本發(fā)明屬于生物學領(lǐng)域，尤其涉及一種具有家蠶血細胞特異活性的啟動子的鑒定方法。

背景技術(shù)：

家蠶是一種重要經(jīng)濟昆蟲，具有極高的經(jīng)濟價值，對提高人類生存質(zhì)量做出了積極的貢獻。在上下五千年的悠久文明歷史中，絲綢之路和絲綢文化是一塊絢麗的文化瑰寶，也是中國古老文明的象征。時至今日，在當前農(nóng)村經(jīng)濟中，蠶絲產(chǎn)業(yè)仍然是部分農(nóng)村地區(qū)的支柱產(chǎn)業(yè)之一。蠶病一直是嚴重影響蠶絲產(chǎn)業(yè)的重要因素，每年因蠶病帶來的經(jīng)濟損失約占整個產(chǎn)業(yè)的20％，而且沒有有效的預(yù)防措施。因此，研究家蠶免疫防御機制，解析宿主對病原菌的免疫應(yīng)答反應(yīng)，最終能夠有效防御蠶病的發(fā)生是蠶桑研究人員重要的工作內(nèi)容之一。昆蟲屬開放式循環(huán)系統(tǒng)，整個體腔都浸浴在血淋巴中，血淋巴起著運輸養(yǎng)料、激素和代謝廢物，維持正常生理所需的血壓、滲透壓和離子平衡，參與中間代謝，清除解離的組織碎片，修補傷口，對侵染物產(chǎn)生免疫反應(yīng)和調(diào)節(jié)體溫等諸多功能。在血淋巴中，血細胞是細胞免疫應(yīng)答反應(yīng)的主要執(zhí)行者，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。根據(jù)形態(tài)，昆蟲主要包含五種血細胞類型：原血細胞、顆粒細胞、漿細胞、擬絳色細胞和小球細胞，它們在免疫反應(yīng)中有著不同的角色分工，共同協(xié)助昆蟲應(yīng)對來自體內(nèi)外的各種挑戰(zhàn)。作為一種重要的鱗翅目模式，隨著基因組三部曲的順利完成，轉(zhuǎn)基因和基因編輯技術(shù)的建立與完善，家蠶成為變態(tài)與發(fā)育研究的重要材料之一。家蠶飼養(yǎng)方便，血細胞含量豐富，與果蠅相比具有更好的操作性，是造血及血細胞功能研究的重要介質(zhì)之一。更為重要的是，鱗翅目昆蟲約占據(jù)農(nóng)林害蟲的70％，研究家蠶造血與其調(diào)控機制，探究血細胞的功能，也可以為鱗翅目病蟲害的防治提供新的策略。

綜上所述，現(xiàn)有技術(shù)存在的問題是：家蠶免疫防御機制差，蠶病發(fā)病率高，嚴重影響蠶絲產(chǎn)業(yè)，每年因蠶病帶來的經(jīng)濟損失約占整個產(chǎn)業(yè)的20％，而且沒有有效的預(yù)防措施。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了一種具有家蠶血細胞特異性活性的啟動子的鑒定方法，

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種具有家蠶血細胞特異性活性的啟動子的鑒定方法，所述具有家蠶血細胞特異性活性的啟動子的鑒定方法包括以下步驟：

步驟一，篩選家蠶五齡三天各組織表達芯片數(shù)據(jù)庫，活動血細胞特異高表達候選基因；

步驟二，利用分子生物學手段對相關(guān)候選基因進行克隆，活動其全長cds序列；

步驟三，利用實時熒光定量pcr和westernblot等技術(shù)對候選基因在家蠶各組織中的表達情況進行詳細的調(diào)查，最終確認bgibmga006002和bgibmga006150的表達具有很高的血細胞特異性；

步驟四，利用pcr技術(shù)克隆bgibmga006002和bgibmga006150啟動子序列，構(gòu)建至acnpv病毒表達系統(tǒng)后感染家蠶，初步檢測各候選啟動子在各組織中的活性，證實bgibmga006002和bgibmga006150啟動子具有較高的血細胞特異性；

步驟五，將bgibmga006002和bgibmga006150啟動子構(gòu)建至轉(zhuǎn)基因載體，經(jīng)轉(zhuǎn)基因注射和陽性個體篩選獲得轉(zhuǎn)基因陽性個體，利用westernblot和實時熒光定量pcr技術(shù)對這兩個啟動子的體內(nèi)活性進行檢測。

