鏈間交換由支架dna達成的核酸結構及其合成方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及DNA納米技術領域的核酸結構及其合成方法。更具體地講，涉及利用支 架DNA達成的鏈交換合成納米級別可控大小、形狀、復雜度的二維和三維核酸結構的方法和 核酸結構本身?；谒媒Y構中每條短鏈DNA的可尋址性，可以獲得具有特定孔穴和修飾的 核酸結構。
【背景技術】
[0002] 上世紀八十年代，Seeman首次提出利用DNA堿基互補配對的原則可將DNA組裝成復 雜的空間結構，開創(chuàng)了利用DNA作為納米級構筑材料而非遺傳信息載體的新領域，并將其命 名為DNA納米技術。隨后，研究人員通過構造不同基元模塊，如DX(double-crossover)、TX (triple-crossover)模塊、、十字模塊和對稱模塊，并用模塊組裝得到各式各樣的圖形結構 (二維陣列，方形網(wǎng)格等），但模塊法組裝是借助于小結構單元的堿基互補配對連接成較大 的圖形結構，其尺寸和形狀難以精確控制。
[0003] 2006年，Rothemund提出了一個全新的名詞："DNA折紙術"（DNA origami)。他將一 條基因組DNA長鏈(M13mpl8)與數(shù)百條短鏈DNA混合，通過在特定位置的堿基互補配對進行 折疊連接，得到了三角形、五角星、笑臉等宛如折紙作品一般令人驚嘆的復雜二維結構，比 通過模塊DNA自組裝方法得到的結構更為精密，堪稱DNA納米技術一次里程碑式的突破。
[0004] 其后，基于DNA折紙術的成果層出不窮。2007年，William shih等人將M13mpl8支架 折疊成六旋轉納米管，首次用DNA構造出三維結構，實現(xiàn)了由二維圖形到三維結構的突破。 2009年，他們在納米管的基礎上提出蜂窩褶狀模型，依次構建了橋式、瓶頸等多個單體和組 合結構。在隨后研究中，他們又通過在每個單元內增刪堿基，實現(xiàn)了圖形整體扭曲或彎折角 度的精確控制，將三維DNA折紙術推向了一個新的高度。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的，就是為了提供一種鏈間交換由支架DNA達成的核酸結構及其制備 方法和用途。
[0006] 本發(fā)明的目的可以通過以下技術方案來實現(xiàn):一種鏈間交換由支架DNA達成的核 酸結構，是通過支架DNA達成鏈間交換形成的具有可控大小和形狀的二維或三維核酸結構， 該核酸結構包括一組平行的雙螺旋和一段單鏈DNA，所述雙螺旋由支架DNA通過折疊、鏈間 交換與多條短鏈DNA進行特異性匹配，經(jīng)由退火反應形成，單鏈DNA為支架DNA中未形成雙螺 旋的部分。
[0007] 所述支架DNA包括M13mpl8或其他指定序列的單鏈DNA;M13mpl8為ml3噬菌體基因 組DNA中一個環(huán)狀單鏈DNA分子，共含有7249個核苷酸，其序列如SEQ ID N01所示。
[0008] 所述的鏈間交換指的是支架DNA在相鄰雙螺旋相同位置的一對鏈交換位點處進行 連接的行為。即在核酸結構每行雙螺旋間隔一定距離處設置多個鏈交換位點對，支架DNA的 折疊路徑經(jīng)由每一行雙螺旋的鏈交換位點處進入相鄰雙螺旋相同位置的鏈交換位點，每行 雙螺旋的鏈交換位點為2至500對，對同一行雙螺旋，每個鏈交換位點對間的距離(鏈交換周 期)為4至416個核苷酸。通過鏈間交換將結構中相鄰位置的雙螺旋彼此連接起來，所有的鏈 間交換均通過支架DNA達成。
[0009] 所述核酸結構為二維核酸結構，該二維核酸結構包含2至200行雙螺旋，一段長單 鏈DNA和20至1000條至少部分與支架DNA匹配的短鏈DNA;每行雙螺旋包含60至6000個核苷 酸，鏈交換周期為4至416;短鏈DNA在核酸結構中與支架DNA的匹配遵循堿基互補配對原則， 每條短鏈DNA的長度對同一結構可以相等且均小于400個核苷酸。對于單個核酸結構，其包 含的每條短鏈DNA是獨特的，僅在結構中出現(xiàn)一次；對于不同的核酸結構，短鏈DNA可以相 同。
