2中所示的核巧酸序列的植物雜交后所獲得的相應 產(chǎn)物的對應核巧酸序列。
[0019] 優(yōu)選地，所述水稻莖葉強表達啟動子為序列表中SEQ ID No: 1或2所示的DNA序列。 序列表中SEQ ID No: 1所示的DNA序列為來源于日本晴水稻（Oryza sativa L CV. Nipponbare)的序列，本文中稱為SAFES7或啟動子SAFES7。
[0020] 另一方面，本發(fā)明還提供一種包含上述水稻莖葉強表達啟動子的表達盒。
[0021] 另一方面，本發(fā)明還提供用于擴增所述水稻莖葉強表達啟動子SAFES7的引物序 列，其特征在于，所述引物序列包括第一引物和第二引物，所述第一引物的核巧酸序列如序 列表中SEQ ID NO:3所示，所述第二引物的核巧酸序列如序列表中SEQ ID NO:4所示。
[0022] 又一方面，本發(fā)明還提供一種重組表達載體，所述重組表達載體包含上述的水稻 莖葉強表達啟動子，在所述重組表達載體中，所述水稻莖葉強表達啟動子連接于待表達的 基因序列的上游；優(yōu)選地，所述待表達的基因為Gus基因，所述重組表達載體為 PCAMBIA1391-SAFES7,該重組表達載體為將SEQ ID No:l所示的序列即SAFES7或啟動子 SAFES7構(gòu)建于pCAMBIAl 391中得到的重組表達載體，本文中稱為pCAMBIAl 391-SAFES7。
[0023] 或者待表達基因可W為任何對水稻的莖、葉、葉銷生長特性具有改善能力的基因。 通過本發(fā)明的啟動子驅(qū)動該基因在莖、葉、葉銷特異性地集中表達，從而實現(xiàn)針對性改善作 物莖葉相應性狀的功能，而不會對植物體內(nèi)其他組織或器官帶來任何不利影響。
[0024] 再一方面，本發(fā)明提供上述水稻莖葉強表達啟動子在培育轉(zhuǎn)基因作物中的應用。 所述應用包括將本發(fā)明提供的上述水稻莖葉強表達啟動子連接于載體的待表達的基因序 列上游(例如，將所述啟動子序列置于/插入目標基因之前），從而構(gòu)建重組表達載體，將所 述重組表達載體轉(zhuǎn)化到水稻細胞、組織或器官中進行培育。
[0025] 優(yōu)選地，所述應用可W改良作物生長特性，所述作物為禾谷類作物:水稻、小麥、高 梁、大麥、燕麥、黑麥等;優(yōu)選為水稻。
[00%]優(yōu)選地，所述應用采用下述步驟進行：
[0027] 步驟(1)、根據(jù)序列表中SEQ ID N0:1所示的序列設(shè)計擴增引物；
[0028] 步驟(2)、W水稻品種日本晴的DNA為模板，利用所述引物通過PCR擴增程序擴增水 稻莖葉強表達啟動子SAFES7;
[0029] 步驟(3)、回收PCR擴增的目的片段，并將其連接到PGEM-T-Easy載體上；
[0030] 步驟(4)、利用連接產(chǎn)物按照熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-Blue感受態(tài)細胞；
[0031] 步驟(5)、對轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進行PCR篩選，獲得陽性克隆，挑取單克隆搖菌液提質(zhì)粒，用 相應限制性內(nèi)切酶進行雙酶切；
[0032] 步驟(6)、將經(jīng)過酶切后的陽性克隆進行測序，獲取測序正確的核巧酸序列；
[0033] 步驟(7)、準備包含待表達基因的載體并對其進行線性化處理，并且將步驟(6)中 測序正確的核巧酸序列與所述載體進行連接獲得相應作物表達載體，在所述連接產(chǎn)物中， 所述水稻莖葉強表達啟動子SAFES7與所述待表達基因直接相連；
[0034] 步驟(8)、將所述作物表達載體轉(zhuǎn)入根瘤農(nóng)桿菌中；
[0035] 步驟(9)、利用所獲得的轉(zhuǎn)入了所述作物表達載體的根瘤農(nóng)桿菌對成熟水稻種子 進行農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化，進而將所述作物表達載體轉(zhuǎn)入所述成熟水稻種子中；
[0036] 步驟(10)、將經(jīng)處理后的種子培育成相應植株。
[0037] 具體而言，本申請的發(fā)明人從日本晴水稻（Oirza sativa L CV.化卵onbare)分離 克隆得到了序列表中SEQ ID No:l所示的DNA序列，發(fā)明人將該序列經(jīng)酶切后連接到作物雙 元表達載體PCAMBIA1391上，獲得啟動子SAFES7與Gus基因融合的作物表達載體 PCAMBIA1391-SAFES7,利用該重組表達載體轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌菌株EHA105,然后用農(nóng)桿菌介 導的方法進行水稻的轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)基因水稻植株。對獲得的轉(zhuǎn)基因水稻進行組織化學檢測 發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株僅在莖、葉、葉銷等組織中具有較強活性的GUS表達，而在根、胚、胚乳細胞 中不表達。從而證明該1994bp的序列具有驅(qū)動基因特異的在水稻莖、葉、葉銷強表達的作 用。
