檢測寨卡病毒的熒光定量pcr方法、引物及試劑盒的制作方法
【專利摘要】檢測寨卡病毒的熒光定量PCR方法、引物及試劑盒。本發(fā)明提供了一組引物和探針，其中一條引物包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，另一條引物包含SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，本發(fā)明還提供了所述引物和探針在制備檢測寨卡病毒的產(chǎn)品中的應(yīng)用，同時本發(fā)明還提供了含有該引物、探針的試劑盒及應(yīng)用。經(jīng)實驗證明，本發(fā)明的引物、探針特異性好、靈敏度高、檢測時間短和適用范圍廣，且基于該引物、探針建立的寨卡病毒的檢測方法，可靈敏、準(zhǔn)確、簡便和快速的檢測寨卡病毒的存在和/或含量。
【專利說明】
檢測寨卡病毒的黃光定量PCR方法、引物及試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物檢測領(lǐng)域，特別設(shè)及檢測寨卡病毒的巧光定量PCR方法、引物及試 劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 寨卡病毒病是由寨卡病毒(Z化a Virus,ZIKV)引起并通過蚊媒傳播的一種急性自 限性疾病。ZIKV于1947年首次在烏干達從恒河猴體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，1952年在烏干達和坦桑尼亞 的人體中分離到病毒。ZIKV主要依賴感染病毒的伊蚊類蚊媒通過叮咬傳播，也可通過母嬰 傳播W及血液和性傳播。2007年W前，全球僅報告14例ZIKV病散發(fā)病例，2007年首次在太平 洋島國密克羅尼西亞的雅普島發(fā)現(xiàn)寨卡病毒暴發(fā)疫情之后，出現(xiàn)ZIKV感染病例和暴發(fā)疫情 的國家及地區(qū)增加明顯，已經(jīng)在非洲、東南亞和美洲等地造成多次暴發(fā)流行。2015年5月，己 西報告首例寨卡病毒病病例；同年10月，己西報告新生兒小頭崎形明顯上升，時空分布與寨 卡病毒流行區(qū)相吻合。截至2016年1月2日，己西衛(wèi)生部官方統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，己西因寨卡病毒 所致的疑似新生兒小頭崎形病例已達3174例，其中已有38例死亡，而2月初該數(shù)字已達4783 例。研究表明除了引起小頭崎形W外，寨卡病毒感染還和格林-己利綜合征有也有著密切 的聯(lián)系。
[0003] 目前針對寨卡病毒的實驗室診斷方法有病原學(xué)方法、血清學(xué)方法和針對病毒核酸 檢測技術(shù)。傳統(tǒng)的病原學(xué)方法主要通過細胞進行病毒的分離，耗時、耗力，而且寨卡病毒的 病毒血癥持續(xù)時間短，較難采集到合適的樣品。血清學(xué)試驗，包括化ISA、免疫巧光、中和試 驗等，也被廣泛應(yīng)用于寨卡病毒的實驗室檢測。但是病毒特異性IgM和中和抗體出現(xiàn)較晚， 約發(fā)病后1周末期才可檢出，同時黃病毒間交叉反應(yīng)常見，難W鑒別。巧光定量W特異性強、 靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快的諸多優(yōu)點成為寨卡病毒感染實驗室確診的重要工 具。
[0004] 寨卡病毒屬于黃病毒科(Flaviviridae)黃病毒屬(Flavivirus)，病毒顆粒呈球 形，直徑約為40~70nm。寨卡病毒為單股正鏈RNA病毒，其基因組全長約10.8肺，分子生物學(xué) 和生物信息學(xué)分析表明，寨卡病毒主要存在非洲型和亞洲型兩個亞型，在系統(tǒng)發(fā)生樹上與 同為黃病毒屬的登革病毒、日本腦炎病毒及西尼羅病毒相近。寨卡病毒基因組只有一個單 一的開放讀碼框(open reading打ame)，所編碼的病毒蛋白經(jīng)宿主蛋白酶和病毒蛋白酶切 割成不同的功能蛋白，包括3個結(jié)構(gòu)蛋白（C、prM/M和E)W及7個非結(jié)構(gòu)蛋白（NSUNS2A、 NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)。自2016年2月9日我國確認(rèn)第一例輸入性寨卡病例W來，截止到 2016年5月18日已經(jīng)確診17例寨卡病毒感染病例，均為輸入性病例，入境口岸大多在廣東地 區(qū)。