[0010] 所述二維核酸結構為方形、多邊形或其他在支架DNA的長度限制內形成的規(guī)則或 不規(guī)則的二維圖形;二維核酸結構的不同形狀通過改變支架DNA的折疊路徑和短鏈DNA的匹 配位置達成。
[0011]所述核酸結構為多層核酸組成的三維立體結構，包含一段長單鏈DNA和20至1000 條至少部分與支架DNA匹配的短鏈DNA，2至100層雙螺旋，每層螺旋包含的螺旋數(shù)為2至100 行，每行螺旋包含60至3000個核苷酸，鏈交換周期為4至416,短鏈DNA在核酸結構中與支架 DNA的匹配遵循堿基互補配對原則，每條短鏈DNA的長度對同一結構可以相等且均小于200 個核苷酸;對于單個核酸結構，其包含的每條短鏈DNA是獨特的，僅在結構中出現(xiàn)一次;對于 不同的核酸結構，短鏈DNA可以相同。
[0012] 所述三維核酸結構為立方體、多面體或其他在支架DNA的長度限制內形成的規(guī)則 或不規(guī)則的三維結構;三維核酸結構的不同形狀通過改變支架DNA的折疊路徑和短鏈DNA的 匹配位置達成。
[0013] 所述核酸結構包含具有孔穴的核酸結構，該孔穴通過排除核酸結構中的一條或多 條短鏈DNA，使支架DNA在此位置不參與結構形成而達成，所述孔穴包括方形、多邊形、十字 形和其他規(guī)則或不規(guī)則的樣式。
[0014] 所述的具有孔穴的核酸結構包含具有代表八卦中的"乾"卦和"坤"卦孔穴的核酸 結構，"乾"卦和"坤"卦孔穴通過刪去完整核酸結構中特定位置的60和48條短鏈核苷酸形 成，被刪去的短鏈核苷酸不參與到退火過程中。
[0015] 所述核酸結構包含在單個到多個結構范圍內的特定位點具有化學修飾的核酸結 構，具有化學修飾的核酸直接作為短鏈DNA或者間接地通過與短鏈DNA的不與支架配對的單 鏈部分互補配對定位于核酸結構的特定位點。特定的化學修飾將特異性的結合納米顆粒、 多肽或者蛋白質。所述納米顆粒包括但不限于鏈酶親和素，金顆粒、熒光基團等易于表征和 呈現(xiàn)的粒子。修飾的呈現(xiàn)形式包括熒光信號和圖案等，所述圖案為字母、數(shù)字和其他規(guī)則或 不規(guī)則的樣式。
[0016] 所述核酸結構包含具有鏈酶親和素修飾的核酸結構，將其中一條或數(shù)條短鏈DNA 在3'端延長兩個"T"作為間隔序列和一段含有15個核苷酸的序列作為輔助序列，再將一條 3'端修飾有生物素的長為15個核苷酸的短鏈DNA與該輔助序列相匹配，從而將生物素引入 到結構中，生物素隨后可以結合鏈酶親和素。
[0017] 所述具有鏈酶親和素修飾的核酸結構包含修飾有字母"X"圖案的核酸結構，通過 26條指定位置的短鏈核苷酸將生物素引入到核酸結構中，從而在AFM成像時以26個像素點 的方式呈現(xiàn)字母"X"的樣式。
[0018] 所述輔助序列為GG AAGGGATGGAGGA，所述長為15個核苷酸的短鏈DNA的序列為 TCCTCCATCCCTTCC-b iot in。
[0019] -種鏈間交換由支架DNA達成的核酸結構的合成方法，是指在單個容器中使支架 DNA與多個短鏈DNA混合，在緩沖溶液中進行退火反應形成核酸結構，其中短鏈DNA的摩爾濃 度大于等于支架DNA摩爾濃度的2倍。
[0020] 上述的鏈間交換由支架DNA達成的核酸結構的合成方法，包括以下步驟：
[0021] -、樣品制備
[0022] 等體積吸取形成單個核酸結構所需的全部短鏈DNA，補充去離子水使得最終的混 合溶液中每條短鏈DNA的濃度為50至4000nM;
[0023] 將支架M13mpl8用純水配制成起始濃度為50至500nM;
[0024] 二、退火反應
[0025] 將5至50nM支架DNA與10至500nM的短鏈DNA混合在緩沖溶液中，對反應容器施以退 火程序。
[0026] 三、分離純化
[0027] 退火結束后，將反應混合物通過非變性瓊脂凝膠電泳分離反應混合物，以使目標 結構與其他結構在物理上分開。
[0028] 所述分離純化的具體步驟是，將退火后的反應混合物應用于置于冰水浴中的瓊脂 凝膠電泳，隨后切割下目標凝膠帶，使用細研磨棒將凝膠帶擠壓成小塊，在一定轉速下（例 如1000g)下離心數(shù)分鐘，回收已被純化的目標產物。