[00測需要說明的是：本發(fā)明序列表SEQ ID N0:1序列開頭的"ctgctggatc tcccacacgc tc"為獲得啟動子過程中使用的正向引物的留存序列，共計22bp;序列末尾的"cgagtagcca tggatgccct Ct"為獲得啟動子過程中使用的反向引物的留存序列（該留存序列與反向引物 的相應序列互補），共計22bp;該DNA序列中剩余的部分則為獲自日本晴水稻中的DNA序列， 即序列表SEQ ID N0:2中所示序列。需要強調(diào)的是，本文中所提到的啟動子既可W指SEQ ID N0:1中的序列，也可W指SEQ ID N0:2中的序列。換言之，雖然本發(fā)明中采用序列表SEQ ID N0:3和4中的引物獲得了該序列，但是即便本領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明的基礎(chǔ)上，采用其他引 物獲得了本發(fā)明的核屯、序列，其也落入本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0039] 技術(shù)效果
[0040] 本發(fā)明所克隆的水稻啟動子SAFES7能夠調(diào)控基因在水稻莖葉部位集中表達，在實 際應用中具有重要價值。本發(fā)明的莖葉特異啟動子可W用來分析莖葉的發(fā)生、分化過程，研 究莖葉特異啟動子的調(diào)控機理對于碳同化過程的理解和應用具有重要的價值，利用其調(diào)節(jié) 植物代謝來滿足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需要。
[0041] 本發(fā)明的水稻莖葉強表達啟動子SAFES7僅驅(qū)動外源基因在轉(zhuǎn)基因水稻的莖、葉、 葉銷中表達，不會在食用部位一一種子中表達。在作物基因工程中，利用該啟動子代替組成 型啟動子對農(nóng)作物的莖葉進行基因改造，使目的基因只在莖葉表達，不在食用部位稻米中 表達，有助于消除消費者對轉(zhuǎn)基因水稻食用安全性的顧慮。
[0042] 在作物基因工程中應用本發(fā)明的莖葉特異表達啟動子，獲得抗病、抗蟲能力W及 對環(huán)境耐受性提高的改良水稻，提高水稻的產(chǎn)量，具有重要的應用價值。莖葉都是植物病蟲 害的主要侵襲部位，利用莖葉特異啟動子，驅(qū)動BT等抗病蟲基因僅在病原菌繁殖或害蟲取 食的莖葉部位表達，不在根和種子等部位表達，不僅可提高目的基因表達產(chǎn)物的量，還可最 大限度減輕對植物其他代謝途徑的不利影響。
【附圖說明】
[0043] W下，結(jié)合附圖來詳細說明本發(fā)明的實施方案，其中：
[0044] 圖1為將SAFES7啟動子構(gòu)建于PCAMBIA1391載體質(zhì)粒中的示意圖，其中圖1中A為 PCAMBIA1391示意圖，B為PCAMBIA1391-SAFES7示意圖，其中示出了利用SAFES7啟動子驅(qū)動 位于其下游的Gus基因表達；
[0045] 圖2為對本發(fā)明的啟動子進行酶切驗證的結(jié)果示意圖。
[0046] 圖3為本發(fā)明實施例所獲得植株的根(a)、莖(b)、葉銷(C)、葉(d)、種子(e)的GUS染 色結(jié)果，圖中標尺=2.5mm。圖中可W看出，SAFES7啟動子在莖、葉、葉銷等組織中具有較強 活性，而在根、胚、胚乳細胞中不表達。
【具體實施方式】
[0047] W下參照具體的實施例來說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，運些實施例僅 用于說明本發(fā)明，其不W任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0048] 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的生 化試劑，載體耗材等，如無特殊說明，均為市售購買產(chǎn)品。下述實施例中試劑、培養(yǎng)基配制， 如無特殊說明，均參照《分子克隆實驗指南》(第=版）。
[0049] 1植物材料
[00加]日本晴（Oryza sativa L ^.化卵〇116日的）成熟種子，由安徽省農(nóng)科院水稻所生物 技術(shù)室保存。
[0051 ] 2菌株及質(zhì)粒
