一種用于臍帶血造血干細(xì)胞擴(kuò)增的培養(yǎng)體系及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于廝帶血造血干細(xì)胞擴(kuò)增的培養(yǎng)體系 及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 造血干細(xì)胞移植是治療白血病和淋己瘤等惡性腫瘤、代謝性疾病、自身免疫性疾 病及先天免疫缺陷等嚴(yán)重危害人類健康疾病的最有效治療方法之一。骨髓中造血干細(xì)胞 (服C)數(shù)量較低，移植后難W在患者體內(nèi)有效進(jìn)行造血重建，送也成為HSC臨床應(yīng)用的一個(gè) 瓶頸，而且約有30-40%的患者由于找不到相同HLA配型的供者而失去了治療的機(jī)會(huì)，廝帶 血（umbilical cord blood, UCB)是除骨髓和外周血干細(xì)胞外的另一種重要造血干細(xì)胞來(lái) 源，它的優(yōu)點(diǎn)是采集不影響供者、受巨細(xì)胞病毒（CMV)和邸病毒污染機(jī)會(huì)小、移植后急慢性 移植物抗宿主?。℅VHD)發(fā)生率低于成年供者的骨髓移植、可W建立廝帶血庫(kù)，隨時(shí)提供移 植所需要的HLA相合的干細(xì)胞。盡管UCB具有諸多優(yōu)點(diǎn)。但是由于一份廝帶血所含的細(xì)胞 數(shù)有限，送大大限制了其在臨床的廣泛應(yīng)用。體外擴(kuò)增是解決UCB送一缺陷的重要方法，因 而優(yōu)化UCB造血干/祖細(xì)胞化SPCs)的體外擴(kuò)增方案極為迫切。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 基于上述原因，申請(qǐng)人為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種更好地提高造血干細(xì)胞 在體外的生長(zhǎng)速度和擴(kuò)增效率W及CD34+CD45RA、CD34+LKS、CD34 LKS的比例的培養(yǎng)體系。
[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供一種通過(guò)在體外培養(yǎng)廝帶血細(xì)胞的體系中加 入不同的細(xì)胞因子和小分子化合物，從而能夠更好地提高造血干細(xì)胞在體外的生長(zhǎng)速度和 擴(kuò)增效率 W及 CD：M+CD45RA、CD：M+LKS、CD：M LKS 的比例。
[0005] 本發(fā)明通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
[0006] 一種用于廝帶血造血干細(xì)胞擴(kuò)增的培養(yǎng)體系，該培養(yǎng)體系包括AIM-V培養(yǎng)基、 SCF、Flt-3L，G-CSF，比-3, StemRegenin(SRl)，UM171，血小板裂解液。
[0007] 其特征在于各種細(xì)胞因子的組合和小分子化合物的聯(lián)合應(yīng)用。
[0008] 所述的用于廝帶血造血干細(xì)胞擴(kuò)增的培養(yǎng)體系，各組分的含量如下：
[0009]
[0010] 所述血小板裂解液的制備過(guò)程；采集的廝帶血40~150ml W 2:1比例緩慢加入盛 有淋己分離液的50ml離必管中，在4~25度溫度下，1500-3000巧m，離必10-20min，上層 為富含血小板血漿，采血袋或采血管中采用肝素作抗凝劑，上層的血清占總體積的45~ 50%。富含血小板的血漿放置于-80度超低溫冰箱凍存，12-24h后迅速取出放置25-37度 水浴中復(fù)蘇，如此反復(fù)2-5次。于4-25度W 2000~5000巧m離必10-30min，取上清液， 0. 22 U m過(guò)濾，W 0. 2-0. 5%的濃度添加到廝帶血造血干細(xì)胞擴(kuò)增體系中。
[0011] 其中化合物SRl和UM171的組合，濃度分別為IOO-1000 nM和lO-lOOnM。