[0029] 所述退火程序的過程為1)或2)。
[0030] 1)所述退火程序的溫度以2-120分鐘/度的速度從90至60度的任一溫度降低至60 至4度的任一溫度。退火程序可以在100至70度的高溫停留10至100分鐘后再進行降溫。處在 不同溫度區(qū)間時，降溫速度可以不同
[0031] 2)所述退火程序的溫度為恒定溫度，所述恒定溫度為80至20度間的任一溫度
[0032] 本發(fā)明提供了多種核酸結構及其合成方法，是一種基于DNA折紙術的變體技術，旨 在實現(xiàn)利用支架DNA達成鏈間交換形成具有可控大小、形狀、復雜度和修飾的核酸結構。核 酸結構通過支架DNA和短鏈DNA的自組裝過程完成，產率較高，設計簡便，并且可以同時合成 預知的二維結構和三維結構。
【附圖說明】：
[0033] 圖1為本發(fā)明中的一種二維核酸結構的設計示意圖；
[0034]圖2為與圖1對應的二維核酸結構的AFM圖像；
[0035]圖3為本發(fā)明中的一種三維核酸結構的簡圖；
[0036]圖4為與圖3對應的三維核酸結構的設計示意圖；
[0037]圖5為與圖3對應的三維核酸結構中支架DNA的折疊周期路徑圖；
[0038]圖6為與圖3對應的三維核酸結構的TEM圖像；
[0039]圖7、圖8為本發(fā)明中的兩種具有孔穴的二維核酸結構的設計示意圖，其中圖7代表 的是象征"乾"圖案的鏈交換周期26的25螺旋核酸結構，圖8代表的是象征"坤"圖案的鏈交 換周期26的25螺旋核酸結構。
[0040]圖9為與圖7對應的具有孔穴的二維核酸結構的AFM圖像；
[0041 ]圖10為與圖8對應的具有孔穴的二維核酸結構的AFM圖像；
[0042] 圖11為本發(fā)明中的一種具有鏈酶親和素修飾的核酸結構的設計示意圖；
[0043] 圖12為與圖11對應的具有鏈酶親和素修飾的核酸結構的AFM圖像；
[0044]圖13為支架DNA與數(shù)條短鏈DNA經(jīng)過退火過程形成特定核酸結構的流程圖，以及該 結構的AFM圖像，在退火前，支架DNA以長單鏈環(huán)狀DNA的形式存在。
【具體實施方式】
[0045]本發(fā)明是基于對DNA折紙術的一種改進和補充，通過支架DNA而非短鏈DNA的鏈交 換可同時構筑二維或三維的核酸結構，在其最廣義含義中涉及制備納米級別可控大小、形 狀、復雜度和修飾的核酸結構。
[0046]本發(fā)明提供了制備多個可控大小、形狀、圖案和復雜度的二維、三維核酸結構的方 法，通過支架DNA和短鏈DNA的自組裝過程進行制備，該自組裝過程包含在高溫下混合支架 DNA、短鏈DNA和緩沖溶液并按一定程序逐步降低溫度，以促進序列特異性結合。術語"自組 裝"指的是短鏈DNA和支架DNA以無需外部控制（例如順次加入短鏈DNA)的方式彼此退火的 過程。
[0047]本發(fā)明提供的核酸結構包含以預定和已知方式與支架DNA進行堿基互補配對的短 鏈DNA，因此，了解所得結構中每條短鏈DNA的位置為該核酸結構提供了可尋址性。相應地， 可以對指定位置的短鏈DNA進行刪減或修飾獲得具有特定孔穴和圖案的核酸結構。
[0048] 1、二維核酸結構：
[0049]二維核酸結構由支架DNA和短鏈DNA以彼此特異性結合的方式組成，在形成核酸結 構的退火過程之前，支架DNA以環(huán)狀長鏈DNA的形式存在，每條短鏈DNA則以含有小于400個 核苷酸的單鏈形式存在。
[0050] 核酸結構內的支架DNA和短鏈DNA通過彼此堿基互補配對形成雙螺旋的方式存在， 這些雙螺旋在文中也可等價地被稱為螺旋。