根據(jù)廣東地區(qū)的伊蚊分布、人口密度和出入境流動情況，W及疫區(qū)疾病流行趨勢分析， 推測廣東地區(qū)輸入性病例還會有所增加;針對伊蚊分布廣泛的地區(qū)進行風(fēng)險評估和預(yù)警 分析，結(jié)果顯示寨卡病毒在廣東地區(qū)發(fā)生地方性流行的風(fēng)險指數(shù)較高。因此，建立一種快 速、準(zhǔn)確、敏感的巧光定量PCR檢測方法對我國的寨卡病毒防控工作具有重要的意義?，F(xiàn)有 技術(shù)中還沒有對寨卡病毒進行巧光定量PCR檢測的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種靈敏、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、簡便和快速的檢測寨卡病 毒的巧光定量PCR方法，本發(fā)明還提供了用于該方法的特異性好、靈敏度高、檢測時間短、穩(wěn) 定性高和適用范圍廣的引物、探針和含有該引物、探針的試劑盒及應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明第一方面提供了一組引物和探針，其中一條引物包含SEQ ID N0:1所示的 核巧酸序列，另一條引物包含SEQ ID NO:2所示的核巧酸序列。
[0007] 在一優(yōu)選例中，所述探針為包含SEQ ID NO:3所示的核巧酸序列。
[0008] 在一優(yōu)選例中，所述探針?biāo)玫臐蓽缁鶊F為TRAMA、巧光基團為HEX。
[0009] 本發(fā)明第二方面提供了所述的引物和探針在制備檢測寨卡病毒的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0010] 在一優(yōu)選例中，所述檢測寨卡病毒的產(chǎn)品還包括PCR擴增試劑；
[0011] 在一優(yōu)選例中，所述PCR擴增試劑為巧光定量PCR試劑。
[0012] 本發(fā)明第=方面提供了一種試劑盒，包括所述的引物和探針。在一優(yōu)選例中，還包 括PCR擴增試劑。
[0013] 在一優(yōu)選例中，所述PCR擴增試劑為巧光定量PCR試劑。
[0014] 在一優(yōu)選例中，所述巧光定量PCR試劑包括來自化kara公司的貨號為RR064A的化e Step PrimeScript? RT-PCR Kit試劑盒所包含的試劑。
[0015] 在一優(yōu)選例中，所述來自!"akara公司的貨號為RR064A的One Step PrimeScript? RT-PCR Kit試劑盒所包含的試劑為2XOne Step RT-PCR Buffer IIIJakara Ex hq HS、 PrimeScript RT Enzyme Mix和ROX Reference Dye or Dye II中的至少一種。
[0016] 在一優(yōu)選例中，還包括陽性對照和陰性對照。
[0017] 在一優(yōu)選例中，還包括RNA提取試劑。
[001引在一優(yōu)選例中，所述RNA提取試劑包括來自QIAGEN公司的貨號為52904的QIAamp Viral RNA Mini Kit RNA提取試劑盒所包含的試劑。
[0019] 在一優(yōu)選例中，還包括逆轉(zhuǎn)錄試劑。
[0020] 在一優(yōu)選例中，所述逆轉(zhuǎn)錄試劑包括來自化kara公司的貨號為RR064A的化e step PrimeScript? RT-PCR Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒所包含的試劑。
[0021] 本發(fā)明第四方面提供了所述的試劑盒在制備檢測寨卡病毒的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0022] 本發(fā)明第五方面提供了一種篩選易患寨卡病毒病的生物樣品的系統(tǒng)，包括：
[0023] 核酸提取裝置，所述核酸提取裝置用于提取所述生物樣品中的核酸樣本；
[0024] 巧光定量PCR裝置，所述巧光定量PCR裝置與所述核酸提取裝置相連，適用于采用 權(quán)利要求1或2所述的引物和探針對所述核酸樣本進行巧光定量PCR反應(yīng);W及
[0025] 判斷裝置，所述判斷裝置與所述巧光定量PCR裝置相連，W便基于巧光定量PCR反 應(yīng)的結(jié)果，判斷所述生物樣品是否易患寨卡病毒病。
