用于改進(jìn)樹(shù)中的樹(shù)干材積生長(zhǎng)和生物量生產(chǎn)的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及遺傳構(gòu)建體，其包含可操作連接到啟動(dòng)子的編碼酶細(xì)胞分裂素生物合成異戊烯基轉(zhuǎn)移酶(IPT)的核酸序列，所述啟動(dòng)子允許所述核酸序列在形成層細(xì)胞中表達(dá)。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生與野生型植物相比有增加的生物量生產(chǎn)和/或增加的樹(shù)干積材生長(zhǎng)的能力的轉(zhuǎn)基因植物的方法，生物量以及用于改進(jìn)樹(shù)中的生物量的生產(chǎn)和/或增加的樹(shù)干積材生長(zhǎng)的方法，以及在形成層細(xì)胞中過(guò)表達(dá)編碼IPT的內(nèi)源性或外源性核酸序列的樹(shù)，和從該轉(zhuǎn)基因樹(shù)可獲得的木材產(chǎn)品。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
用于改進(jìn)樹(shù)中的樹(shù)干材積生長(zhǎng)和生物量生產(chǎn)的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生有增加的樹(shù)干材積生長(zhǎng)和/或生物量生產(chǎn)的能力的轉(zhuǎn)基因植 物的方法以及還涉及用于改進(jìn)樹(shù)木中的樹(shù)干材積生長(zhǎng)和/或生物量生產(chǎn)的方法。本發(fā)明還 涉及經(jīng)遺傳修飾的樹(shù)，來(lái)源于所述樹(shù)的木材產(chǎn)品，遺傳構(gòu)建體和載體以及表達(dá)所述遺傳構(gòu) 建體和載體的樹(shù)。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 維管形成層(木本植物物種的橫向分生組織）的活動(dòng)產(chǎn)生次生維管組織。形成層分 生組織沿著樹(shù)干(或根或枝）形成薄圓柱體，并且它既向內(nèi)又向外產(chǎn)生新的維管組織。這些 組織，次生木質(zhì)部和韌皮部，形成植物器官中的橫向生長(zhǎng)的體積(bulk)。它們兩者中的傳導(dǎo) 維管細(xì)胞(conducting vascular cel Is)通過(guò)多步驟分化過(guò)程逐漸獲得它們的最終功能形 式。發(fā)展中的木質(zhì)部細(xì)胞將經(jīng)歷擴(kuò)張，次生細(xì)胞壁形成，程序性細(xì)胞死亡和最終木質(zhì)化。相 似地，功能性韌皮部細(xì)胞將通過(guò)連續(xù)的幾個(gè)發(fā)育步驟形成，包括篩管成分和伴細(xì)胞的分化。 這些多步驟分化程序形成穿過(guò)形成層區(qū)域的兩種相反導(dǎo)向的發(fā)育梯度;韌皮部或木質(zhì)部細(xì) 胞與分生組織中間相距越遠(yuǎn)，它處于其分化過(guò)程中越晚。引人注目的是，形成層分生組織的 核心;活躍分裂的細(xì)胞，保留了它們的分生組織性質(zhì)，并保持未分化為維管細(xì)胞的任一種形 式。平周細(xì)胞分裂既更新了分生組織細(xì)胞的群體，又提供了用于維管組織分化程序的新生 材料，而垂周分裂實(shí)現(xiàn)新的細(xì)胞隊(duì)列的創(chuàng)建和形成層圈的擴(kuò)張。
[0004] 次級(jí)發(fā)育（secondary development)的規(guī)模在樹(shù)種中高度不同；它們?cè)谄溟L(zhǎng)的壽 命期間表現(xiàn)出極度的和經(jīng)濟(jì)上高度有價(jià)值的木材生產(chǎn)能力。潛在地作為大規(guī)模次級(jí)生長(zhǎng)的 適應(yīng)，大多數(shù)樹(shù)的木材也含有廣泛的橫向運(yùn)輸系統(tǒng)，維管福射狀網(wǎng)絡(luò)(ray network)。對(duì)于 多年生樹(shù)種的形成層功能的其它新的挑戰(zhàn)以每年的活動(dòng)-休眠周期呈現(xiàn)。為了保證它們的 存活，樹(shù)必須使它們的形成層活性適于冷和暖(或濕和干)季節(jié)的每年循環(huán)。它們必須能夠 在春天中活化它們的形成層分生組織并在秋天期間使其失活為休眠靜息階段。