進一步，所述兩個漿細胞特異性的啟動子的序列為：seqidno：1和seqidno：2。

本發(fā)明的優(yōu)點及積極效果為：成功獲得兩個血細胞特異性啟動子，利用轉(zhuǎn)基因操作進行進一步研究，最終確定為兩個家蠶循環(huán)血細胞中的漿細胞特異性啟動子；因此可以利用本發(fā)明公開的方法尋找這一類的特異性啟動子，探尋和研究家蠶血液免疫系統(tǒng)中病原模式識別與抗病形成的分子機制；此外，也可以利用鑒定得到的家蠶循環(huán)血細胞中的漿細胞特異性啟動子，對家蠶進行遺傳改良，探尋和研究家蠶血液免疫系統(tǒng)中病原模式識別與抗病形成的分子機制，并構(gòu)建轉(zhuǎn)基因載體和發(fā)展家蠶轉(zhuǎn)基因體系，利用這些穩(wěn)定遺傳的品系進行家蠶抗病品系的育種和培育，進而縮短家蠶抗病育種的年限，提高家蠶品系的抗病能力，進而挽救每年因蠶病給產(chǎn)業(yè)帶來的行業(yè)經(jīng)濟損失。

本發(fā)明獲得兩個家蠶循環(huán)血細胞中的漿細胞特異性啟動子，使轉(zhuǎn)基因體系的不斷完善，從而加強家蠶免疫防御機制，降低蠶病發(fā)病率。漿細胞特異表達綠色熒光蛋白，這對昆蟲血細胞發(fā)育及免疫功能研究提供了便利的工具；利用漿細胞特異性啟動子驅(qū)動感興趣的基因特異性表達于漿細胞，這造血調(diào)控及基因功能研究具有重要的價值。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施提供的具有家蠶血細胞特異性活性的啟動子的鑒定方法流程圖。

圖2是本發(fā)明實施例提供的啟動子克隆和轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建策略示意圖；

圖中：a，家蠶bgibmga006002和bgibmga006150啟動子克隆；b，轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建示意圖，sp：信號肽，flag：3×flag標簽，tm：跨膜結(jié)構(gòu)域，serpa：sericin1基因的3’非編碼區(qū)。

圖3是本發(fā)明實施例提供的啟動子活性報告基因egfp在各組織中的表達分析圖。

圖中：a和b，利用熒光定量pcr檢測egfp在兩種轉(zhuǎn)基因個體各組織中的表達情況，其中以家蠶gapdh基因為內(nèi)參；c和d，利用westernblot檢測egfp在兩種轉(zhuǎn)基因個體部分組織中的表達情況。ep-體壁，he-頭部，fa-脂肪體，mi-中腸，ma-馬氏管，si-絲腺，te-精巢，ov-精巢，ha-血細胞，wi-翅原基。

圖4是本發(fā)明實施例提供的報告基因egfp在五齡3天的轉(zhuǎn)基因家蠶的血細胞中的表達情況。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的應(yīng)用原理作詳細的描述。

如圖1所示，本發(fā)明實施例提供的具有家蠶血細胞特異性活性的啟動子的鑒定方法包括以下步驟：

s101：篩選家蠶五齡三天各組織表達芯片數(shù)據(jù)庫，活動血細胞特異高表達候選基因；

s102：利用分子生物學手段對相關(guān)候選基因進行克隆，活動其全長cds序列；

s103：利用實時熒光定量pcr和westernblot等技術(shù)對候選基因在家蠶各組織中的表達情況進行詳細的調(diào)查，最終確認bgibmga006002和bgibmga006150的表達具有很高的血細胞特異性；

s104：利用pcr技術(shù)克隆bgibmga006002和bgibmga006150啟動子序列，構(gòu)建至acnpv病毒表達系統(tǒng)后感染家蠶，初步檢測各候選啟動子在各組織中的活性，證實bgibmga006002和bgibmga006150啟動子具有較高的血細胞特異性；

s105：將bgibmga006002和bgibmga006150啟動子構(gòu)建至轉(zhuǎn)基因載體，經(jīng)轉(zhuǎn)基因注射和陽性個體篩選獲得轉(zhuǎn)基因陽性個體，利用westernblot和實時熒光定量pcr技術(shù)對這兩個啟動子的體內(nèi)活性進行檢測。

下面結(jié)合實驗對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進一步的描述。

步驟1：實驗材料

步驟2：數(shù)據(jù)庫、軟件和在線工具

家蠶組織表達芯片數(shù)據(jù)庫：http://www.silkdb.org/microarray/

中國家蠶基因組數(shù)據(jù)庫silkdb：http://silkworm.genomics.org.cn/

日本家蠶基因組數(shù)據(jù)庫sgp：http://sgp.dna.affrc.go.jp/index.html

美國國家生物技術(shù)信息中心ncbi：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/

結(jié)構(gòu)域預(yù)測在線工具smart：http://smart.embl-heidelberg.de/

基因結(jié)構(gòu)分析工具splign：

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/splign/splign.cgi？textpage＝online&level＝form

引物設(shè)計軟件：primer5.0

步驟3：實驗儀器(如表1)

表1

步驟4：實驗試劑(如表2)

表2

步驟5：主要溶液及配制

(1)50×tae：稱取trisbase242g，na2edta·2h2o37.2g，量取57.1ml冰醋酸，加入800mlddh2o，充分攪拌溶解后，定容至1l，室溫保存。