[0026] 在一優(yōu)選例中，所述核酸提取裝置還用于提取已知濃度/拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒。
[0027] 在一優(yōu)選例中，所述巧光定量PCR裝置還用于采用權(quán)利要求1或2所述的引物和探 針對所述已知濃度/拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒進行巧光定量PCR反應(yīng)。
[0028] 在一優(yōu)選例中，所述核酸提取裝置進一步包括:標(biāo)準(zhǔn)曲線測定裝置，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線 測定裝置分別與所述巧光定量PCR裝置和判斷裝置相連，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線測定裝置先將所述 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒在巧光定量PCR裝置產(chǎn)生的Ct值與標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的濃度進行關(guān)聯(lián)并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲 線，所述判斷裝置將標(biāo)準(zhǔn)曲線測定裝置產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線與核酸樣本在巧光定量PCR裝置產(chǎn) 生的結(jié)果進行比對，判斷生物樣品中的寨卡病毒的含量或拷貝數(shù)。
[0029] 在一優(yōu)選例中，所述核酸提取裝置進一步包括：
[0030] RNA提取單元，所述RNA提取單元用于從生物樣品中提取RNA樣本;W及
[0031] 逆轉(zhuǎn)錄單元，所述逆轉(zhuǎn)錄單元與所述RNA提取單元相連，用于對所述RNA樣本進行 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，W便獲得cDNA樣本，所述cDNA樣本構(gòu)成所述核酸樣本。
[0032] 在一優(yōu)選例中，所述生物樣品為包含有DNA和/或RNA的血液、細胞或組織，或為質(zhì) 粒，或為DNA、cDNA、mRNA或cDNA片段，或為含有DNA、cDNA、mRNA或cDNA片段的試劑；
[0033] 在一優(yōu)選例中，當(dāng)生物樣品為DNA、cDNA或cDNA片段，或為含有DNA、cDNA或cDNA片 段的試劑，或為質(zhì)粒時，將其直接作為核酸樣本與所述引物和探針對進行實時巧光PCR反 應(yīng)；
[0034] 在一優(yōu)選例中，當(dāng)生物樣品為含有DNA和/或RNA的血液、細胞或組織，或為mRNA,或 為含有mRNA的試劑時，將其轉(zhuǎn)化為DNA、CDNA或CDNA片段的核酸樣本再與所述引物和探針進 行實時巧光PCR反應(yīng)。
[0035] 在一優(yōu)選例中，所述實時巧光PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系如下：
[0036]
[0037] 所述2X0ne Step RT-PCR Buffer III、Takara Ex Taq HS、PrimeScript RT Enzyme Mix和ROX Reference Dye or Dye II均來自Takara公司的貨號為RR064A的One Step PrimeScript? RT-PCR Kit試劑盒。
[003引在一優(yōu)選例中，所述實時巧光PCR反應(yīng)的程序如下：50°C 2min;95°C 10min;95°C 15s,55°C lmin,40個循環(huán)。
[0039] 本發(fā)明具有如下有益效果：
[0040] (1)本發(fā)明針對寨卡病毒設(shè)計的引物、探針特異性好、靈敏度高、檢測時間短和適 用范圍廣。
[0041] (2)本發(fā)明建立的寨卡病毒的巧光定量PCR檢測方法，可對寨卡病毒進行定性檢 測。