[0005] 如果能夠改進(jìn)樹(shù)的生長(zhǎng)，并且具體地如果能夠增強(qiáng)樹(shù)干積材(stem volume)，對(duì)于 木材生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)性將是高度有價(jià)值的。
[0006] 已經(jīng)表明細(xì)胞分裂素信號(hào)傳導(dǎo)（cytokinin signalling)對(duì)于形成層功能是需要 的。具有受損的細(xì)胞分裂素信號(hào)傳導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因楊屬樹(shù)(Populus tree)表現(xiàn)出受損的徑向生 長(zhǎng)，其由維管形成層中細(xì)胞分裂的數(shù)量減少所導(dǎo)致(Nieminen et al. ,2008)。另外，編碼細(xì) 胞分裂素受體的基因和細(xì)胞分裂素初級(jí)反應(yīng)基因在楊屬樹(shù)干的形成層區(qū)域中是豐富的 (Nieminen et al·，2008)。
[0007] 雖然已知細(xì)胞分裂素信號(hào)傳導(dǎo)與樹(shù)的生物量生產(chǎn)相關(guān)，但該圖景是復(fù)雜的，因?yàn)?存在至少大約100種形成層富集的和細(xì)胞分裂素調(diào)控的、具有幾種功能的基因。不知道這些 基因中的哪些對(duì)于樹(shù)干細(xì)胞的徑向生長(zhǎng)是需要的(Tuskan et al. ,2006)。
[0008] 為了進(jìn)一步增加形成層的激素調(diào)節(jié)的復(fù)雜性，在其它組織中的研究已經(jīng)揭示了細(xì) 胞分裂素和生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)之間的高度互聯(lián)網(wǎng)絡(luò)(El-Showk et al.，2013)。細(xì)胞分裂素能 夠影響生長(zhǎng)素的生物合成和運(yùn)輸兩者。有趣的是，該調(diào)節(jié)似乎是高度復(fù)雜的，因?yàn)橐呀?jīng)存在 有關(guān)于細(xì)胞分裂素對(duì)生長(zhǎng)素生物合成的正面和負(fù)面影響的幾項(xiàng)報(bào)道。關(guān)于細(xì)胞分裂素對(duì)生 長(zhǎng)素運(yùn)輸?shù)挠绊懸呀?jīng)獲得了相似的結(jié)果，其中已經(jīng)報(bào)道了該激素既上調(diào)又下調(diào)生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn) 蛋白水平。很可能這些分歧的結(jié)果反映了微調(diào)的（fine-tuned)調(diào)節(jié)模式;細(xì)胞分裂素可能 對(duì)不同的生長(zhǎng)素生物合成酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有不同的影響，很可能以組織特異性的方式。最 重要的是，也已知生長(zhǎng)素在調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂素的生物合成和信號(hào)傳導(dǎo)中具有相似的復(fù)雜角 色。
[0009]國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)W0 2006/034286描述了組合物和方法，其采用參與調(diào)節(jié)植物發(fā)育的 異戊烯基轉(zhuǎn)移酶（IPT)多肽和多核苷酸。在該方法中，描述的IPT的表達(dá)維持或改進(jìn)了例如 植物的應(yīng)激耐受性（stress tolerance)，維持或增加了植物的尺寸，維持了結(jié)種（seed set)，或增加了芽（shoot)生長(zhǎng)。
[0010] 雖然現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)進(jìn)行了一些嘗試以改進(jìn)植物生長(zhǎng)，但仍需要能夠用于改進(jìn)樹(shù) 木生長(zhǎng)，特別是改進(jìn)樹(shù)干積材和生物量生產(chǎn)的方法和構(gòu)建體。