[0051] 圖1提供了鏈交換周期為26個核苷酸的25螺旋矩形核酸結構的設計示意圖。我們 定義，自上而下，每行螺旋的位置為1，2,3……26,在每行螺旋中，從左至右，每個核苷酸的 位置為1，2,3……直至末尾。一般地，支架DNA的第0螺旋將不與短鏈DNA進行匹配，而以長單 鏈形式存在，從第1螺旋的第26、27個核苷酸開始，每隔52個核苷酸設置一個支架DNA鏈交換 位點對(crossover )，即左數(shù)第26、27，78、79，……，直至螺旋結束。第2螺旋至倒數(shù)第2行螺 旋的第26、27個核苷酸開始，每隔26個堿基設置一個鏈交換位點對，即26、27,52、53……，直 至螺旋結束。最后一行螺旋的第52、53個核苷酸開始，每隔52個核苷酸設置一 /個鏈交換位 點對。在每個鏈交換位點對處。每個核苷酸均與相鄰一行螺旋(上一行或下一行，依次交替） 相同位置的核苷酸連接。每一行螺旋相互平行排列且包含的核苷酸數(shù)可以相同。螺旋數(shù)和 每行螺旋包含的核苷酸數(shù)取決于設計者的需求，設計的核酸結構包含的總核苷酸數(shù)應小于 支架DNA的核苷酸數(shù)。圖2為該核酸結構的AFM圖像，其形狀和大小與設計相符。
[0052] 事實上，為避免支架DNA在折疊過程中可能產生的扭轉應力（twist)積累，對每一 行螺旋，從第一個核苷酸開始，每隔104個核苷酸使鏈交換位點的周期增加一個核苷酸，以 恰好滿足DNA螺旋周期的倍數(shù)(每個螺旋周期為10.5個核苷酸），消除可能的影響。因此，以 第3螺旋為例，實際的鏈交換位點對的位置應為26-27,52-53、78-79,105-106,以此類推，直 至螺旋結束。
[0053] 對于該二維核酸結構中的短鏈DNA，其排列位置參照如下規(guī)則:對于第0行螺旋，不 加入短鏈DNA進行匹配。對于第1行至末行螺旋，自第14個核苷酸開始，依次放置緊挨（中間 無空隙）的長度為26個核苷酸的短鏈DNA進行匹配形成雙螺旋，直至倒數(shù)第14個核苷酸的位 置。所有短鏈DNA在螺旋結構中均以平行方式存在。因此對于除第0行外的每一行螺旋，首尾 將各有13個核苷酸未形成雙螺旋，此舉的目的是避免核酸結構在彼此邊界產生不必要的聚 集。
[0054] 二維核酸結構還可設計成鏈交換周期為26的11螺旋核酸結構，鏈交換周期為16的 23螺旋核酸結構等。對于本發(fā)明涉及的其它形狀、大小的二維核酸結構，均可以參照上述方 法進行設計，核酸結構包含的總螺旋數(shù)可以是2至200行，每行螺旋包含的核苷酸可以是60 至6000個。每條短鏈DNA的長度小于400個核苷酸。鏈交換周期可以在4到416之間。
[0055] 2、三維核酸結構
[0056]三維核酸結構同樣是基于支架DNA的鏈間交換，通過支架DNA與短鏈DNA進行堿基 互補配對的方式組成。
[0057] 圖3提供了鏈交換周期為26個核苷酸的35螺旋三維核酸結構的簡圖，每行螺旋的 編號如圖所示，共有5層雙螺旋，每層雙螺旋在第1層螺旋所處平面的投影完全重合。每層螺 旋由7行雙螺旋組成，每行雙螺旋均以平行方式排列并含有相同個數(shù)的核苷酸。因此，該三 維核酸結構在空間呈現(xiàn)立方體的形狀。
[0058] 對應的三維核酸結構的設計示意圖如圖4所示。我們定義支架DNA的折疊起點5'位 于第一行螺旋的第一個核苷酸處，對第1行螺旋，從第26、27個核苷酸處，每隔52個核苷酸設 置一個鏈交換位點對，即第26、27，78、79……個螺旋處，直至螺旋結束。對最后一行螺旋(第 35行螺旋），從第52、53個核苷酸開始，每隔52個核苷酸設置一個鏈交換位點對，直至螺旋結 束。對其余的每行雙螺旋，從第26、27個核苷酸處，每隔26個核苷酸設置一個鏈交換位點對， 即第26、27，52、53，78、79個螺旋處，直至螺旋結束。每一行螺旋通過鏈交換位點與相鄰行螺 旋進行連接，該相鄰指的是在示意圖顯示位置的相鄰，例如第2行螺旋與第1行，第3行，第13 行螺旋相鄰。
[0059] 支架DNA的折疊路徑：
[0060]支架DNA在該三維核酸結構中完成了 4個相同的折疊周期，每個周期由兩種不同的 折疊路徑組成。以第一個折疊周期為例，如圖5所示。自5'端開始，支架DNA在達到第1行螺旋 的第1處鏈交換位點對后，進入第2行螺旋，隨后返回至第2行螺旋第1個核苷酸處，形成一 個" U"形回路，隨后進入第3行螺旋，并在第3行螺旋的第一個鏈交換位點處進入第4行螺旋。 以此方式，支架DNA按照自然數(shù)的序列，依次走完第1、2、3……35行螺旋。