[0052] 本發(fā)明所用大腸桿菌菌株為化-blue;根瘤農(nóng)桿菌為EHA105,由安徽省農(nóng)科院水稻 所生物技術(shù)室保存。作物雙元表達載體pCAMBIAl 391購自澳大利亞GAMBIA公司。
[0053] 實施例1啟動子SAFES7的獲得
[0054] 步驟1、引物的設(shè)計
[0055] 根據(jù)NCBI中提供的水稻品種日本晴全基因組序列，并根據(jù)選用的載體及祀標基因 的特點，設(shè)計擴增引物，并在引物兩端分別添加限制性內(nèi)切酶化ndin和EcoRI識別位點及 保護堿基。
[0056] 本實施例中W水稻雙元表達載體PCAMBIA1391為例，祀標基因為Gus基因，設(shè)計的 引物如下（SEQ ID No:3-4):
[0057] SAFESTHindIII FP：AAGCTTCTGCTGGATCTCCCACACGCTC [005引 SAFESTEcoRI RP：GAATTCAGAGGGCATCCATGGCTACTCG
[0059] 其中AAGCTT為限制性內(nèi)切酶化ndn I的識別位點及保護堿基；
[0060] GAATTC為限制性內(nèi)切酶EcoRI的識別位點及保護堿基。
[0061] 引物由深圳華大基因公司合成。
[0062] 步驟2、啟動子SAFES7的獲得
[0063] W水稻品種日本晴的基因組DNA為模板，利用擴增引物擴增啟動子SAFES7,按常規(guī) PCR體系，采用如下擴增程序：
[0064] 95 °C 預變性 5min; 95 °C 變性 30s，58 °C 退火 30s，72 °C 延伸 2min30s，35 個循環(huán);最后 72°C 延伸 lOmin。
[0065] 回收PCR擴增的目的片段，將其連接到PGEM-T-Easy載體（購自Promega公司，按載 體說明書中的比例混合)上，按照熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌化-Blue感受態(tài)細胞后，經(jīng)菌落PCR篩 選獲得陽性克隆，挑取單克隆搖菌液提質(zhì)粒，用化ndin和EcoRI進行雙酶切驗證，目的片段 長度1994bp，如圖2所示。將經(jīng)過鑒定的陽性克隆送交Invi化Ogen公司測序。驗證正確的克 隆即為所要獲得的啟動子SAFES7,其核酸序列如SEQ ID No: 1所示。
[0066] 實施例2啟動子SAFES7的功能驗證
[0067] -、重組表達載體的構(gòu)建和農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化
[0068] 從實施例1中獲得的陽性克隆中提取質(zhì)粒，用化ndn I和EcoRI雙酶切，回收啟動子 SAFES7片段。同時利用HindIII和EcoRI對PCAMBIA1391進行線性化處理、回收PCAMBIA1391， 將上述的SA陽S7片段和PCAMBIA1391片段用T4DNA連接酶(購于化KaRa公司）進行連接，得到 啟動子SAFES7與Gus基因融合的作物表達載體pCAMBIA1391-SAFES7(圖1B)，利用凍融法將 作物表達載體轉(zhuǎn)入根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacteri皿t皿efaciens化HA105。
[0069] 二、農(nóng)桿菌介導的水稻遺傳轉(zhuǎn)化
[0070] 將成熟水稻種子去掉穎殼后，用70%酒精浸泡種子Imin,倒掉酒精。用含有1滴 Tween 20的50%次氯酸鋼(原液有效氯濃度大于4% )溶液浸泡種子40min(15化/min)。倒掉 次氯酸鋼，無菌水洗5遍至溶液澄清，無次氯酸鋼味道。無菌水浸泡種子過夜。用解剖刀沿種 子的糊粉層將胚剝下，將胚接種于愈傷誘導培養(yǎng)基上。3(TC下暗培養(yǎng)11天后將愈傷組織與 胚乳及胚芽分離，將去芽的狀態(tài)良好、分裂旺盛的初級愈傷組織進行預培養(yǎng)3~5天后用于 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。
[0071] 采用上述"重組表達載體的構(gòu)建和農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化"過程中轉(zhuǎn)入了重組表達載體的 根瘤農(nóng)桿菌進行農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化，該遺傳轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化子篩選及轉(zhuǎn)基因植株再生等參 照 Yongbo Duan(Yongt)O Duan，Chenguang Zhai，et al.An efficient and high-throughput protocol for Agrobacterium mediated transformation based on phosphomannose isomer曰se positive selection in Japonic曰 rice(0ryz曰 s曰tiv曰 L.) [J].Plant Cell Report，2012.D0I 10.1007/s00299-012-1275-3.)等提出的方法。