(2)1％瓊脂糖凝膠：取一個干凈的三角錐形瓶，加入1g瓊脂糖和2ml50×tae溶液后，加水定容至100ml。用微波爐加熱至瓊脂糖全部融化。

步驟6：實驗方法

1：家蠶血細胞特異基因的篩選與鑒定

(1)檢索家蠶芯片數(shù)據(jù)庫，對血細胞特異表達探針進行分析，下載其序列。

(2)將探針序列作為質(zhì)詢序列，在家蠶基因組數(shù)據(jù)庫silkdb和sgp，以及ncbi中檢索相關(guān)基因，獲得其核酸序列。

(3)利用primer5.0軟件設(shè)計相關(guān)引物(引物序列見表3)，所有引物均由華大基因合成。然后以家蠶血細胞cdna為模板，進行pcr擴增；

表3

(4)將pcr擴增產(chǎn)物經(jīng)切膠回收后連接至pmd19-t載體，挑取陽性克隆送至華大測序，對測序結(jié)果進行分析比對，并設(shè)計定量引物；

(5)利用實時熒光定量pcr技術(shù)檢測候選基因在家蠶五齡三天各組織中的表達情況，篩選出血細胞特異表達基因。

2：家蠶血細胞5’race模板的制備

(1)rna提取

a、將2ml無rna酶離心管置于冰上，加入10μl苯基硫脲溶液和400μl1×pbs后，用新的1ml一次性針頭刺破五齡三天家蠶幼蟲足部，快速收集血液；

b、血液樣品3000rpm,4℃離心5分鐘后，棄上層液體后加入1mlrnaiso，激烈震蕩至沉淀完全裂解；

c、冰上靜置10分鐘后，12000rpm,4℃離心10分鐘；

d、將上清液轉(zhuǎn)移至新的無rna酶離心管中，加入300μl預(yù)冷氯仿后，激烈搖晃15秒，使氯仿相和水相充分混合；

e、冰上靜置15分鐘后，12000rpm，4℃離心10分鐘；

f、將上清液轉(zhuǎn)移至新的無rna酶離心管中，加入300μl預(yù)冷氯仿后，激烈搖晃15秒，使氯仿相和水相充分混合；

g、冰上靜置15分鐘后，12000rpm,4℃離心10分鐘；

h、將上清液轉(zhuǎn)移至新的無rna酶離心管中，加入800μl預(yù)冷異丙醇，輕柔搖晃，使異丙醇與水充分混勻；

i、將樣品在冰上靜置10分鐘后，12000rpm,4℃離心10分鐘；

j、棄上清液，加入1ml預(yù)冷75％乙醇，輕柔重懸沉淀；

k、12000rpm,4℃離心5分鐘，棄上清液，待沉淀風干后加入50μl無核酸酶水；

i、用1％的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測rna純度與濃度。

(2)rna的去磷化

a、在冰上配制反應(yīng)體系：rna，2μg；10×cipbuffer，1μl；rnaseout^tm(40u/μl)，1μl；cip(10u/μl)，1μl；無核酸酶水，補至10μl，將所有組分混勻后瞬時離心，50℃水浴1h；

b、將液體移至一個新的預(yù)冷離心管中，加入90μl無核酸酶水并混勻；

c、加入100μl酚氯仿等比混合液，振蕩混勻，在室溫條件下以離心機最高轉(zhuǎn)速離心5分鐘；

d、將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入2μlmusselglycogen和10μl3m醋酸鈉溶液，輕柔混合均勻；

e、加入220μl95％乙醇，混合均勻后，冰上靜置10分鐘；

f、4℃，最大轉(zhuǎn)速離心20分鐘，；

g、棄上清，將rna樣品風干后加入7μl無核酸酶重懸。

(3)rna去帽子結(jié)構(gòu)

a、在冰上配制反應(yīng)體系：10×tapbuffer，1μl；rnaseout^tm(40u/μl)，1μl；tap(0.5u/μl)，1μl；去磷酸化na，7μl；

b、將所有組分混勻后瞬時離心，37℃水浴1h。參照rna的去磷酸化步驟中的方法對rna進行純化，最終產(chǎn)物溶于7μl無核酸酶水。

(4)rnaoligo連接

a、將7μl去帽子結(jié)構(gòu)的rna樣品加入race試劑盒的rnaoligo離心管中，輕輕彈勻，溶解管內(nèi)粉末，然后瞬時離心；

b、pcr儀中65℃處理5分鐘，以去除rna二級結(jié)構(gòu)，隨后迅速將樣品轉(zhuǎn)移至冰上，靜置2分鐘后瞬時離心；

c、在離心管中混合一下反應(yīng)體系：10×ligasebuffer，1μl；10mmatp，1μl；rnaseout^tm(40u/μl)，1μl；t4rnaligase(5u/μl)，1μl。將反應(yīng)體系混勻，瞬時離心后37℃處理1小時。參照rna的去磷酸化步驟中的方法對rna進行純化，最終產(chǎn)物溶于10μl無核酸酶水。