[0061] 支架DNA達到第35行螺旋后，在第1個鏈交換位點對處進入第22行螺旋，并返回至 第22行螺旋的第一個鏈交換位點對，隨后進入第21行螺旋。在第21行螺旋的第一個鏈交換 位點對處進入第8行螺旋，在第8行螺旋的第2個鏈交換位點對處進入第7行螺旋。以此方式， 支架DNA按照示意圖中垂直方向螺旋的排列，依次走完第35、22、21、8、7、6、9……然后回到 第1行螺旋。
[0062]其余的折疊周期均按此方法進行，需要注意的是，支架DNA所經(jīng)過的鏈交換位點對 根據(jù)折疊的周期數(shù)相應改變。例如，第2個折疊周期中，支架DNA經(jīng)過的鏈交換位點對為每行 的第2個和第3個，支架DNA在完成所有折疊周期后，返回第1行螺旋的最后一個核苷酸處，第 1行螺旋首末核苷酸之間通過長單鏈DNA相連，以滿足支架DNA為環(huán)狀DNA的條件。
[0063]對于鏈交換周期為26的三維核酸結構中的短鏈DNA，其排列位置參照如下規(guī)則:對 于第1至末行螺旋，自第14個核苷酸開始，依次放置緊挨（中間無空隙）的長度為26個核苷酸 的短鏈DNA進行匹配形成雙螺旋，直至倒數(shù)第14個核苷酸的位置。所有短鏈DNA在螺旋結構 中均以平行方式存在。對每一行螺旋，首尾將各有13個核苷酸未形成雙螺旋，以避免可能在 邊界產生的積聚現(xiàn)象。
[0064]上述三維核酸結構的TEM圖像如圖6所示，其結構尺寸與設計相符。
[0065]對于本發(fā)明涉及的其它形狀、大小的三維核酸結構，均可以參照上述方法進行設 計，三維核酸結構可以包含2至100層雙螺旋，每層螺旋包含的螺旋數(shù)可以是2至100行，每行 螺旋可以包含60至3000個核苷酸。每條短鏈DNA的長度小于400個核苷酸。鏈交換周期可以 在4至416之間這樣。最終形成的三維核酸結構在空間呈現(xiàn)為長方體的形狀。
[0066]以上設計過程和最終的支架DNA序列輸入、短鏈DNA序列輸出可在Cadnano軟件中 完成。毫無疑問，最終，我們可以設計具有特定長度和寬度的核酸結構，并精確了解結構中 每條短鏈DNA的位置和序列。借此，可以通過選擇性刪減短鏈DNA或對特定位置的短鏈DNA進 行修飾，獲得可控形狀、大小并具有孔穴或圖案的二維和三維圖形。
[0067] 3、具有孔穴的核酸結構
[0068] 基于對核酸結構中每條短鏈核苷酸的位置、長度的精確了解，可以通過排除指定 核酸結構中一條或多條短鏈核苷酸，使得支架DNA在該位置不參與結構形成以顯示出孔穴。 然后采用相同的退火過程，最終得到具有可控形狀、尺寸的孔穴的核酸結構。
[0069] 考慮到可以直接排除核酸結構中任意位置的短鏈核苷酸，所形成的孔穴包括方 形，多邊形，十字形以及其他規(guī)則或者不規(guī)則的形狀。由于AFM探針的精度有限，設計孔穴的 長寬應在l〇nm以上以方便AFM的測量。因此，被刪去的短鏈DNA也具有一定的數(shù)量。在一些實 例中，可以通過刪除特定的20條短鏈核苷酸以形成十字形的孔穴，通過分別刪除特定位置 的60條和48條核苷酸形成代表"乾"和"坤"含義的孔穴。圖7和圖8分別顯示了帶有八卦中的 "乾"卦圖案和"坤"卦圖案的孔穴的鏈交換周期26的25螺旋核酸結構的設計示意圖。在設計 圖中，指定位置的短鏈DNA被直接刪去而不參與到退火過程中。通過短鏈DNA被刪去后形成 的孔穴來體現(xiàn)設計的圖案。圖9和圖10分別對應"乾"和"坤"孔穴的核酸結構的AFM圖像，其 孔穴出現(xiàn)位置和大小、形狀與設計相符，證明通過該方法可以獲得具有特定孔穴的核酸結 構。
[0070] 本發(fā)明中的核酸結構還考慮了通過修改支架DNA的折疊路徑形成孔穴的方法。支 架DNA在8個距離相鄰的鏈交換位點13個核苷酸的位置進行鏈間交換(替代原有的距離為26 個核苷酸的鏈交換位點），因此形成一個長度為26個核苷酸，寬度為4個螺旋的孔穴區(qū)域?？?慮到核苷酸缺失可能引起的扭轉應力，在該8個鏈交換位點的對應位點之間，增加四個核苷 酸作為間隔序列，以消除影響。通過該方法可以形成特定大小、形狀的具有孔穴的核酸結 構。并且由于支架DNA不再在孔穴區(qū)域存在，在AFM下觀察到的孔穴將更加接近理論尺寸。