[0011] 發(fā)明簡(jiǎn)述
[0012] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供現(xiàn)有技術(shù)中遇到的問(wèn)題的解決方案。具體地，本發(fā)明旨 在提供如何改進(jìn)樹(shù)生長(zhǎng)的解決方案。此外，本發(fā)明旨在增加樹(shù)木中的樹(shù)干積材生長(zhǎng)和生物 量生產(chǎn)。
[0013] 具體地，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供解決方案，其改進(jìn)樹(shù)中的徑向生長(zhǎng)。
[0014] 為了實(shí)現(xiàn)這些目標(biāo)，本發(fā)明的特征在于獨(dú)立權(quán)利要求中登記的特征。其它的權(quán)利 要求代表了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。
[0015] 本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)，即有可能通過(guò)提高形成層細(xì)胞中的細(xì)胞分裂素信號(hào)傳導(dǎo)增 強(qiáng)形成層細(xì)胞中的細(xì)胞分裂。更具體地，可能通過(guò)允許形成層細(xì)胞中特定基因的表達(dá)提高 形成層細(xì)胞中的細(xì)胞分裂，所述基因編碼酶細(xì)胞分裂素生物合成異戊烯基轉(zhuǎn)移酶。
[0016] 現(xiàn)在出人意料地發(fā)現(xiàn)了通過(guò)形成層細(xì)胞中的酶細(xì)胞分裂素生物合成異戊烯基轉(zhuǎn) 移酶的增強(qiáng)的表達(dá)導(dǎo)致了增強(qiáng)的樹(shù)干積材生長(zhǎng)和/或增加的生物量生產(chǎn)。
[0017]因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供如權(quán)利要求1中所定義的遺傳構(gòu)建體，其包含與第 二核酸序列（啟動(dòng)子)可操作連接的編碼酶細(xì)胞分裂素生物合成異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的第一核 酸序列(效應(yīng)器），所述第二核酸序列（啟動(dòng)子)允許所述第一核酸序列在形成層細(xì)胞中的表 達(dá)。
[0018] 另一個(gè)方面，本發(fā)明提供如權(quán)利要求7中所定義的包含所述遺傳構(gòu)建體的載體。
[0019] 因此，在第三個(gè)方面，本發(fā)明提供如權(quán)利要求8中所定義的樹(shù)，其在形成層細(xì)胞中 過(guò)表達(dá)內(nèi)源核酸序列，或表達(dá)外源核酸序列，所述內(nèi)源核酸序列或外源核酸序列編碼酶細(xì) 胞分裂素生物合成異戊烯基轉(zhuǎn)移酶。
[0020] 在第四個(gè)方面，本發(fā)明提供如權(quán)利要求16中所定義的從所述樹(shù)可獲得的木材產(chǎn) 品。
[0021] 在第五個(gè)方面，本發(fā)明提供如權(quán)利要求17中所定義的用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的方 法，所述轉(zhuǎn)基因植物與野生型植物相比有提高的生物量生產(chǎn)和/或增加的樹(shù)干積材生長(zhǎng)的 能力。
[0022] 在第六個(gè)方面，本發(fā)明提供如權(quán)利要求18中所定義的用于改進(jìn)樹(shù)中的生物量生產(chǎn) 和/或增加的樹(shù)干積材生長(zhǎng)的方法。
[0023] 附圖簡(jiǎn)述
[0024] 圖1.系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，表明了多種IPT的平均距離，AtlPT5是AtlPT7的最接近的擬南芥 屬直向同系物(ortholog)。
[0025] 圖2 . IPT中的保守域：來(lái)自不同來(lái)源的域A、B和C和擬南芥（Arab idops i s thaliana)中的對(duì)應(yīng)域A'、B'和C' a表示任意氨基酸，圓括號(hào)(x)中的x表示不需要的氨基 酸。方括號(hào)表示在方括號(hào)[]中的氨基酸殘基的任一個(gè)。