[0072] S、GUS組織化學染色
[0073] 參照Jefferson(Jefferson RA等人.GUS fusion:0-Glucu;ronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plant[J].EMBO J.,1987,6: 3901-3907)等提出的方法，將需要染色的組織浸入染色液中，37 °C染色24小時。脫色時在37 °(：條件下用無水乙醇處理，至葉綠素完全脫掉。結(jié)果見圖3,根(a)、莖(b)、葉銷(C)、葉（d)、 種子（e)中GUS染色。藍色為GUS組織化學染色，代表組織中有GUS表達。從圖中可W看出， SAFES7啟動子在莖、葉、葉銷等組織中具有較強活性，而在根、胚、胚乳細胞中不表達。GUS組 織化學染色結(jié)果表明啟動子SAFES7是水稻莖葉強表達啟動子。
[0074] 實施例2
[0075] 在本實施例中，為了驗證序列表SEQ ID N0:2中的序列與序列表SEQ ID NO: 1中的 序列具有同樣的功能，本申請的發(fā)明人采用與實施例1類似的方式，更換了引物，進行了類 似的實驗。
[0076] 具體而言，發(fā)明人根據(jù)NCBI中提供的水稻品種日本晴全基因組序列，重新選用載 體，并根據(jù)選用的載體及祀標基因的特點，重新設(shè)計引物，對SEQ ID N0:2中的序列進行擴 增。然后，將擴增產(chǎn)物利用T4連接酶與新的載體相連，并且進行了表達量測試。
[0077] 測試結(jié)果表明，SEQ ID N0:2中的序列與序列表SEQ ID NO: 1中的序列具有同樣的 功能。由于方法與實施例1類似，具體過程運里不再累述。
[0078] W上對本發(fā)明【具體實施方式】的描述并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可W根據(jù)本 發(fā)明作出各種改變或變形，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的范 圍。
【主權(quán)項】
1. 一種水稻莖葉強表達啟動子SAFES7,其特征在于，所述水稻莖葉強表達啟動子 SAFES7 包含： (a) 序列表中SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列;或者 (b) 序列表中SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列;或者 (c) 在序列表中SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列中添加一個或多個核苷酸后所獲得的 核苷酸序列;或者 (d) 在序列表中SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列中添加一個或多個核苷酸后所獲得的 核苷酸序列;或者 (e) 與序列表中SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列具有至少90%同源性的核苷酸序列；或 者 (f) 與序列表中SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列具有至少90%同源性的核苷酸序列；或 者 (g) 在序列表中SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列中取代一個或多個核苷酸后所獲得的 核苷酸序列;或者 (h) 在序列表中SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列中取代一個或多個核苷酸后所獲得的 核苷酸序列;或者 (i) 在序列表中SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列缺失一個或多個核苷酸后所獲得的核 苷酸序列;或者 (j) 在序列表中SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列缺失一個或多個核苷酸后所獲得的核 苷酸序列;或者 (k) 與帶有序列表SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列的植物雜交后所獲得的相應產(chǎn)物 的對應核苷酸序列;或者 (l) 與帶有序列表SEQ ID N0:2中所示的核苷酸序列的植物雜交后所獲得的相應產(chǎn)物 的對應核苷酸序列。