[001引所述的用于廝帶血造血干細(xì)胞擴(kuò)增的培養(yǎng)體系，其中Angiopoietin-Uke protein 3 的添加，濃度為 30-200ng/mL。
[0013] SCF是一種作用于最早期造血干/祖細(xì)胞的造血細(xì)胞因子，在維持造血細(xì)胞存活， 促進(jìn)造血細(xì)胞增殖和分化，調(diào)控各系造血細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育中起著重要作用，而其它造血細(xì) 胞因子如G-CSF、Flt-化等都是作用于較晚期或晚期定向增殖分化的細(xì)胞。SCF單獨(dú)作用 刺激造血細(xì)胞增殖和促進(jìn)克隆形成能力都微弱，而與其它細(xì)胞因子有明顯協(xié)同促進(jìn)造血功 能等作用。
[0014] 1993年化Od等首先提出富血小板血漿，并發(fā)現(xiàn)富血小板血漿含豐富的血小板，其 數(shù)目比全血高3倍W上。血小板中含有大量的生長(zhǎng)因子，如血小板衍生生長(zhǎng)因子PDGF-AB， 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子目TGF-0，類膜島素生長(zhǎng)因子IGF,表皮生長(zhǎng)因子EGF，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 VEGF等，分泌后可促進(jìn)細(xì)胞的分裂和增殖、增加膠原的合成、激發(fā)血管長(zhǎng)入和誘導(dǎo)細(xì)胞分 化，本發(fā)明采用血小板裂解液培養(yǎng)造血干細(xì)胞，不僅為造血干細(xì)胞的生長(zhǎng)提供了生長(zhǎng)環(huán)境， 降低了培養(yǎng)體系中所需細(xì)胞因子的用量，也降低了使用FBS給臨床應(yīng)用帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)。
[0015] 嘿嶺衍生物StemRegenin (SRl)化合物被認(rèn)為可在體外促進(jìn)服PC擴(kuò)增。在體外培 養(yǎng)人廝帶血來(lái)源CD34+細(xì)胞時(shí)加入SRl及細(xì)胞因子SCF、TP0、Flt化、IL-6共培養(yǎng)5周后，與 相應(yīng)對(duì)照組相比，CD34+細(xì)胞增加了 47倍，相同條件下培養(yǎng)人外周血來(lái)源CD34+細(xì)胞3周即 可使CD34+細(xì)胞增加73倍。而一旦去除了 SRl后，細(xì)胞則迅速發(fā)生分化。通過(guò)集落形成實(shí) 驗(yàn)表明，加入SRl培養(yǎng)后可顯著提高各系細(xì)胞集落形成單位（CFU)形成。另外，值得注意的 是，SRl僅對(duì)人、猴、狗來(lái)源的HSPC發(fā)揮作用，而對(duì)小鼠來(lái)源HSPC無(wú)擴(kuò)增作用，提示SRl的 作用機(jī)制可能存在種屬特異性。將用送種方法擴(kuò)增的CD34+細(xì)胞植人免疫缺鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn) NOD-SCID重建細(xì)胞（SRC)增加了 17倍，并且均可保持多系細(xì)胞長(zhǎng)期重建能力。送也是現(xiàn)有 小分子化合物中體外擴(kuò)增HSPC效果最為顯著的小分子化合物。
[0016] 近期研究表明，SRl可抑制細(xì)胞色素 P4501B1 (CYPlBl)和香姪受體抑制物（AHRR) 的表達(dá)，兩者在轉(zhuǎn)錄水平均受到芳香姪受體（AhR)的調(diào)節(jié)，證明SRl可能作為一種枯抗劑作 用于AhR信號(hào)通路。芳姪受體（AhR)枯抗劑和配體興奮劑可促進(jìn)人廝帶血細(xì)胞體外擴(kuò)增， 送些細(xì)胞移植入免疫缺陷型小鼠體內(nèi)后，小鼠的重建造血能力可維持16周。
[0017] SRl的分子結(jié)構(gòu)式：
[0018]