[0071] 本發(fā)明中的二維核酸結構還可以通過直接增加間隔序列來形成孔穴。支架DNA的 四個相同位置的鏈交換位點被刪除，而在相鄰的鏈交換位點處共增加4個長度為4個核苷酸 的間隔序列，形成一個長度為52個核苷酸，寬度為4個螺旋的孔穴區(qū)域。該方法同樣可以形 成具有特定大小、形狀的具有孔穴的核酸結構。
[0072] 4、具有修飾的核酸結構
[0073] 本發(fā)明中的核酸結構可以在單個到多個結構范圍內的特定位點進行化學修飾，具 有化學修飾的核酸可以作為短鏈DNA直接定位于特定位點，或者通過與短鏈DNA的不與支架 DNA配對的單鏈部分互補配對間接地定位于核酸結構的特定位點。特定的化學修飾將特異 性的結合納米顆粒、多肽或者蛋白質。所述納米顆粒包括但不限于鏈酶親和素，金顆粒、熒 光基團等易于表征和呈現(xiàn)的粒子。修飾的呈現(xiàn)形式包括熒光信號和圖案等，所述圖案為字 母、數(shù)字和其他規(guī)則或不規(guī)則的樣式。
[0074] 鏈酶親和素與生物素的結合是目前已知的強度最高的非共價作用，而修飾有生物 素的短鏈DNA已得到商業(yè)化生產。對核酸結構中每條短鏈核苷酸位置的精確了解提供了可 尋址性。因此，可以將結構中特定位置的短鏈核苷酸延長一組序列，再將生物素修飾在與該 延長序列相匹配的短鏈核苷酸上，然后通過鏈酶親和素與生物素的特異性結合，在AFM下觀 測到修飾有預設圖案的核酸結構?？紤]到可以對任意位置已知序列、長度的短鏈DNA進行修 飾，該方法可以實現(xiàn)獲得修飾有任意預訂形狀的核酸結構。
[0075] 在一些實例中，對于核酸結構中所有需要生物素修飾的位點，其所處位置的短鏈 核苷酸在3 '端將延長兩個"T"作為間隔序列和一段含有15個核苷酸的序列 (GGAAGGGATGGAGGA)作為輔助序列，而3 '端生物素修飾的短鏈核苷酸則含有15個核苷酸，其 序列為TCCTCCATCCCTTCC-biotin，與該輔助序列相匹配。在退火過程前，將支架DNA、短鏈 DNA、含有生物素修飾的短鏈DNA混合在一起。在進行AFM掃描前，將luM的鏈酶親和素加入到 待測樣品中，靜置10分鐘等待鏈酶親和素和生物素充分結合，即可觀測到修飾有特定圖案 的核酸結構。
[0076]圖11顯示了基于該方法，修飾有字母"X"鏈交換周期為26個核苷酸的25螺旋核酸 結構的設計圖。如圖所示，字母"X"含有26個修飾位點，對修飾位點處的短鏈DNA增加兩個 "T"作為間隔序列和15個核苷酸作為輔助序列，一段長為15個核苷酸3'端修飾有生物素的 短鏈DNA與該輔助序列相匹配并參與到退火過程中，最終附著于制備的核酸結構中，使得鏈 酶親和素能在固定位置與生物素結合。圖12為與字母"X"對應的核酸結構的AFM圖像。其鏈 酶親和素結合位點和最終顯示圖案與設計相符，證明通過該方法可以實現(xiàn)獲得具有特定修 飾的核酸結構。
[0077] 對于退火過程前的修飾，其前提應保證此額外加入的短鏈DNA不會影響結構的形 成。本發(fā)明還考慮了在退火過程后進行修飾作為備選方案。例如，在退火完成后再將修飾有 生物素的短鏈DNA加入到樣品中，然后在37°下培育10分鐘。同樣地，在AFM掃描前加入鏈酶 親和素然后進行觀測。
[0078] 5、支架 DNA
[0079] 本發(fā)明中采用的支架DNA為M13mpl8，M13mpl8為ml3噬菌體基因組DNA中一個環(huán)狀 單鏈DNA分子，共含有7249個核苷酸，已經(jīng)獲得商業(yè)化生產。
[0080] 6、短鏈 DNA
[0081] 本發(fā)明中核酸結構的設計和制備過程涉及數(shù)百條不同的短鏈DNA，短鏈DNA可以通 過其長度、序列進行表征，并由其在結構中的位置和支架DNA的序列決定，遵循堿基互補配 對原則。對于單個核酸結構，其包含的每條短鏈DNA是獨特的，僅在結構中出現(xiàn)一次;對于不 同的核酸的結構，短鏈DNA可以相同。
[0082]短鏈DNA可以在體外合成，自動化合成短鏈DNA的方法在本領域是已知的并且已經(jīng) 商業(yè)化運營。