(5)反轉(zhuǎn)錄

a、在冰上配制反應(yīng)體系：generacer^tmoligodtprimer，1μl；dntpmix，1μl；無核酸酶水，1μl；rna，10μl。

b、65℃，5分鐘，去除rna二級結(jié)構(gòu)，冰上放置2min后，瞬時離心；

c、加入預(yù)先配置好的反應(yīng)體系：5×firststrandbuffer，4μl；0.1mdtt，1μl；rnaseout^tm(40u/μl)，1μl；superscript^tmiiirt(200u/μl)，1μl；d、混勻，瞬時離心后，50℃處理60分鐘；

e、70℃處理15分鐘使酶失活，冰上靜置兩分鐘，瞬時離心；

f、加入1μlrnaseh(2u)后混勻，37℃處理20分鐘；

g、瞬時離心，樣品保存于-30℃?zhèn)溆谩?/p>

s603：家蠶血細胞特異基因5’race擴增

(1)5’race擴增

a、根據(jù)測序結(jié)果，利用primer5.0軟件設(shè)計5’race基因特異性引物；

b、配制第一輪pcr擴增反應(yīng)體系，其反應(yīng)體系為racecdna模板，1μl；generacer^tm5’primer，3μl；gsp1，1μl；10×pcrbuffer(含mg²⁺)，5μl；dntp(10mmeach)，1μl；hifitaq酶，0.5μl，最后用ddh2o補充至50μl。體系混合均勻并瞬時離心后，放入pcr儀，擴增程序為：94℃預(yù)變性2min，5個循環(huán)的94℃變性30s，72℃延伸2min；5個循環(huán)的94℃變性30s，70℃延伸2min；20-25個循環(huán)的94℃變性30s，65℃退火30，68℃延伸2mins；最后72℃處理10min，最終產(chǎn)物短時間保存于12℃。c、以第一輪pcr擴增產(chǎn)物為模板，配制第二輪pcr擴增反應(yīng)體系，具體配方為第一輪pcr產(chǎn)物，1μl；generacer^tm5’nestedprimer，3μl；ngsp1，1μl；10×pcrbuffer(含mg²⁺)，5μl；dntp(10mmeach)，1μl；hifitaq酶，0.5μl，最后用ddh2o補充至50μl。體系混合均勻并瞬時離心后，放入pcr儀進行擴增，其反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2min，25-30個循環(huán)的94℃變性30s，65℃退火30，68℃延伸2min。最后72℃處理10min，最終產(chǎn)物短時間保存于12℃。

(2)產(chǎn)物檢測、回收與連接

a、使用膠回收試劑盒對第二輪pcr擴增產(chǎn)物進行切膠回收，并用1％的瓊脂糖凝膠對回收產(chǎn)物進行檢測；

b、取4μl回收產(chǎn)物，加入1μlpmd19-tvector和5μlsolutionii，混合均勻瞬時離心后，室溫連接16-24小時；

c、從-80℃冰箱取出感受態(tài)細胞，用手握著使其快速融化后，迅速置于冰上，并加入連接產(chǎn)物；

d、冰上靜置30分鐘，42℃水浴熱激60-90秒后，迅速置于冰上，靜置2分鐘；e、加入400μl無抗lb培養(yǎng)基，37℃，220rpm于震蕩搖晃1小時；

f、取出適量菌液，均勻涂布于含氨芐抗生素的lb固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過夜。

(3)陽性克隆的篩選、驗證與測序

a、在超菌工作臺中用白色槍頭挑取單落，接種于含氨芐抗生素的lb液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫震蕩搖晃培養(yǎng)4-6小時。取出擴大培養(yǎng)后的陽性斑，以m13f和m13r為引物，進行菌液pcr擴增；

b、取5μl菌液pcr擴增產(chǎn)物，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，挑出陽性克隆，送至華大測序；

c、利用bioedit軟件對所有測序結(jié)果進行分析，對每個基因序列進行拼接。

4：啟動子克隆

(1)基因組dna的提?。簠⒄誸akaraminibestuniversalgenomicdnaextractkit5.0試劑盒說明書，以家蠶(大造)血細胞為材料，提取基因組dna。利用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計分別檢測基因組dna的質(zhì)量與濃度。

(2)啟動子擴增

a、以獲得的血細胞特異基因mrna5’race測序結(jié)果作為質(zhì)詢序列，比對家蠶基因組數(shù)據(jù)庫silkdb數(shù)據(jù)庫，下載轉(zhuǎn)錄起始位點上有約5kb的基因組序列，設(shè)計引物；