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻莖葉強表達啟動子SAFES7，其特征在于，所述水稻莖葉強 表達啟動子SAFES7由序列表SEQ ID N〇:l或2所示的DNA序列構(gòu)成。3. -種表達盒，其特征在于，所述表達盒包含權(quán)利要求1所述的水稻莖葉強表達啟動子 SAFES7〇4. 用于擴增權(quán)利要求1中所述的水稻莖葉強表達啟動子SAFES7的引物序列，其特征在 于，所述引物序列包括第一引物和第二引物，所述第一引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，所述第二引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:4所示。5. -種重組表達載體，其特征在于，所述重組表達載體包含權(quán)利要求1所述的水稻莖葉 強表達啟動子，在所述重組表達載體中，所述水稻莖葉強表達啟動子SAFES7連接于載體中 待表達的基因序列的上游。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組表達載體，其特征在于，所述待表達的基因為Gus基因，所 述重組表達載體為PCAMBIA1391-SAFES7,其中pCAMBIA1391為作物雙元表達載體;或者所述 待表達的基因是具有改善莖葉生長性能的基因。7. -種根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻莖葉強表達啟動子SAFES7在培育轉(zhuǎn)基因水稻中的應 用，其特征在于，所述應用包括:將權(quán)利要求1所述的水稻莖葉強表達啟動子連接于載體中 待表達的基因序列上游，從而構(gòu)建重組表達載體;將所述重組表達載體轉(zhuǎn)化到水稻細胞、組 織或器官中進行培育，進而獲得相應轉(zhuǎn)基因植株。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應用，其特征在于，所述應用用于改良作物生長特性，所述作 物為禾谷類作物:水稻、小麥、高粱、大麥、燕麥、黑麥等。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應用，其特征在于，所述待表達的基因為改善植物生長性能的 結(jié)構(gòu)基因、調(diào)芐基因或者結(jié)構(gòu)基因的反義基因。10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應用，其特征在于，所述應用采用下述步驟進行： 步驟（1)、根據(jù)序列表中SEQ ID ΝΟ:1所示的序列設(shè)計擴增引物； 步驟(2)、以水稻品種日本晴的DNA為模板，利用所述引物通過PCR擴增程序擴增水稻莖 葉強表達啟動子SAFES7; 步驟(3)、回收PCR擴增的目的片段，并將其連接到PGEM-T-Easy載體上； 步驟(4)、利用連接產(chǎn)物按照熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-Blue感受態(tài)細胞； 步驟(5)、對轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進行PCR篩選，獲得陽性克隆，從中挑取單克隆搖菌液提質(zhì)粒，用 相應限制性內(nèi)切酶進行雙酶切； 步驟(6)、將經(jīng)過酶切后的陽性克隆進行測序，獲取測序結(jié)果與SEQ ID NO: 1所示的序 列吻合的核苷酸序列； 步驟(7)、準備包含待表達基因的載體并對其進行線性化處理，并且將步驟(6)中測序 正確的核苷酸序列與所述載體進行連接獲得相應作物表達載體，在所述作物表達載體中， 所述水稻莖葉強表達啟動子SAFES7與所述待表達基因彼此相連； 步驟(8 )、將所述作物表達載體轉(zhuǎn)入根瘤農(nóng)桿菌中； 步驟(9)、利用所獲得的轉(zhuǎn)入了所述作物表達載體的根瘤農(nóng)桿菌對成熟水稻種子進行 農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化，進而將所述作物表達載體轉(zhuǎn)入所述成熟水稻種子中； 步驟(10)、將經(jīng)處理后的種子培育成相應植株。
【文檔編號】C12N15/113GK105838718SQ201610396789
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月31日
【發(fā)明人】李娟 , 楊劍波, 李 浩, 李莉, 楊亞春, 魏鵬程, 秦瑞英, 許蓉芳
【申請人】安徽省農(nóng)業(yè)科學院水稻研究所