[0083]本發(fā)明提供了多個核酸結構，此多個結構可以具有不同程度的同質性，預期多個 核酸結構中有一定百分比的結構就大小、形狀、復雜性而言彼此相同，也可以是具有某一特 征的結構中至少50%、60%、70%是同質的。在一些情況下，多個核酸結構其成員可以是基 本上單分散的，基本上單分散指的是至少50%、60%、70%具有大約相同的大小、形狀、復雜 度。
[0084]核酸結構的大小可以通過其二維或三維維度表示，此維度可以是納米甚至亞微米 級別的尺寸。在一些實例中，二維核酸結構為約200nm乘40nm;三維核酸結構為約62nm乘 26nm乘19nm。核酸結構的大小還可以呈現(xiàn)為其包含的雙螺旋數(shù)和每一行螺旋含有的核苷酸 數(shù)。例如本發(fā)明中的某一二維結構含有11行雙螺旋，每行雙螺旋包含1154個核苷酸。
[0085]本發(fā)明通過在單個退火反應中混合支架DNA與短鏈DNA，以獲得所需大小、形狀、復 雜度和修飾的核酸結構。在一些實施方案中，可以對反應容器實施高溫，隨后緩慢冷卻進行 退火，高溫可以是約90度，85度，80度的溫度，冷卻過程可以將溶液冷卻至室溫，10°C，4°C甚 至更低。冷卻期可以是10小時，15小時，25小時甚至更久。在另一些實例中，可以對反應容器 實施恒溫處理，恒溫可以是約65°C，60°C，55°C，恒溫期可以是10小時，15小時，25小時甚至 更久。
[0086]多個核酸結構的同質性程度可以使用許多技術進行測定，包括但不限于AFM，TEM 和凝膠電泳。如實例中所述，這些技術已用于對所得核酸結構的同質性測定。
[0087]在圖1、圖4、圖7、圖8、圖11中，短鏈DNA分別用a、d、e開頭、后面加數(shù)字編號的方式 標示，如al. 1。相應短鏈DNA的序列列于序列表中。例如al. 1的序列如SEQ ID N03所示。 [0088] 7、合成方法
[0089]本發(fā)明提供了通過退火過程合成核酸結構的方法，將支架DNA和短鏈DNA混合后， 可以在單個容器但不限于管、孔、小瓶中進行混合。溶液一般是緩沖的，但退火反應也可以 在沒有緩沖溶液的情況下進行。緩沖溶液可以包含二價陽離子但不限于Mg 2+。陽離子濃度通 常為5至20mM，但也可以改變。溶液通常包含EDTA或其它酶抑制劑，以阻止核苷酸的降解。在 退火的混合溶液中，短鏈DNA的濃度取決于支架DNA的濃度，通常為支架DNA摩爾濃度的5至 20倍，支架DNA可以使用10nM的摩爾濃度。整個退火混合液的體積可以是20ul，30ul或者更 尚。
[0090] 退火反應通過使溶液加熱并緩慢冷卻來執(zhí)行。加熱溫度應足夠高，確保短鏈DNA不 會與非互補序列進行結合，并使任何不希望有的二級結構例如發(fā)夾結構解鏈?？梢酝ㄟ^將 反應容器置于熱水浴、PCR(聚合酶鏈式反應器)或其他溫控裝置中進行加熱。容器可以在高 溫下培育數(shù)秒或數(shù)分鐘。一般來說，1至20分鐘的培育是足夠的。
[0091] 在高溫下的培育完成后，溫度可以以許多方式下降，可以使用自動化控制的方法， 即在某一溫度維持一段時間，隨后下降一度或多度，繼續(xù)維持一段時間，以此方式一直進行 直至控制程序設定的最低溫度。
[0092] 可以對反應容器實施高溫，隨后緩慢冷卻進行退火，高溫可以是約90度左右，冷卻 過程可以將溶液冷卻至室溫甚至更低。冷卻期可以是10小時，15小時，25小時甚至更久。 [0093] 退火反應也可以通過對溶液進行恒溫處理來執(zhí)行，恒溫溫度通常在65°C至55°C之 間，恒溫時間通常在10小時以上。
[0094] 實施例描述了一個具體的退火過程。將10nM的支架DNA與200nM的多條短鏈DNA混 合在Tris-EDTA/lOmM Mg2+緩沖溶液中，將溶液加熱至90°C，隨后經(jīng)過約26小時的退火緩慢 冷卻至4°C。
[0095] 可用于退火過程的另外一組條件還包括Te/Mg2+緩沖液（10mM Tris、PH 8.0、2mM EDTA、15mM Mg2+)以及在60 °C下恒溫24小時。