[0026] 圖3^七1?了7和4七1?了5直向同系物的氨基酸序列的比較和具有超過(guò)50%相似同一 性的共有序列(大寫(xiě)字母表示具有100%相同氨基酸的氨基酸，而小寫(xiě)字母表示比較的序列 的50-90%中相同的氨基酸）。
[0027] 圖4.插入植物基因組的轉(zhuǎn)化載體的部分(約8200bp)。該構(gòu)建體圖譜示出了不同的 位點(diǎn)，以及它們的來(lái)源，估計(jì)的大小和功能。
[0028] 圖5A.三個(gè)月齡的WT和pLMX5-IPT7品系1和3的楊屬樹(shù)的表型。
[0029] 圖5B.轉(zhuǎn)基因 pLMX5-IPT7楊屬樹(shù)品系1和3相比于WT的樹(shù)干材積。
[0030] 圖5C.WT和pLMX5_IPT7品系的細(xì)胞分裂素反應(yīng)性測(cè)定(responsiveness assay)。
[0031]圖OT.WT和pLMX5-IPT7品系1樹(shù)干中的細(xì)胞分裂素受體(PttHK3a)，細(xì)胞分裂素信 號(hào)傳導(dǎo)初級(jí)反應(yīng)基因(A型RR PttRR7)和生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)標(biāo)志物基因（PttIAA3)的表達(dá)。 [0032]圖6.WT(A)和轉(zhuǎn)基因楊屬pLMX5: :IPT7品系1樹(shù)干(B)中形成層解剖學(xué)、激素含量和 激素信號(hào)概況。收集了四個(gè)部分(A-D)用于激素分析(Α、Β)。
[0033] 發(fā)明詳述
[0034] 本發(fā)明提供轉(zhuǎn)基因樹(shù)，其具有增加的樹(shù)干積材生長(zhǎng)和/或生物量生產(chǎn)。描述了可用 于產(chǎn)生所述轉(zhuǎn)基因樹(shù)木的遺傳構(gòu)建體和載體以及用于產(chǎn)生這些樹(shù)木的方法。
[0035] 本發(fā)明提供遺傳構(gòu)建體，其包含可操作地連接到第二核酸序列（啟動(dòng)子)的編碼酶 細(xì)胞分裂素生物合成異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的第一核酸序列（效應(yīng)器），所述第二核酸序列（啟動(dòng) 子)允許所述第一核酸序列在形成層細(xì)胞中的表達(dá)。
[0036] "第一核酸序列"這里表示效應(yīng)基因，其編碼酶細(xì)胞分裂素生物合成異戊烯基轉(zhuǎn)移 酶。所述第一核酸序列選自下組：
[0037] (a)包含SEQ ID NO: 1的核酸序列；
[0038] (b)編碼SEQ ID N0:2的核酸序列；
[0039] (c)編碼包含保守域區(qū)域A、B和/或C的氨基酸序列的核酸序列，所述保守域區(qū)域A、 B和/或C具有選自下組的氨基酸序列：SEQ ID N0:3、4和5;
[0040] (d)編碼包含區(qū)域D的氨基酸序列的核酸序列，所述區(qū)域D與氨基酸序列SEQ ID N0:6(即SEQ ID N0:2的氨基酸40-141;見(jiàn)圖3第三行）具有至少80%同一性，優(yōu)選至少85% 同一性，更優(yōu)選至少90 %同一性，還更優(yōu)選至少95 %同一性；
[0041 ] (e)編碼與SEQ ID N0:2顯示至少80%同一性，優(yōu)選85%同一性，更優(yōu)選至少90% 同一性，還更優(yōu)選至少95%同一性的氨基酸序列的核酸序列;和 [0042] (f)編碼酶的核酸序列，所述酶屬于酶類(lèi)EC 2.5.1.27。
[0043]本發(fā)明還包括實(shí)施方案，其中所述第一核酸序列編碼包含保守域區(qū)域A'、B'和/或 C'的氨基酸序列，所述保守域區(qū)域A'、B'和/或C'具有如圖2中所顯示的擬南芥的域A'、B' 和/或C'的氨基酸序列。
[0044]在被子植物和裸子植物兩者中的幾個(gè)植物屬和種中發(fā)現(xiàn)了編碼酶細(xì)胞分裂素生 物合成異戊烯基轉(zhuǎn)移酶（IPT)的基因。當(dāng)比較IPT的氨基酸序列時(shí)，在不同的植物屬中發(fā)現(xiàn) 了特定結(jié)構(gòu)域中的緊密同源性，見(jiàn)W0 2006/034286。因此，從不同的植物屬和種中發(fā)現(xiàn)IPT 是可能的，其以與本文中描述的基因相似的方式發(fā)揮功能。