[0019] 與嘿嶺衍生物類似，研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)化學(xué)相關(guān)的小分子家族嚼巧剛巧分子UM171， 它們可W在免疫缺陷型小鼠體內(nèi)擴(kuò)增造血干細(xì)胞，并維持重建造血功能長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月，此化 合物可獨(dú)立抑制芳姪受體，從而更大限度地是造血干細(xì)胞發(fā)揮再生潛能。
[0020] 嚼巧剛巧UM171的分子結(jié)構(gòu)式如下：
[0021]
[0022] 造血干祖細(xì)胞可細(xì)分為免疫表型為CD34 LKS的長(zhǎng)期造血重建的干細(xì)胞化T-服C)、 免疫表型為CD34+LKS的短期造血重建的干細(xì)胞（ST-服C)和免疫表型為L(zhǎng)KS-的祖細(xì)胞。服C 不表達(dá)各系特異性抗原Lin,包括B-G-M-T等度細(xì)胞分化抗原B220、粒細(xì)胞分化抗原Gr-I、 單核細(xì)胞分化抗原Mac-UT細(xì)胞分化抗原CD4和CD8)，但高水平表達(dá)Sca-I和C-kit，簡(jiǎn)稱 LKS(Lin-Sca-l+-C-kit+)。服C功能在移植模型中可W得到證實(shí)，CD34 LKS在經(jīng)照射處理 的小鼠體內(nèi)能重建長(zhǎng)期造血，具備干細(xì)胞自我更新的特性，其自我更新能力可保持于整個(gè) 生命過(guò)程。CD34+LKS在造血發(fā)育過(guò)程中更成熟，自我更新能力只能維持約數(shù)周的時(shí)間。因 此，在維護(hù)和擴(kuò)增長(zhǎng)期造血干細(xì)胞化T-HSCs)時(shí)，大量擴(kuò)增此種祖細(xì)胞具有很好的發(fā)展前 景。不幸的是，多數(shù)擴(kuò)增系統(tǒng)提供的數(shù)據(jù)顯示，W長(zhǎng)期造血干細(xì)胞化T-HSCs)的丟失來(lái)獲取 祖細(xì)胞的擴(kuò)增，送樣就增加了晚期移植失敗的風(fēng)險(xiǎn)。
[0023] 血管生成素樣蛋白（ANGPTL)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類新的分泌性糖蛋白。雖然 ANGP化與血管生成素（Ang)在組成上具有一定的同源性，也具有相似的結(jié)構(gòu)域，但在功 能上與Ang又有明顯的不同。已有大量研究數(shù)據(jù)證實(shí)，在Sca-rCD45+造血干細(xì)胞體外培 養(yǎng)過(guò)程中，血管生成素樣蛋白An甜tl3的添加，不僅能夠顯著刺激長(zhǎng)期再生造血干細(xì)胞 (LT-服C)的增殖，還對(duì)短期造血干細(xì)胞（ST-服C)的增殖有一定的作用。
[0024] 本發(fā)明所述AIM-V培養(yǎng)基購(gòu)自life technology公司，所述SCF購(gòu)自peprotech 公司，所述Flt-：3L購(gòu)自peprotech公司，所述G-CSF購(gòu)自peprotech公司，所述IL-3購(gòu)自 口巧1'〇16油公司，所述5161111?6旨6]1；[]1(51?1)購(gòu)自美國(guó)36116。4公司，所述刪171由加拿大蒙特 利爾大學(xué)Guy Sauvageau教授實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)予，所述ANGPTL3購(gòu)自P巧；TOtech公司。
