一種柳枝稷SBP-box類轉(zhuǎn)錄因子在增加植物生物量和可發(fā)酵糖產(chǎn)量方面的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及柳枝稷SBP-box類轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子PvSPLl和2及其編碼基因的改造，提高柳枝稷生物量及其可發(fā)酵糖產(chǎn)量。
【背景技術(shù)】
[0002]化石能源的過度消耗使得新能源開發(fā)成為必要。其中，生物質(zhì)能具有資源豐富、環(huán)保清潔且可再生等特點(diǎn)。目前的研究多集中于生物柴油和生物乙醇兩大類，其中，生物乙醇的開發(fā)利用已逐步實(shí)現(xiàn)商業(yè)化。柳枝稷(Panicum virgatum L.)屬多年生C4高大草本植物，主要用作能源草和牧草，是重要的纖維生物質(zhì)資源。增加柳枝稷生物量和可發(fā)酵糖產(chǎn)量是提高其生物質(zhì)能開發(fā)利用的重要手段。柳枝稷全基因組測序的完成和表達(dá)芯片數(shù)據(jù)庫的公布，為功能基因的挖掘和驗(yàn)證提供了資源保證。
[0003]SQUMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-1ike(SPL)轉(zhuǎn)錄因子含有一個(gè)保守的SBP-box核心結(jié)構(gòu)域，是一類植物特異的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族。另外，超過1/2的SBP-box家族基因含有miR156的靶位點(diǎn)，在轉(zhuǎn)錄后水平上受到miR156的嚴(yán)格調(diào)控。因此超表達(dá)miR156之后，含miR156靶位點(diǎn)的SPL基因表達(dá)量會(huì)顯著降低。目前的研究表明，SPL基因功能廣泛，參與植物生長發(fā)育的各個(gè)階段以及生理生化反應(yīng)的多個(gè)途徑，主要涉及植物花期調(diào)控、分蘗發(fā)生、株型建成和生物/非生物脅迫響應(yīng)等過程。植物中最早鑒定出的SPL基因是從金魚草中分離出的SBPl和SBP2基因(Klein et al, A new family of DNA-binding proteins includesputative transcript1nal regulators of the Antirrhinum majus floral meristemidentity gene SQUAMOSA.1996，Molecular and General Genetics, 259: 7_16)D擬南芥和水稻中分別含有17和19個(gè)SPL基因，其中含miR156靶位點(diǎn)的均有11個(gè)基因。目前研究較為深入的是SPL基因調(diào)控開花時(shí)間，影響植物由營養(yǎng)生長時(shí)期向生殖生長時(shí)期的過渡。而對(duì)于株型建成和分蘗發(fā)生方面的研究還尚未有系統(tǒng)研究，AtSPL9和AtSPL15被報(bào)道與擬南芥的蓮座葉增多相關(guān)(Schwarz et al，The microRNA regulated SBP-box genes SPL9 andSPL15 control shoot maturat1n in Arabidopsis.2008， Plant Molecular B1logy,67: 183-195)，0sSPL14參與水稻分蘗發(fā)生(Luo et al, Control of tiller growth ofrice by 0sSPL14 and strigolactones，which work in two independent pathways.Plant and Cell Phys1logy, 2012，53: 1793-1801)。而柳枝稷中過量表達(dá)miR156之后，分蘗數(shù)目增多、生物量和可發(fā)酵糖產(chǎn)量增加(Fu et al，Overexpress1n of miR156 inswitchgrass (Panicum virgatum L.) results in var1us morphologicala Iterat1ns and leads to improved b1mass product1n.2012，PlantB1technology Journal， 10: 443-452)0
[0004]通過植物基因工程改良植物生物量的研究相對(duì)較少，過量表達(dá)miR156增加植物分枝或分蘗數(shù)目是當(dāng)前研究的一個(gè)熱點(diǎn)。SPL基因作為miRNA156的直接靶基因，其調(diào)控植物分枝或分蘗的機(jī)制尚不清楚。本發(fā)明主要針對(duì)柳枝稷的PvSPLl和2基因，通過嵌合抑制子沉默技術(shù)將PvSPLl和2轉(zhuǎn)變成高效的負(fù)調(diào)控子，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)柳枝稷分蘗發(fā)生的調(diào)控，獲得生物量和可發(fā)酵糖產(chǎn)量增加的轉(zhuǎn)基因柳枝稷植株，這對(duì)于柳枝稷和其他禾本科植物的遺傳育種和定向分子設(shè)計(jì)具有重要的指導(dǎo)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種柳枝稷SBP-box類轉(zhuǎn)錄因子PvSPLl和2的編碼基因；其核苷酸序列和氨基酸序列分別如SEQ ID N0.1、2和SEQ ID N0.3、4所示?？紤]到密碼子的簡并性，在不改變氨基酸序列的前提下，對(duì)上述核苷酸序列進(jìn)行同義突變，也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0006]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種針對(duì)柳枝稷SBP-box類轉(zhuǎn)錄因子PvSPLl和2的SRDX融合片段，其核苷酸序列如SEQ ID N0.5和6所示。利用此融合片段能夠顯著增加柳枝稷分蘗數(shù)目，以增加其生物量。