[0042] (3)本發(fā)明W已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒作為模板進行巧光定量反應(yīng)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線， 通過對比待測生物樣品檢測結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于測算出待測生物樣品中的寨卡病毒含 量，因此其可對寨卡病毒進行定量檢測，同時也可W作為實驗室檢測增殖曲線的一種手段。
[0043] (4)本發(fā)明建立的寨卡病毒的巧光定量PCR檢測方法特別適用于臨床樣品的檢測， 其檢測的靈敏度可達到10個拷貝的病毒分子，操作簡易，結(jié)果穩(wěn)定，對我國的寨卡病毒防控 工作具有重要的意義。
【附圖說明】
[0044] 圖1為本發(fā)明引物、探針W及檢測方法對寨卡病毒的靈敏性分析結(jié)果示意圖，其中 橫坐標(biāo)為循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為巧光值。其中1-8分別代表拷貝數(shù)為IO 8ZiU-IO^iil的樣品擴增 曲線。
[0045] 圖2為本發(fā)明利用構(gòu)建的質(zhì)粒所繪制的巧光定量PC財示準(zhǔn)曲線示意圖，其中橫坐標(biāo) 為拷貝數(shù)對數(shù)，縱坐標(biāo)為循環(huán)數(shù)。
[0046] 圖3為本發(fā)明引物、探針W及檢測方法對寨卡病毒的特異性分析結(jié)果示意圖，其中 橫坐標(biāo)為循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為巧光值。
【具體實施方式】
[0047] 除非特殊說明，本發(fā)明所用術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的一般含義。
[0048] 下面參考具體實施例和附圖，對本發(fā)明進行說明，需要說明的是，運些實施例僅僅 是說明性的，而不能理解為對本發(fā)明的限制。實施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng) 域內(nèi)的文獻所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠 商者，均為可W通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0049] 實施例1
[0050] 本實施例提供了一種檢測寨卡病毒的引物、探針及其應(yīng)用。
[0051] 引物、探針的設(shè)計:通過對寨卡病毒E基因進行比對，尋找保守區(qū)域，設(shè)計能夠覆蓋 所有毒株的特異性引物和探針。
[0052] 引物和探針具體序列如下：
[0化3]上游引物（211(￥斗）：5'-164〔446〔41^：464〔4(：-3'（5￡9 10^.1)(尺代表4或6) [0化4]下游引物（ZIKV-R):5'-TCACCAGRCTCCCTTTGC-3'（沈Q ID N0.2KR代表A或G)
[0055] 探針（ZIKV-P):5'-HEX-AGAGGCTGGGGAAATGGATGTGGACT-TRAMA-3,（沈Q ID N0.3)
[0056] 引物和探針均由上海生工生物工程有限公司合成，擴增的目的片段大小為98bp。 革G歹ll^：t邑曰C曰曰邑C曰曰tc曰邑曰C曰etc曰曰t曰t邑tct邑C曰曰曰曰邑曰曰C邑tt曰邑t邑邑曰C曰邑曰邑邑Ct邑邑邑邑曰曰曰t邑邑曰t 邑t邑邑曰Cttttt邑邑C曰曰曰邑邑邑曰邑CCt邑邑t邑曰（SEQ ID NO:4)O
[0057] 上述引物和探針可應(yīng)用于在制備檢測寨卡病毒的產(chǎn)品，所述檢測寨卡病毒的產(chǎn)品 還包括巧光定量PCR試劑。
[0化引實施例2
[0059] 本實施例提供了一種試劑盒及其應(yīng)用，所述試劑盒包括：
[0060] (1)實施例1的引物和探針；
[0061 ] (2)巧光定量PCR擴增試劑。
[0062] 所述巧光定量PCR試劑包括來自Takara公司的貨號為RR064A的One Step PrimeScript? RT-PCR Kit試劑盒所包含的試劑。
[0063] 實驗證明，上述巧光定量PCR擴增試劑與引物和探針的聯(lián)合使用，效果更加優(yōu)越， 具體表現(xiàn)在可重復(fù)性好、特異性強，靈敏度高的特點。
[0064] 所述試劑盒還可W進一步包括：
[0065] (3)陽性對照和陰性對照；
[0066] (4)RNA 提取試劑；
