一株能促進(jìn)臺(tái)灣相思生物量增長(zhǎng)的內(nèi)生真菌的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一株能促進(jìn)臺(tái)灣相思生物量增長(zhǎng)的內(nèi)生真菌。所述內(nèi)生真菌為絲黑粉菌屬（Filobasidium）B，已于2016年1月27日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心登記保藏，保藏號(hào)為CGMCC No. 11910。將臺(tái)灣相思內(nèi)生真菌B接種于臺(tái)灣相思土培苗，測(cè)定接種60天后的臺(tái)灣相思的生物量，臺(tái)灣相思內(nèi)生真菌B所處理的植株與對(duì)照的生物量差異極顯著，生物量比較顯示，該菌株較對(duì)照組的促生效果良好，其生物量為對(duì)照組的1.4倍；根冠比比較顯示，該菌株的根冠比為對(duì)照的1.5倍，表明該菌株對(duì)臺(tái)灣相思生物量的增長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用。CGMCC No. 1191020160127
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一株能促進(jìn)臺(tái)灣相思生物量増長(zhǎng)的內(nèi)生真菌
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一株能促進(jìn)臺(tái)灣相思生物量增長(zhǎng)的內(nèi)生真菌。
【背景技術(shù)】
[0002]植物內(nèi)生菌的研究始于19世紀(jì)末，Vogl從黑麥草Lolium temuIenturn L.種子中分離出第一株內(nèi)生菌。但真正開(kāi)始大量研究植株中的內(nèi)生菌起始于上世紀(jì)八十年代，主要是在溫帶地區(qū)、亞熱帶地區(qū)和熱帶地區(qū)的植被中開(kāi)展研究。
植物內(nèi)生真菌的分布廣、種類(lèi)多，前人研究表明從絕大多數(shù)植物體內(nèi)都能分離得到內(nèi)生真菌，由此可見(jiàn)內(nèi)生真菌普遍存在于植物體內(nèi)。在全世界范圍內(nèi)至少在80多個(gè)屬290多種的禾本科農(nóng)作物中發(fā)現(xiàn)了內(nèi)生菌。目前從植物中分離的內(nèi)生菌根據(jù)其具有的獨(dú)特功能可以分為:固氮菌、固鉀菌、固磷菌等植物促生菌、具有抗病蟲(chóng)害的生防菌和具有促進(jìn)植物對(duì)不良環(huán)境的修復(fù)能力的抗性菌。
有關(guān)內(nèi)生真菌對(duì)臺(tái)灣相思生長(zhǎng)的影響研究還存在空白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一株菌株能促進(jìn)臺(tái)灣相思生物量增長(zhǎng)的內(nèi)生真菌，該真菌為絲黑粉菌屬(Filobasidium)B，已于2016年I月27日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心登記保藏，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏號(hào)為CGMCC N0.11910ο
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
該菌的分離、純化包括:
Α、材料:將采集得到不同年份的根、枝莖、葉分成三個(gè)部分，用自來(lái)水清洗干凈，分裝到自封袋內(nèi)，于4°C冰箱保存；
B、消毒:75%酒精漂洗30s—無(wú)菌水沖洗3-4次—15%的次氯酸鈉漂洗(根1min，莖5min，葉2min)—無(wú)菌水沖洗4-5次。當(dāng)樣品最后一次浸洗后的水盛于滅菌的小燒杯中，在平板上劃線作為對(duì)照，以檢驗(yàn)樣品的消毒是否徹底，若干天后如有菌落生成，則表明樣品表面消毒不徹底，需繼續(xù)調(diào)整消毒方法；
C、接種部位的選擇:葉片:葉尖部、葉中部和葉基部3個(gè)處理;枝莖:上中下分為3部位，其中第3部位為枝莖交接處;根部:分為根尖和根基2個(gè)部分；
D、接種:將消毒后的外植體用接種刀切開(kāi)，鋪放在培養(yǎng)基表面，于28°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5—7天后觀察菌落生長(zhǎng)狀況。有的菌株繁殖迅速，可先將其產(chǎn)生的菌株進(jìn)行分離純化；生長(zhǎng)緩慢且數(shù)量較少的菌株可延長(zhǎng)觀察時(shí)間，直到其生長(zhǎng)穩(wěn)定后純化；