表4

b、以上面提取的家蠶基因組為模板，按照下面的擴增條件和反應(yīng)體系，進行pcr擴增反應(yīng)，其擴增反應(yīng)體系為：dna模板，3μl；上下游引物各0.5μl；pcrbuffer(含mg²⁺)，2.5μl；dntp，2μl；hifitaq，0.2μl，最終用ddh2o補充至25μl。擴增條件為：94℃預(yù)變性2min，25個循環(huán)的94℃變性30s，55℃退火30，72℃延伸1-5min。最后72℃處理10-15min，最終產(chǎn)物短時間保存于12℃。

c、利用1％的瓊脂糖膠對擴增產(chǎn)物進行檢測，然后切膠回收，將擴增片段連接至pmd19-tvector后，送至華大測序。

5：病毒表達載體的構(gòu)建

利用三步pcr法點突變技術(shù)在pph和pp10啟動子之間突變出ecori酶切位點，在xbai和hindiii之間插入dsred序列，在kpni和xhoi之間插入egfp序列。利用ecori和xbai酶切位點，將目的啟動子插入病毒表達載體中。相應(yīng)質(zhì)粒構(gòu)建完成并且驗證正確后，轉(zhuǎn)化至dhl0bactm大腸桿菌感受態(tài)細胞，讓載體重組。提取重組質(zhì)粒，pcr驗證后轉(zhuǎn)染至bme-swu3細胞，收集病毒，用于個體研究。

6：病毒侵染家蠶

用毛細玻璃管將收集的病毒注射至5齡1天幼蟲體腔((10⁵pfu/頭))，五天后分別收集包括血細胞、取絲腺和脂肪體在內(nèi)的各個組織。

7：轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建

體外合成flag-egfp-tm-serpa序列(見附錄)，flag為3×flag標簽，egfp為增強型綠色熒光蛋白，tm為家蠶bgibmga006002的跨膜結(jié)構(gòu)域部分，serpa是家蠶sericin1基因的3’utr區(qū)域。用bglii和xbai限制性內(nèi)切酶分別對合成質(zhì)粒和psl1180質(zhì)粒進行酶切，回收flag-egfp-tm-serpa和psl1180片段，經(jīng)t4dna連接酶連接后構(gòu)建成psl1180-flag-egfp-tm-serpa質(zhì)粒。

以大造基因組為模板，對bgibmga006002和bgibmga006150的啟動子進行pcr擴增，共用引物序列為

pint02/50-f：“cgggatcccaagaaatacacatcaacggg”，

pint02/50-r：“gaagatctatcacggcagaaagacgatc”。

產(chǎn)物回收后與pmd19-tvector載體進行ta克隆，得到t-pint02/50，測序驗證后，用bamhi和bglii限制性內(nèi)切酶進行切割，將回收pint02/50的pcr擴增產(chǎn)物序列與經(jīng)同樣酶切處理的psl1180-flag-egfp-tm-serpa的載體片段進行連接，獲得psl1180-pint02/50-flag-egfp-tm-serpa。挑取單克隆接種至lb液體培養(yǎng)基，提取質(zhì)粒后，利用bamhi和bglii進行雙酶切驗證，能夠?qū)幼悠吻懈畹馁|(zhì)粒為psl1180-pint02-flag-egfp-tm-serpa(pint02)，不能夠被這兩種酶切割的質(zhì)粒為psl1180-pint50-flag-egfp-tm-serpa(pint50)。最后，所有質(zhì)粒經(jīng)測序驗證后用于下一步的操作。

用asci限制性內(nèi)切酶對質(zhì)粒pint02和pint50進行切割，分別切下pint02-flag-egfp-tm-serpa和pint50-flag-egfp-tm-serpa片段，連接到經(jīng)過同同樣酶切的pbac[3×p3-rfpafm]基礎(chǔ)載體，構(gòu)建pbac[pint02-flag-egfp-tm-serpa,3×p3-rfp]和pbac[pint50-flag-egfp-tm-serpa,3×p3-rfp]轉(zhuǎn)基因載體。

8：顯微注射與熒光篩選

(1)參照qiaprepspinminiprepkit超純質(zhì)粒提取試劑盒提供的造作方法，分別提取pbac[pint02-flag-egfp-tm-serpa,3×p3-rfp]和pbac[pint50-flag-egfp-tm-serpa,3×p3-rfp]和pha3pig質(zhì)粒。

(2)將d9l非滯育品系參照第三章提供的條件進行飼養(yǎng)，化蛾后取雌雄蛾，交配4-6小時，拆對后產(chǎn)下的蠶卵備用。

(3)將重組轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒pha3pig等體積混勻后，注射至剛產(chǎn)出的蠶卵中，用無毒膠水對破損傷口進行修補，然后在在保濕盒中進行孵育催青。g0代用干凈的新鮮桑葉飼養(yǎng)至化蛾后，自交保種。

(4)g0代蛾子產(chǎn)下的卵在正常條件下催青，胚胎發(fā)育5-6天后利用體式熒光顯微鏡篩選轉(zhuǎn)基因陽性個體。g1代陽性個體單獨飼養(yǎng)，化蛾后自交保種。