[0067] (5)逆轉(zhuǎn)錄試劑。
[0068] 所述陽性對照是采用擴增、克隆所獲得標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，所述的擴增、克隆是指采用上 述寨卡病毒的引物進行擴增目的片段，鑒定為陽性的產(chǎn)物，克隆到PGEM-T載體并轉(zhuǎn)化到大 腸桿菌D冊a感受態(tài)細胞，藍白斑篩選挑取陽性克隆。
[0069] 所述RNA提取試劑包括來自QIAGEN公司的貨號為52904的QIAamp Viral RNA Mini Kit RNA提取試劑盒所包含的試劑;所述逆轉(zhuǎn)錄試劑包括來自化kara公司的貨號為RR064A 的One Step PrimeScript? RT-PCR Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒所包含的試劑。
[0070] 上述試劑盒可應(yīng)用于檢測寨卡病毒上。
[0071] 實施例3
[0072] 本實施例提供了一種檢測寨卡病毒的方法，例如檢測生物樣品中寨卡病毒的存在 和/或含量，該方法使用了實施例1的引物、探針W及實施例2的試劑盒。
[0073] 上述生物樣品為包含有DNA和/或RNA的血液、細胞或組織，或為質(zhì)粒，或為DNA、 cDNA、mRNA或cDNA片段，或為含有DNA、cDNA、mRNA或cDNA片段的試劑。
[0074] 當(dāng)生物樣品為DNA、cDNA或CDNA片段，或為含有DNA、cDNA或CDNA片段的試劑，或為 質(zhì)粒時，將其直接作為模板與所述引物和探針對進行實時巧光PCR反應(yīng)。
[0075] 當(dāng)生物樣品為含有DNA和/或RNA的血液、細胞或組織，或為mRNA,或為含有mRNA的 試劑時，將其轉(zhuǎn)化為DNA、cDNA或CDNA片段再與所述引物和探針進行實時巧光PCR反應(yīng)。
[0076] 檢測寨卡病毒的方法包括如下步驟：
[0077] 1.實時巧光PCR反應(yīng)
[0078] 采用hkara公司的貨號為RR064A的One St巧 PrimeScript ? RT-PCR Kit試劑盒 的試劑按照試劑盒說明書配制反應(yīng)液：取2X0ne Step RT-PCR Buffer III12.扣IJakara Ex Taq HS 0.Sul,PrimeScript 民T Enzyme Mix 0.Sul，民OX 民eference Dye or Dye II 0.姐l，20tiM的實施例1的上游引物和下游引物各0.姐l，20tiM的實施例1的探針0.姐1，化L DNA或cDNA或cDNA片段（拷貝數(shù)為1 〇1/化至10^化），W及DEPC水祉1，加入至0.2mL PCR反應(yīng) 管中，W超純水為陰性對照樣品，振蕩混勻后瞬時離屯、數(shù)秒。將反應(yīng)管置于ABI公司的 750(Fast巧光定量PCR儀上進行實時巧光PCR擴增和檢測，所述實時巧光PCR擴增的程序如 下：501：2111111;95°(：10111111;95°(：153,55°(：1111111，40個循環(huán)。
[0079] 2.判斷生物樣品中寨卡病毒的存在和/或含量
[0080] 在每一循環(huán)的延伸溫度結(jié)束時采集巧光信號并進行烙融曲線的分析，當(dāng)Ct ^ 35時 代表生物樣品中含有寨卡病毒，為陽性；當(dāng)Ct>35且Ct<40時則代表生物樣品中疑含寨卡 病毒，需要重復(fù)實驗W確認(rèn)，如果重復(fù)實驗的Ct值仍在上述范圍內(nèi)，則判斷為陽性；當(dāng)Ct > 40時代表生物樣品中未含有寨卡病毒，為陰性。
[0081] 當(dāng)需要判斷生物樣品中寨卡病毒的含量或拷貝數(shù)時，則在上述步驟1中還需設(shè)定 已知濃度/拷貝數(shù)的陽性對照，例如實施例4的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒。
[0082] 實施例4
[0083] 本實施例對實施例1的引物和探針、實施例2的試劑盒W及實施例3的檢測方法進 行了靈敏性驗證，具體包括如下步驟：
[0084] 1.構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒
[0085] 利用Vero細胞(購自ATCC)采用DMEM培養(yǎng)基(購自Gibco公司）培養(yǎng)寨卡病毒(常規(guī) 方法分離獲取，保存于深圳市第S人民醫(yī)院），待Vero細胞長到單層約80%密度時，將DMEM 培養(yǎng)基棄去并用PBS溶液(配制1 /15mo 1/L K出P04，即每升水中溶解9.078克K出P04，下同）漂 洗3次，按照MOI為0.5的病毒量將病毒液加入6孔板中，并補充一定量的無血清培養(yǎng)基至 0.5ml。將培養(yǎng)瓶放入37°C培養(yǎng)箱中解育比，在解育過程中每隔15min輕輕晃動培養(yǎng)瓶，待解 育結(jié)束后棄去解育液，PBS溶液洗兩次，然后加上2ml細胞維持液(含2 %血清的DMEM，DMEM即 山1化ecco's modified eagle medium)后繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀測細胞病變情況，待80%的細胞 出現(xiàn)細胞病變效應(yīng)(CPE)后，將培養(yǎng)瓶放入-80°C冰箱，反復(fù)凍融次后，將病毒液取出，W 300化pm離屯、5min，取病毒液上清-80°C保存?zhèn)溆?，然后按照QIAGEN公司的貨號為52904的 QIAamp Viral RNA Mini Kit RNA提取試劑盒的說明書，將病毒液上清進行病毒RNA提取。 [00化]采用Promega公司貨號為A5001 的GoScript Reverse Transcription System試劑 盒的試劑并按照試劑盒說明書對上述提取的RNA進行cDNA合成。上述合成的cDNA采用北京 康為世紀(jì)公司的貨號CW0690A的2XEs化q Master Mix進行PCR擴增，退火溫度為58°C，擴 增30個循環(huán)，引物為實施例1的ZIKV-F和ZIKV-R，濃度，上下游各0.化1，其它條件按照 說明書進行，擴增完成后，取產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，鑒定為陽性的產(chǎn)物片段用 Thermo公司的Gene JET PCR purification進行純化回收，并將產(chǎn)物片段克隆到Promega公 司貨號為Al 360的pGEM-T載體中構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒。
[0087] 2.樣品制備
[0088] 采用北京康為世紀(jì)公司的貨號為CW0500A的質(zhì)粒小量提取試劑盒的試劑并按照試 劑盒說明書提取標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，用化no化op 2000超微量分光光度計測定質(zhì)粒的濃度，通過 其分子量計算出拷貝數(shù)，然后依次制備10倍梯度稀釋至個位拷貝數(shù)的樣品，共計8個梯度， 拷貝數(shù)為：lxl0 8至lxlOi/化。
[00例 3.實時巧光PCR反應(yīng)
[0090] 采用hkara公司的貨號為RR064A的One St巧 PrimeScript ? RT-PCR Kit試劑盒 的試劑按照試劑盒說明書配制反應(yīng)液：取2X0ne Step RT-PCR Buffer III12.扣IJakara Ex Taq HS 0.Sul,PrimeScript RT Enzyme MixO.Sul,ROX Reference Dye or Dye II 0.扣l，20iiM的實施例1的上游引物和下游引物各0.扣l，20iiM的實施例1的探針0.扣1，化L上 述樣品，W及DEPC水祉1，加入至0.2mL PCR反應(yīng)管中，W超純水為陰性對照樣品，振蕩混勻 后瞬時離屯、數(shù)秒。將反應(yīng)管置于ABI公司的750(Fast巧光定量PCR儀上進行實時巧光PCR擴 增和檢測，所述實時巧光PCR擴增的程序如下：50°C 2min;95°C 10min;95°C 15s，55°C lmin,40個循環(huán)。
[0091] 檢測結(jié)果如圖I和3所示，上述引物、探針的qPCR檢測寨卡病毒的檢測下限為1〇1 (約為IO 2PFU),而陰性對照檢測不到Ct值，且Ct值與寨卡病毒拷貝數(shù)之間具有非常強的線 性關(guān)系(P<〇. 0001，r = 0.998，圖2)，表明用本發(fā)明的引物、探針的qPCR檢測寨卡病毒的靈敏 性非常強。
[0092] 實施例5
[0093] 本實施例對實施例1的引物和探針、實施例2的試劑盒W及實施例3的檢測方法進 行了特異性驗證。