[0007]本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種柳枝稷SBP-box類轉(zhuǎn)錄因子PvSPLl和2的嵌合抑制子沉默表達(dá)載體，該表達(dá)載體克隆上述如SEQ ID N0.5和6的融合片段。
[0008]本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供柳枝稷SBP-box類轉(zhuǎn)錄因子PvSPLl和2在調(diào)控柳枝稷分蘗發(fā)生方面的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供所述的針對(duì)柳枝稷SBP-box類轉(zhuǎn)錄因子PvSPLl和2的SRDX融合片段在增加柳枝稷生物量及可發(fā)酵糖產(chǎn)量方面的應(yīng)用。
[0010]所述柳枝稷PvSPLl和2的SRDX融合片段，基于Gatewiy技術(shù)重組整合入超表達(dá)載體PANIC 6B中；采用農(nóng)桿菌AGLl介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將超表達(dá)載體導(dǎo)入柳枝稷胚性愈傷細(xì)胞中，通過潮霉素抗性篩選，獲得抗性再生植株，并通過PCR分析最終確定陽性轉(zhuǎn)基因植株；分蘗數(shù)目統(tǒng)計(jì)、生物量及可發(fā)酵糖產(chǎn)量測定結(jié)果表明，PvSPLl和2能夠顯著增加柳枝稷分蘗數(shù)目、生物量和可發(fā)酵糖產(chǎn)量。
[0011]本發(fā)明的核心特點(diǎn)和發(fā)明理念包括:
1、通過嵌合抑制子沉默技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)柳枝稷SBP-box類轉(zhuǎn)錄因子PvSPLl和2的改造，使其成為高效的負(fù)調(diào)控子，能夠克服由于柳枝稷中功能冗余基因的存在而造成的抑制效果不顯著問題；
2、本發(fā)明針對(duì)柳枝稷分蘗數(shù)目這一影響生物量高低的主要性狀，通過先進(jìn)的基因工程技術(shù)對(duì)其進(jìn)行調(diào)控，能夠在短期內(nèi)獲得顯著效果。
[0012]本發(fā)明的有益效果如下:
1、本發(fā)明中獲得的柳枝稷SBP-box類基因PvSPLI和2，是調(diào)控柳枝稷分蘗的關(guān)鍵基因，這對(duì)于通過分子定向設(shè)計(jì)獲得理想能源植物株型具有重要貢獻(xiàn)；
2、本發(fā)明中對(duì)PvSPLl和2進(jìn)行分子調(diào)控，能夠顯著增加柳枝稷的生物量和可發(fā)酵糖產(chǎn)量，對(duì)于能源植物和禾本科牧草的生物量和可發(fā)酵糖產(chǎn)量的遺傳改良具有重要的參考意義；
3、本發(fā)明中所產(chǎn)生的遺傳改良植物能夠整合到常規(guī)育種項(xiàng)目，從而為能源植物和禾本科牧草作物的品種培育提供新的種質(zhì)資源。
【附圖說明】
[0013]圖1柳枝稷pANIC6B-PvSPL2_SRDX融合片段的過表達(dá)載體簡圖；
圖2轉(zhuǎn)PvSPL2-SRDX基因植株的PCR鑒定。M表示DNA Marker，1-16表示轉(zhuǎn)pANIC6B_PvSPL2-SRDX的柳枝稷植株，WT-表示未轉(zhuǎn)基因的野生型柳枝稷植株。hph為PvSPL2-SRDX載體上攜帶的植物抗性篩選標(biāo)記基因。
[0014]圖3轉(zhuǎn)PvSPL2_SRDX基因植株的qRT-PCR分析。CtrlP表示轉(zhuǎn)pANIC6B空載體植株，TSPL2-1 /-2/-3分別表示三個(gè)獨(dú)立的陽性轉(zhuǎn)基因株系。
[0015]圖4轉(zhuǎn)基因陽性植株的表型(A)和分蘗數(shù)目(B)XtrlP表示轉(zhuǎn)pANIC6B空載體植株，TSPL2-1 /-2/-3分別表示三個(gè)獨(dú)立的陽性轉(zhuǎn)基因株系。
[0016]圖5轉(zhuǎn)基因植株的干物質(zhì)生物量測定。CtrlP表示轉(zhuǎn)pANIC6B空載體植株，TSPL2-1/-2/-3分別表示三個(gè)獨(dú)立的陽性轉(zhuǎn)基因株系。
[0017]圖6轉(zhuǎn)基因植株的可發(fā)酵糖產(chǎn)量測定。(:壯讓表示轉(zhuǎn)?4犯068空載體植株33?1^2-1/-2/-3分別表示三個(gè)獨(dú)立的陽性轉(zhuǎn)基因株系。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面以針對(duì)PvSPL2的嵌合抑制子沉默增加柳枝稷分蘗數(shù)目、生物量和可發(fā)酵糖產(chǎn)量為實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑、雙元載體和農(nóng)桿菌等，如無特殊說明，均可從公司通過商業(yè)途徑購到，所述的MS基本培養(yǎng)基購自PhytoTechnology Laboratories(貨號(hào)M519)。
[0019]實(shí)施例l:PvSPL2基因的克隆與序列測定
取低地型柳枝稷AIamo的嫩莖部位，用TriZoI Reagent( Invitrogen公司，貨號(hào)15596026)提取嫩莖總RNA，使用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測總RNA的含量和純度，取2.0 yg總RNA做逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，所采用的逆轉(zhuǎn)錄酶為M-MLV(Promega公司，貨號(hào)M1701)，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的步驟參考該逆轉(zhuǎn)錄酶的使用說明。以逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成的第一鏈cDNA為模板，使用引物:
5’- ATGGGTTCATTTGGGATGGAC-3’
5，- AAGCGTCAGTGCATCAGGTCATAG-3，
進(jìn)行常規(guī) PCR 擴(kuò)增；PCR 反應(yīng)體系為:2 yL cDNA，5 yL 10 X Buffer，4 yL dNTP(2.5mM)，正/反向引物(10 μΜ)各I yL，0.5