固體培養(yǎng):使用改良馬丁固體培養(yǎng)基，配方為蛋白胨5.(^/1、酵母浸出粉2.(^/1、葡萄糖20.0g/L、磷酸氫二鉀1.0g/L、硫酸鎂0.5g/L、瓊脂14.0g/L、其它為無(wú)菌水，pH值6.4土
0.2，培養(yǎng)溫度為28 0C，培養(yǎng)方式為平板培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為48h;
E、將分離繁殖出的不同種類(lèi)的內(nèi)生真菌接入平板培養(yǎng)基進(jìn)行純化，經(jīng)過(guò)2-3次點(diǎn)接純化、轉(zhuǎn)接后分別得到單一菌種的上述的Fi 1basidium功能菌株；
上述的一種能促進(jìn)臺(tái)灣相思生物量增長(zhǎng)的內(nèi)生真菌應(yīng)用菌液的制備方法，是將上述的菌株接入液體培養(yǎng)基，搖床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為280C，培養(yǎng)時(shí)間48?72h，利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算菌液濃度，將菌液用超純水稀釋成1.0-9.0 X 106cfu/ml即為成品備用;液體培養(yǎng)基:為改良馬丁培養(yǎng)基，其中蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氫二鉀
1.0g/L、硫酸鎂0.5g/L、其它為無(wú)菌水、pH值6.4 ± 0.2。
上述的一種能促進(jìn)臺(tái)灣相思生物量增長(zhǎng)的內(nèi)生真菌應(yīng)用菌液的應(yīng)用方法，是應(yīng)用該菌株的菌液澆施于臺(tái)灣相思苗木根際土壤或苗木直接接種。
上述的一種能促進(jìn)臺(tái)灣相思生物量增長(zhǎng)的內(nèi)生真菌應(yīng)用菌液的應(yīng)用方法，是用5.5X106cfu/ml菌液，按每株I OOml在林地澆于每株臺(tái)灣相思的根際。
本發(fā)明涉及的菌株是從臺(tái)灣相思植株中分離純化得到的，經(jīng)接種于臺(tái)灣相思土培苗，根據(jù)各項(xiàng)指標(biāo)綜合評(píng)判，進(jìn)一步證實(shí)其對(duì)植株生長(zhǎng)具有促進(jìn)臺(tái)灣相思生物量增長(zhǎng)的作用，尋找到對(duì)促進(jìn)植株生物量增長(zhǎng)的有益的功能內(nèi)生真菌可應(yīng)用于生產(chǎn)。
[0004]通過(guò)菌液澆施的方法接種于臺(tái)灣相思幼苗，測(cè)定初接種4月時(shí)和接種60天6月時(shí)的臺(tái)灣相思的生物量、根冠比。臺(tái)灣相思內(nèi)生真菌B所處理的植株與對(duì)照的生物量、根冠比差異顯著。生物量比較顯示，菌株B處理較對(duì)照組的促生效果良好，其生物量為對(duì)照組的1.4倍。根冠比比較顯示，菌株B的根冠比為對(duì)照的1.5倍。表明菌株B對(duì)臺(tái)灣相思生物量的增長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用。
【附圖說(shuō)明】
[0005]圖1為不同處理對(duì)臺(tái)灣相思幼苗生物量的影響；
圖2為不同處理對(duì)臺(tái)灣相思幼苗根冠比的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0006]根際土壤澆施與苗木直接接種應(yīng)用
本試驗(yàn)采用土培盆栽試驗(yàn)，試驗(yàn)所用材料為福建省漳州市市林業(yè)局提供的臺(tái)灣相思一年生苗。選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的臺(tái)灣相思苗木定植于直徑15cm，高1cm的塑料盆中。所用土壤是嚴(yán)格經(jīng)過(guò)熏蒸消毒的黃心土。經(jīng)過(guò)混勻稱(chēng)量，每盆放入等量的3kg 土壤。經(jīng)過(guò)一個(gè)月的恢復(fù)性生長(zhǎng)后，連續(xù)三天于臺(tái)灣相思根際施入濃度為5.5 X 106cfu/ml的10mL菌液，用蒸餾水溶液作為空白對(duì)照。