[0025] 本發(fā)明提供的血小板裂解物的制備及使用方法具有W下特點(diǎn)；（1)本發(fā)明提供的 方法制備的培養(yǎng)基不需要添加 FBS，亦可支持造血干細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)，在臨床應(yīng)用時(shí)降低 了異體血清帶來(lái)的過(guò)敏反應(yīng)或變態(tài)反應(yīng)。（2)血小板裂解后不僅釋放存在于血小板內(nèi)部 的生長(zhǎng)因子，而且去除了細(xì)胞結(jié)構(gòu)并降低了免疫原性，為異體移植提供了條件，具有比富 小板血漿更為廣闊的前景。血小板裂解物中含有多種生長(zhǎng)因子，如TGF、IGF、PDGF、VEGF、 FGF等，更能支持造血干細(xì)胞的生長(zhǎng)，降低了擴(kuò)增造血干細(xì)胞所需要的細(xì)胞因子的用量的 1/2~-1/3。（3)本發(fā)明制備的血小板裂解液的制備方法不同于常規(guī)的制備，節(jié)省了操作步 驟，分離效率更高。
[0026] 本發(fā)明為了提高擴(kuò)增體系中CD34+LKS、CD34 LKS的比例，添加了血管生成素樣蛋 白 3(Angiopoietin-l;Lke protein 3)，濃度為 30-200ng/mL。
[0027] 本發(fā)明為了提高擴(kuò)增體系中CD34+CD45RA的比例及擴(kuò)增倍數(shù)，添加了小分子化合 物SRl和UM171的組合，濃度分別為IOO-1000 nM和lO-lOOnM。
[0028] SCF 即為 stem cell factor,干細(xì)胞生長(zhǎng)因子；Flt-3L 即為 FMS-Iike tyrosine kinase 31 igand, FMS 樣酪氨酸激酶 3 配體；G-CSF 即為 Granuloc}fte colony-stimulating factor,粒細(xì)胞集落細(xì)胞刺激因子；比-3即為Interleukin 3,白介素-3 ;SR1即為 StemRegenin-I,嘿嶺霉素衍生物，是一種小分子雜環(huán)化合物；UM171是一種嚼巧剛巧分 子，被命名為UM-171;Angiopoietin-l化e protein 3為血管樣生成蛋白3;PDGF-AB即 為Platelet-derived growth factor-AB,血小板衍生生長(zhǎng)因子AB ;TGF-目即為轉(zhuǎn)化生 長(zhǎng)因子目，Transforming growth factor beta ;VEGF即為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，Vas州Iar endothelial growth factor ;IGF 即為類膜島素生長(zhǎng)因子，Insulin-Uke growth factor; EGF 即為表皮生長(zhǎng)因子，Epidermal growth factor。
【附圖說(shuō)明】
[0029] 1、圖1是本發(fā)明培養(yǎng)體系與傳統(tǒng)培養(yǎng)體系擴(kuò)增培養(yǎng)造血干細(xì)胞CD34+CD45RA的 比例變化曲線。其中橫坐標(biāo)代表天數(shù)，縱坐標(biāo)代表CD34+CD45RA-細(xì)胞的百分比； ……代表本發(fā)明培養(yǎng)系統(tǒng)，代表傳統(tǒng)培養(yǎng)系統(tǒng)。
[0030] 圖2是本發(fā)明培養(yǎng)體系與傳統(tǒng)培養(yǎng)體系擴(kuò)增培養(yǎng)造血干細(xì)胞CD34+LKS細(xì)胞的百 分比變化情況。其中橫坐標(biāo)代表不同天數(shù)，分別為第4天、第12天、第15天，縱坐標(biāo)代表 CD34+LSK細(xì)胞的百分比；□代表本發(fā)明培養(yǎng)系統(tǒng)，踩代表傳統(tǒng)培養(yǎng)系統(tǒng)。
[0031] 圖3本發(fā)明培養(yǎng)體系與傳統(tǒng)培養(yǎng)體系擴(kuò)增培養(yǎng)造血干細(xì)胞CD34 LKS細(xì)胞的百分 比變化情況。其中其中橫坐標(biāo)代表不同天數(shù)，分別為第4天、第12天、第15天，縱坐標(biāo)代表 CD34 LSK細(xì)胞的百分比；□代表本發(fā)明培養(yǎng)系統(tǒng)，湯.代表傳統(tǒng)培養(yǎng)系統(tǒng)。
[0032] 圖4本發(fā)明培養(yǎng)體系與傳