[0096] 退火過程無需嚴格控制短鏈DNA和支架DNA的濃度，也無需嚴格遵守化學計量學。
[0097] 退火結束后，反應混合物可以直接進行分析或者進一步分離?？梢酝ㄟ^1-2%非變 性瓊脂凝膠電泳分離反應混合物，以使目標結構與其他結構在物理上分開。通常我們會觀 察到單個顯著條帶，條帶可以由凝膠中提取并經(jīng)由離心去除短鏈DNA和其它雜質進一步純 化，純化后的產物可以通過AFM或TEM成像，此類成像能反應目標產物的尺寸和形狀，揭示預 知結構的形成。純化產物也可以再次執(zhí)行凝膠電泳并觀察到預期的單個條帶。
[0098] 退火過程的效率可以通過AFM視野中所有"充分形成"的結構的百分比進行測定。 如果核酸結構沒有直徑大于l〇nm的缺陷，則它被視為"充分形成的"。依據(jù)上述標準，本發(fā)明 中所有的核酸結構均有80 %以上的"充分形成"的AFM "產率考慮到樣品在沉積在云母表 面或AFM探針對結構進行掃描時可能經(jīng)受的損害，這可能是低于實際情況的一個數(shù)字。 [0099] 8、Cadnano軟件操作流程：
[0100]通過Cadnano繪制本發(fā)明中的核酸結構的流程如下：
[0101] 8.1圖形設計
[0102] 在軟件的上半部分，根據(jù)需要選擇螺旋數(shù)。在下半部分，每一行雙排網(wǎng)格對應一行 螺旋，以此方式來表示二維或三維結構，即上半部分為整體結構的側視圖。下半部分為俯視 圖。在確定好螺旋數(shù)后，可以直接在俯視圖上進行繪制。根據(jù)設計要求，依據(jù)5'至3'的折疊 方向，繪制好支架DNA的折疊路徑后，再依次補上與特定位置進行匹配的短鏈DNA，多余的核 苷酸放置在第一行螺旋的回路(loop)中，完成結構設計。
[0103] 8.2序列輸入與輸出
[0104]選擇支架DNA中某一處核苷酸作為5'方向的起點，輸入已知的支架DNA的序列，即 可得到每一條短鏈DNA的特定序列。軟件可生成含有所有短鏈DNA序列的EXCEL格式文件。 [0105] 9、具體實施方法
[0106] 實施例1:
[0107]如圖13所示，本發(fā)明涉及的制備過程包含以下步驟：
[0108] 1、樣品制備：
[0109]短鏈DNA由Bioneer公司合成，等體積吸取形成單個核酸結構所需的全部短鏈DNA， 補充DEPC水使得最終的混合溶液中每條短鏈DNA的濃度為500nM。稀釋倍數(shù)取決于制造商規(guī) 格單中的起始濃度而不執(zhí)行額外的內部校正，因此短鏈DNA的化學計量學無需精確控制。 [0110]支架DNA中的M13mpl8采購自NEB公司，其加入適量純水使起始的支架DNA濃度為 ΙΟΟηΜο
[0111] 2、退火反應
[0112] 將ΙΟηΜ支架DNA與200nM的短鏈DNA混合在緩沖溶液（10mM Tris、pH 8.0、2mM EDTA、10mM Mg2+)中，施以退火程序使反應容器從90°C緩慢冷卻至4°C。溫度變化過程為:90 °C停留10分鐘，在90 °C至60 °C之間以5min/ °C下降，在60 °C至4 °C之間以25min/ °C下降。將退 火后的樣品應用于置于冰水浴中的2%瓊脂凝膠電泳(使用Gel red染色，緩沖液為0.5 X TBE/10mM MgCi2)。隨后切割下目標凝膠帶，使用細研磨棒將凝膠帶擠壓成小塊，在lOOOg下 離心3分鐘，回收已被純化的目標產物。
[0113] 3、AFM 成像
[0114] 退火后的混合溶液可以直接進行AFM成像，也可使用凝膠電泳純化后再進行測量。 本發(fā)明采用的AFM成像儀器為Bruke公司的mu 11imode 8。將退火或凝膠電泳純化后的樣品 稀釋5倍，取2ul滴加在剛撕平的云母表面，隨后加50ul ΙΧΤΕ/lOmM Mg2+，以促進核酸結構 的沉降，也可根據(jù)實際情況改變樣品的稀釋比例或滴加體積以滿足核酸結構在視野中有合 適的排布比例(視野中多數(shù)核酸結構可以清楚辨識，無堆積現(xiàn)象）。使用帶有SNL-10氮化硅 懸臂的AFM在液相智能掃描模式(ScanAsyst in Fluid)下進行掃