[0094] 1.樣品制備
[00M]所用的供試材料如下:寨卡病毒、黃熱病毒、登革熱病毒和流感病毒的CDNA(均保 存于深圳市第S人民醫(yī)院，拷貝數(shù)均為10^化）
[0096] 同時設(shè)置陽性對照和陰性對照，陽性對照為寨卡病毒RNA(保存于深圳市第=人民 醫(yī)院，濃度是IO7拷貝/化），陰性對照為去離子水。
[0097] 2.實時巧光PCR反應(yīng)
[0098] W上述樣品為模板，進行實時巧光PCR反應(yīng)，實時巧光PCR反應(yīng)的方法和條件同實 施例4。
[0099] 檢測結(jié)果如圖3所示，從圖中可W看出，只有寨卡病毒的的CDNA樣品的Ct值為16， 呈陽性;黃熱病毒、登革熱病毒和流感病毒則檢測不到Ct值，均呈陰性；陽性對照有擴增曲 線，陰性對照無擴增曲線。由此證明本發(fā)明實施例1的引物、探針和實施例2的試劑盒均具 有高特異性;進一步的，本發(fā)明基于實施例1的引物、探針和實施例2的試劑盒建立的檢測方 法能夠準(zhǔn)確的對寨卡病毒進行檢測。
【主權(quán)項】
1. 一組引物和探針，其特征在于，其中一條引物包含SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列， 另一條引物包含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物和探針，其特征在于，所述探針為包含SEQ ID N0:3所示 的核苷酸序列； 任選的，所述探針?biāo)玫拇銣缁鶊F為TRAM、熒光基團為HEX。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的引物和探針在制備檢測寨卡病毒的產(chǎn)品中的應(yīng)用； 任選的，所述檢測寨卡病毒的產(chǎn)品還包括PCR擴增試劑； 任選的，所述PCR擴增試劑為熒光定量PCR試劑。4. 一種試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1或2所述的引物和探針。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于:還包括PCR擴增試劑； 任選的，所述PCR擴增試劑為熒光定量PCR試劑； 任選的，所述熒光定量PCR試劑包括來自Takara公司的貨號為RR064A的One Step PrimeScript? RT-PCR Kit試劑盒所包含的試劑； 任選的，所述來自Takara公司的貨號為RR064A的One Step PrimeScript? RT-PCR Kit 試劑盒所包含的試劑為2 X One Step RT-PCR Buffer III、Takara Ex Taq HS、 PrimeScript RT Enzyme Mix和ROX Reference Dye or Dye II中的至少一種； 任選的，還包括陽性對照和陰性對照； 任選的，還包括RNA提取試劑； 任選的，所述RNA提取試劑包括來自QIAGEN公司的貨號為52904的QIAamp Viral RNA Mini Kit RNA提取試劑盒所包含的試劑； 任選的，還包括逆轉(zhuǎn)錄試劑； 任選的，所述逆轉(zhuǎn)錄試劑包括來自Takara公司的貨號為RR064A的One Step PrimeScript? RT-PCR Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒所包含的試劑。6. 權(quán)利要求5所述的試劑盒在制備檢測寨卡病毒的產(chǎn)品中的應(yīng)用。7. -種篩選易患寨卡病毒病的生物樣品的系統(tǒng)，其特征在于，包括： 核酸提取裝置，所述核酸提取裝置用于提取所述生物樣品中的核酸樣本； 熒光定量PCR裝置，所述熒光定量PCR裝置與所述核酸提取裝置相連，適用于采用權(quán)利 要求1或2所述的引物和探針對所述核酸樣本進行熒光定量PCR反應(yīng);以及 判斷裝置，所述判斷裝置與所述熒光定量PCR裝置相連，以便基于熒光定量PCR反應(yīng)的 結(jié)果，判斷所述生物樣品是否易患寨卡病毒病。