步驟7：實驗結(jié)果

(1)血細胞特異表達基因的篩選

家蠶幼蟲各組織表達芯片數(shù)據(jù)為篩選組織特異性基因提供了有用的工具，在本章節(jié)，分析了個不同幼蟲組織和bmn細胞系中相關(guān)基因的表達情況，篩選出24個血細胞特異高表達的基因探針。將這些探針序列作為質(zhì)詢序列，在家蠶數(shù)據(jù)庫silkdb和kaikobase中進行比對分析，獲得詳細的基因序列信息。經(jīng)過一系列的分析、克隆和表達分析，最終篩選確定兩個個候選基因，即bgibmga006002，bgibmga006150的新基因。利用實時熒光定量pcr檢測了這四個基因在血細胞，頭部，精巢，精巢，中腸，馬氏管，體壁，絲腺和脂肪體中的表達情況，結(jié)果顯示均特異高表達與血細胞。bgibmga006002和bgibmga006150表是整合素家族的兩個β亞基成員，與其他整合素成員一樣，其蛋白序列均由一個較大的胞外域(extracellulardomain)，一個單次跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembraneregion)和一個較短的胞內(nèi)域(cytoplasmicdomain)構(gòu)成。

(2)基因結(jié)構(gòu)分析與啟動子克隆

為了獲得這兩個基因的啟動子序列，利用5’race技術(shù)對各基因的5’utr區(qū)域進行了pcr擴增和測序，隨后對各基因染色體定位、外顯子和內(nèi)含子的分布情況進行了研究。bgibmga006002和bgibmga006150定位于4號染色體nscaf2847上，這兩個基因在基因組上表達方向相反，中間只有841bp的間隔。根據(jù)每個基因的特點設(shè)計啟動子擴增區(qū)域，其中，bgibmga006002設(shè)計了6種片段；bgibmga006150設(shè)計了3種片段。將這些片段克隆并構(gòu)建至pmd19-t載體，測序正確后備用。為了初步驗證啟動子活性，對acnpv病毒質(zhì)粒進行了改裝，其中病毒啟動子pp10驅(qū)動增強型綠色熒光蛋白(egfp)表達，其目的是檢測病毒侵染家蠶各組織的情況。紅色熒光蛋白(dsred)是一個報告基因，用于檢測目的啟動子的活性。在本實驗中，以病毒pph啟動子為陽性對照(pph)，而未插入任何啟動子序列的為陰性對照(pδp)。a，候選血細胞特異基因啟動子克隆示意圖，彩色方框和黑色線條分別表示外顯子和內(nèi)含子區(qū)域，藍色方框表示5’非編碼區(qū)，短箭頭表示轉(zhuǎn)錄起始位點，而長箭頭表達克隆的啟動子序列；b，載體構(gòu)建示意圖，目的啟動子序列插在ecori和xbai之間(phs)，以在這兩個位點之間插入pph啟動子(pph)為陽性對照，而沒有任何啟動子序列(pδp)的為陰性對照。

(3)acnpv病毒系統(tǒng)檢測啟動子活性

按照方法中所描述的步驟，獲得病毒并感染家蠶幼蟲，五天后收集家蠶血細胞、脂肪體和絲腺進行分析。在陽性對照組pph中，在三個組織中均明顯觀察到紅色和綠色熒光信號；而在陽性對照組pδp)中，在三個組織中至觀測到綠色熒光信號而不見紅色熒光信號。對于bgibmga006002基因啟動子，首先從翻譯起始位點開始往其上游截取了2k長度的片段(pint02-1)，但在血細胞中只檢測到綠色熒光信號而無任何紅色熒光信號，這說明該區(qū)域可能無啟動子活性。緊接著，繼續(xù)擴大研究范圍，先后從翻譯起始位點開始往其上游截取了3k(pint02-2)和5k(pint02-3)的長度，但遺憾的時，仍未檢測到啟動子的活性。因此，擴大了尋找啟動子區(qū)域的范圍，截取了包括第一內(nèi)含子在內(nèi)的多種組合(pint02-4,5,6)，其中，pint02-3范圍最大，包含翻譯起始位點上游2k和bgibmga006002基因的第一外外顯子、第一內(nèi)含子以及第二外顯子的部分；pint02-4包含bgibmga006002基因的第一外顯子、第一內(nèi)含子以及第二外顯子的部分；pint02-5只包含bgibmga006002基因的第一內(nèi)含子。令人意外的是，這三種片段均顯示出一定的啟動子活性，在血細胞中可以明顯觀察到紅色熒光信號，同時在脂肪體和絲腺沒有檢測到明顯的紅色熒光信號。利用類似的方法對bgibmga006150基因啟動子進行分析，當截取的片段包含第一內(nèi)含子區(qū)域時，在血細胞中均能觀測到紅色熒光信號，而脂肪體和絲腺卻沒有。為了研究各啟動子在血細胞中的活性，利用流式細胞儀對感染的血細胞進行分析，bgibmga006002和bgibmga006150的啟動子活性相對較弱。

(4)轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建

為了最大可能獲得具有活性的啟動子片段，根據(jù)前期研究結(jié)果，結(jié)合這兩個基因結(jié)構(gòu)的特殊性，設(shè)計了從bgibmga006150第二外顯子至bgibmga006002第二外顯子，長度為3828bp，反相互補的兩段dna序列作為這兩個基因的啟動子序列(圖2a)。按照方法部分的描述，成功構(gòu)建了bgibmga006002和bgibmga006150啟動子驅(qū)動egfp表達的轉(zhuǎn)基因載體(圖2b)。