[0007]菌液制備:將供試菌株接入40mL的液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基為改良馬丁培養(yǎng)基，其中蛋白胨5.(^/1、酵母浸出粉2.(^/1、葡萄糖20.(^/1、磷酸氫二鉀1.(^/1、硫酸鎂0.58/1、其它為無(wú)菌水、PH值6.4±0.2，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中經(jīng)過(guò)72h的培養(yǎng)。用無(wú)菌生理鹽水按十倍稀釋法將菌液稀釋?zhuān)醚蛴?jì)數(shù)板計(jì)算菌液濃度配制成5.5 X 106cfu/mL。接種60天后進(jìn)行苗尚、地徑等指標(biāo)的測(cè)定，檢測(cè)方法如下:
生物量的測(cè)定
將植株的不同部位分別放入信封中并標(biāo)上記號(hào)，放入烘箱105°C烘干半小時(shí)(鈍化酶)，在60 0C下烘干，經(jīng)過(guò)12h后，稱(chēng)重后再放入烘箱中，重復(fù)測(cè)定直至恒重為止。稱(chēng)得樣品的重量(W)，即為樣品干重，以此表示植株的生物量，精確到0.0lg。
[0008]結(jié)果與分析
不同處理對(duì)臺(tái)灣相思生物量和根冠比的影響
生物量是反映苗木生產(chǎn)力水平的重要指標(biāo)，它與苗木的生長(zhǎng)發(fā)育存在著非常密切的關(guān)系。如圖1所示，接種菌株B的幼苗的生物量比對(duì)照組大37.12%，且與對(duì)照組間呈極顯著的差異性(sig=0.008，顯著水平為0.01)，由此可得，菌株對(duì)臺(tái)灣相思幼苗的生物量的增長(zhǎng)具有極顯著的促進(jìn)作用。圖2所示，接種菌株B的幼苗的根冠比對(duì)照組大46.89%，且與對(duì)照組間極顯著的差異性(sig=0.005，顯著水平為0.01)，說(shuō)明菌株B對(duì)臺(tái)灣相思幼苗根冠比的增大具有極顯著的促進(jìn)作用。
[0009]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)兩株混合菌株能促進(jìn)臺(tái)灣相思苗生物量增長(zhǎng)的內(nèi)生真菌，將該株臺(tái)灣相思內(nèi)生真菌菌株采用澆根的方法接種于臺(tái)灣相思幼苗。通過(guò)對(duì)植株的生物量、根冠比的測(cè)定，得出接種該菌株的處理的生物量、根冠比增長(zhǎng)均較大程度高于對(duì)照，表明其對(duì)于促進(jìn)植株生物量的增長(zhǎng)具有很大功用，從而進(jìn)一步證實(shí)得到該株內(nèi)生真菌能促進(jìn)臺(tái)灣相思生物量的增長(zhǎng)。
[0010]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專(zhuān)利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一株能促進(jìn)臺(tái)灣相思生物量增長(zhǎng)的內(nèi)生真菌，其特征在于:該真菌為絲黑粉菌屬斤;11(^38丨(1;[11111)13，已于2016年1月27日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心登記保藏，保藏號(hào)為CGMCC N0.11910。2.—種如權(quán)利要求1所述的一株能促進(jìn)臺(tái)灣相思生物量增長(zhǎng)的內(nèi)生真菌的應(yīng)用菌液，其特征在于:所述應(yīng)用菌液的制備方法，將所述的絲黑粉菌屬(Filobasidi um) B菌株接入液體培養(yǎng)基，搖床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為280C，培養(yǎng)時(shí)間48?72h，利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算菌液濃度，將菌液用超純水稀釋成1.0-9.0X 106cfu/ml，備用;液體培養(yǎng)基:為改良馬丁培養(yǎng)基，其中蛋白胨5.(^/1、酵母浸出粉2.(^/1、葡萄糖20.(^/1、磷酸氫二鉀1.(^/1、硫酸鎂0.58/1、其它為無(wú)菌水、pH值6.4±0.2。3.—種如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用菌液的用途，其特征在于:所述應(yīng)用菌液用于臺(tái)灣相思苗木根際土壤澆施或苗木直接接種。
【文檔編號(hào)】A01P21/00GK105861334SQ201610452938
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年6月22日
【發(fā)明人】李鍵, 林晗, 周艷芬, 陳燦, 謝安強(qiáng), 范海蘭
【申請(qǐng)人】福建農(nóng)林大學(xué)