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的系統(tǒng)，其特征在于， 所述核酸提取裝置還用于提取已知濃度/拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒； 所述熒光定量PCR裝置還用于采用權(quán)利要求1或2所述的引物和探針對所述已知濃度/ 拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒進行熒光定量PCR反應(yīng)； 所述核酸提取裝置進一步包括:標(biāo)準(zhǔn)曲線測定裝置，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線測定裝置分別與所 述熒光定量PCR裝置和判斷裝置相連，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線測定裝置先將所述標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒在熒光 定量PCR裝置產(chǎn)生的Ct值與標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的濃度進行關(guān)聯(lián)并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所述判斷裝置將 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定裝置產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線與核酸樣本在熒光定量PCR裝置產(chǎn)生的結(jié)果進行比對， 判斷生物樣品中的寨卡病毒的含量或拷貝數(shù)； 任選的，所述核酸提取裝置進一步包括： RNA提取單元，所述RNA提取單元用于從生物樣品中提取RNA樣本；以及 逆轉(zhuǎn)錄單元，所述逆轉(zhuǎn)錄單元與所述RNA提取單元相連，用于對所述RNA樣本進行逆轉(zhuǎn) 錄反應(yīng)，以便獲得cDNA樣本，所述cDNA樣本構(gòu)成所述核酸樣本。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述生物樣品為包含有DNA和/或RNA的血 液、細胞或組織，或為質(zhì)粒，或為DNA、cDNA、mRNA或cDNA片段，或為含有DNA、cDNA、mRNA或 cDNA片段的試劑； 任選的，當(dāng)生物樣品為DNA、cDNA或cDNA片段，或為含有DNA、cDNA或cDNA片段的試劑，或 為質(zhì)粒時，將其直接作為核酸樣本與所述引物和探針對進行實時熒光PCR反應(yīng)； 任選的，當(dāng)生物樣品為含有DNA和/或RNA的血液、細胞或組織，或為mRNA，或為含有mRNA 的試劑時，將其轉(zhuǎn)化為DNA、cDNA或cDNA片段的核酸樣本再與所述引物和探針進行實時熒光 PCR反應(yīng)。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的系統(tǒng)，其特征在于： 所述實時熒光PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系如下： 2 XOne Step RT-PCR Buffer III 12 5 μL Takara Ex Taq HS 0 5 μL PrimeScript RT Lnz>me Mix 0.5 μL 引物SEQ ID NO : 1 和SBQ 丨D NO : 2 濃度為20μΜ，各0,5 μL 探針SEQ IDNO : 3 濃度為20μΜ，0 5μ1 ROX Reference Dye or Dye II 0 5 μL 以及DEPC水 8μ1; 所述2X0ne Step RT-PCR Buffer III、Takara Ex Taq HS、PrimeScript RT Enzyme Mix和ROX Reference Dye or Dye II均來自 Takara公司的貨號為RR064A的One Step PrimeScript? RT-PCR Kit試劑盒； 任選的，所述實時熒光PCR反應(yīng)的程序如下：50°C2min;95°C10min;95°C15s，55°Clmin， 40個循環(huán)。
【文檔編號】C12N15/11GK105838713SQ201610340665
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月20日
【發(fā)明人】劉映霞, 高福, 楊揚, 畢玉海, 王強, 鄭海霞
【申請人】深圳市第三人民醫(yī)院