(5)胚胎微量注射與陽性個體篩選

分別將pbac[pint02-flag-egfp-tm-serpa,3×p3-rfp]和pbac[pint50-flag-egfp-tm-serpa,3×p3-rfp]和pha3pig質(zhì)粒等比混勻，顯微注射至d9l胚胎，g0代蠶卵正常催化孵育和飼養(yǎng)，通過自交獲得g1代蠶種，與胚胎發(fā)育6-8天和化蟻時期進行熒光篩查。篩查結(jié)果顯示，pbac[pint02-flag-egfp-tm-serpa,3×p3-rfp]組注射的200粒蠶卵中，共孵化出43粒，最終制備了18圈g1代蠶卵，并從其中兩個蛾圈中篩選到陽性轉(zhuǎn)基因個體，陽性率為11.1％；而pbac[pint50-flag-egfp-tm-serpa,3×p3-rfp]注射的200粒蠶卵中，共孵化出34粒，最終制備了12圈g1代蠶卵，并從其中一個蛾圈中篩選到陽性轉(zhuǎn)基因個體，陽性率為8.3％。在轉(zhuǎn)基因陽性個體飼養(yǎng)過程中，在幼蟲期、蛹期和蛾期均能在眼睛中觀測到明顯的紅色熒光信號，蛾期時熒光檢測的情況，在眼睛中可以明顯觀測到很強的紅色信號。

(6)egfp在轉(zhuǎn)基因個體中的表達

將pint02和pint50兩種轉(zhuǎn)基因品系飼養(yǎng)至五齡3天時，分別收集體壁、頭部、脂肪體、中腸、馬氏管、絲腺、精巢、精巢、血細胞和翅原基等組織，提取rna并反轉(zhuǎn)為cdna后，利用實時熒光定量pcr對egfp在兩種轉(zhuǎn)基因品系中的表達情況進行研究。結(jié)果顯示在這兩種轉(zhuǎn)基因品系中，egfp均高表達于血細胞，在翅原基中有一定的表達，而在其他組織的表達水平都很低(圖3a和圖3b)。選取血細胞、脂肪體、中腸、體壁、絲腺、頭部和馬氏管等部分組織，提取蛋白后，利用flag抗體進行westernblot檢測，發(fā)現(xiàn)在兩種轉(zhuǎn)基因品系中，均只在血細胞中檢測到明顯的條帶(圖3c和圖3d)。收集轉(zhuǎn)基因個體血細胞，在熒光顯微鏡下觀察，可以發(fā)現(xiàn)有部分血細胞具有很強的綠色熒光信號，且大部分定位于細胞膜上。根據(jù)形態(tài)學觀察，發(fā)現(xiàn)egfp陽性細胞均為漿細胞。為了進一步檢測egfp在各種血細胞類型中的表達情況，對不同的血細胞類型進行分離，仍然進行定量分析，發(fā)現(xiàn)egfp主要表達于造血器官新釋放的血細胞和循環(huán)漿細胞中，而在其他的血細胞類型中表達水平很低(圖4)。同時，在熒光顯微鏡下對翅原基、脂肪體和絲腺組織進行觀察，結(jié)果顯示，在這兩種轉(zhuǎn)基因品系中，egfp在與翅原基緊密相連的造血器官中有熒光信號，而在脂肪體和絲腺沒有熒光信號。

總之，獲得兩個血細胞特異性啟動子，利用轉(zhuǎn)基因操作其進行進一步研究，最終確定獲得兩個家蠶循環(huán)血細胞中的漿細胞特異性啟動子。相信的研究結(jié)果不僅可以推動家蠶造血研究，還可以為昆蟲相關(guān)研究提供有用的參考。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

<110>申請人名稱：西南大學

<120>一種具有家蠶血細胞特異性活性的啟動子的鑒定方法

<160>2

<210>1

<211>3828

<212>dna

<213>家蠶

<400>核苷酸序列

caagaaatacacatcaacgggattgtccttgaaatcgtaggtgaaattgaacgtttgtggttcacctattcgaagtttcatttcgtatttcaacggtttgatttgtttgttctcgttcgattcaatcattatactattcgagagttcattgactggtaccggctcaggacaccaatctgcctcatacgaagaacgagggatacatctggtacggttaaacgctttctgtaaagaatataacattttatttttattggtatacttcaatttatcgttgtctctctttcgtttcaagtcttatcttgaagatgaatgattttctcagtataaatcaatacgcttttgcatcatttttttcctgcttcgtcccatcttacattcaagggtaatggtgtgtcatgaatgtggccaacattaggcaaacagccgttcactacagctaaagactcatttcaaatctcgcttcgtaatgctcacaaaacattcgtaaaaagaaagtttgtatcagtcggatttaaaatgaaaataattacttctagagacacactgtgcatggatacagtggtagtaatgttacgcgctggtgttggggataaataaaaattctaccgaagtacaagttaacatagagatagagaatattccacaaaagtctagtattgtgtgttttcgctatctgacaatagatggcgttgtacttctcgagcgatctagatgttactagatccttcgatattcgttcgactattcggcgatagatggcgttacttttaccggcatagcaggaagaataaattatgctgtggcaccgatggtaaaaatgacctgacgggatcatctcaagtaattcccctgcgaattcatcgtagaatatgacataataaataaaacatcaaatccttcttagcccaagagatttcaaacgaatttttatatcaggatttacgataatctgtgcagccctcgtctacttatacgttaagagcattaagatggtccgtaggagacaagtccactcagagctcttgtcgtacctaatatctccgcaaagctactcattctagtccaaaggattggacagcattaatacaattgatacctcgatcttattctgattttgatattaaatcctttattcaaggtcagtgacagcagtcatctgggacctctatgggcctacggtaacgattaaacatcaagtgttcgttaatctattactcaagtcagtgatatcgttaaaaaaaaatatgtacttacagcagcacaccaaacgcaaacattcggatttcttatacactctttacaattttcagatttttcgtataggtcaatcaataaacattcttttagaagtaaaaaaaataaaaggtaatgtacaaacatttttagttggtaactgaatttcactgaataactcgtggaaatatatatctgtaataatgtgctacaaaataactttgctgccattatcctgttggacaaattaaaaacataaggcttagtgtacatgtgtgcctattcaatcgctgttttggctttccaaagatttttgacagttttgtttttaacacattattcaactttaatttattgcttagatgggccaccaaagtgcaaagtaaaaaattagaaacatgccaaattagaaacagttatacgaaacaaggtcgcacttgagatacaaaatctttcaattagaatgcgcaaactataatggcaatggacaggacaggaataggaggcatcgaaaaatggaacaaaaacatagtgttttggtaccctagagatagaaaaaggaaacgaggcagactgattcggaggtgggaacacgagataaagacggtagcaggaaaactatggacaaggaaagctctaaaccgagtagagtggaagatggaggaggcctttgccggggttgggcaaacatatgaagttgtcgatgttaccaactcggcagagtcgttaatttaagtttattatttgtaaatatcctttttgcgtctgaataaaggcttttattattagatggatagacgagcttacggtccacttggtattaagagctactagagcccatagacgtctgtttctaccgtgaaacactaatgcgttccgttccgaaggatgggtcagatggactggttaataagataggcgttattcacaatgtaatttctgtggttccagtaaacacttaatatcaggtgggccatcaacacgttcaacggtctattcagtaagctattaaatacttagataactcattcgacttaaatcagacgacacagtttacacttacctttttgtgttcgtatttatatcgcgttacgttattgtggtcatgttttcctgcatttatatttgtacgttaggtttatgactagttgtgatcgtgtagggctcacgaagctatgttccgtttaacgaaagtcactgttcttatgatttatttttgtttcgctagtggcacttccatttgtggacagttcaagacatgtagttcgtgtataagctacgcttcggagaggtgcgtctggtgtagcgaggtacgttctgatgtcgaacggctgacggagccaataaaaggcgaaatctgctgtacagcttataaggtctttttttttaatggatacaacgtcactgctacatttgaagcggagcgcatcattgtttccctacatttctgtctgagattacaatgtgtcccaaccctagtgtttaagacagctactttgaggttaggatttaaaaaaatatagttgagaatagtgattctacacctcaacgataaatcctgaataacatttccttctccaaacgaggcccgagaagagtattcagcgataggcaacggtttggttctgctcctggctttgctgacgttcaagagcagcggtaacttctcactctcactatggaccatatgcttgtttgtctaagaggacaatgaaataaataattttgttttttttttattgctttgatgggtggacgagctcacagcccacctggtgttaagtggttactggagcccatagacatctacaacgtaaatgcgccacccaccatacttatacccacccaccttatttatatatataatataatatatataaatgaattgctgttcgttagtctcggtaaaactcgagaacggctggaccggtttagctaattttggtcttaaattctttgtggaagtccagaaaaggcttaaaaggtaaataaatatgaaaatgcttggaattaaatgaaaataataattttgttttccctttgatgtgtcccccgtcggacggattccgtttgtttgttttaagcttattttatacaaaagtttagtcttttatttatcgattgagccattacaaagtctgccgggtcagctagtaataaataaacgaatagttagcattagttagagtttgttggtgacgctttcttattatctactgtaaatttggcgaacattatacacgctgtgaaatctttagaatccgtaaatcgcttaatagtaagtgggccgcaaagacatgaaaaagtgcaatgatgagaggtagagagtatattcaagcagtagtggaagtcctcacctgtctctttcttcttattctcccataacttttcctgtattaactgatcgaaaaaaataaaaaaagactattgctgttttaggctgaaacaaaacacactagatgtcaacctgaaatcttcgcaagcgaccaaacttggtgcaacagttcttttatttacaaccctaaatttgaaaagtttgaagaacaacacgtgccctatcaaagtgttgatgatcacggcagaaagacgatc

<210>2

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<213>家蠶

<400>核苷酸序列

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