[0045] Kakimoto(2001)對(duì)擬南芥屬I(mǎi)PT AtIPTl-9的序列分析，與來(lái)自根癌土壤桿菌 (Agrobacterium tumefaciens )，丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae)和成團(tuán)泛菌 (Pantoeaagglomerans)的IPT比較，揭示了三個(gè)共有模式：域A(SEQ ID N0:3)，域B(SEQ ID N0:4)和域C(SEQ ID N0:5)。所述共有模式示于圖2中，其中x表示任意氨基酸殘基，（x)表示 不需要的氨基酸殘基，方括號(hào)表示方括號(hào)□中的氨基酸殘基的任一個(gè)。擬南芥的9種不同 IPT的對(duì)應(yīng)域區(qū)域A'、B'和C'也示于圖2中。
[0046] 相似的保守域（有陰影）也存在于從毛果楊（Populus trichocarpa) (PtIPT7a eugene3.00041149；PtIPT7b eugene3.00080280；PtIPT5a fgenesh4_pg.C_LG_X000229； PtIPT5b_fgenesh4_pg · C_LG_VI 11001825)和巨桉（Eucalyptus grandis) (Eucgr ·Β01146; Eucgr.G00473;Eucgr.G01887;Eucgr.H03602)基因組鑒定的最接近的AtIPT7直向同系物 中，如圖3中所示。
[0047] 在進(jìn)化平均距離樹(shù)中，已經(jīng)顯示了AtIPT7和AtIPT5-起形成進(jìn)化枝。AtIPT5似乎 是AtIPT7的最接近的擬南芥屬直向同系物。在AtIPT7直向同系物之間，具有超過(guò)50%相似 同一性的共有序列，這里稱(chēng)為共有區(qū)域D，示于圖3中（大寫(xiě)字母表示具有100%相同氨基酸 的氨基酸，而小寫(xiě)字母表示比較的序列的50-90 %中相同的氨基酸）。在擬南芥 (A.thaliana)中IPT7氨基酸40-141對(duì)應(yīng)所述保守序列，圖3中第三行(序列表中SEQ ID N0: 6)〇
[0048] 核酸氨基酸序列的比對(duì)方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的，例如Smith-Waterman 算法(經(jīng)修改用于速度提升）以計(jì)算兩個(gè)序列的局部比對(duì)。Blast是用于同一性確定的最有 用的工具:Basic Local Alignment Search Tool，或BLAST，是用于比較一級(jí)生物學(xué)信息的 算法，例如不同蛋白的氨基酸序列或DNA序列的核苷酸。BLAST搜索使得研究者能夠?qū)⒉樵?xún) 序列與文庫(kù)或數(shù)據(jù)庫(kù)序列比較，并鑒定與查詢(xún)序列相似得高于特定閾值的文庫(kù)序列。根據(jù) 查詢(xún)序列，不同類(lèi)型的BLAST是可用的。BLAST程序由Stephen Altschul設(shè)計(jì)(Altschul， 1990)〇
[0049] 編碼酶細(xì)胞分裂素生物合成異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的基因可以選自編碼不同IPT的基 因，優(yōu)選選自編碼IPT的基因的組，其屬于酶類(lèi)EC 2.5.1.27。
[0050] 更優(yōu)選的是，編碼酶細(xì)胞分裂素生物合成異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的基因包含一個(gè)或多個(gè) 保守域區(qū)域A、B和/或C，所述保守域區(qū)域A、B和/或C具優(yōu)選自SEQ ID N0:3、4和5的一個(gè)或多 個(gè)氨基酸序列。
[0051] 還更優(yōu)選的是，編碼酶細(xì)胞分裂素生物合成異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的基因包含一個(gè)或多 個(gè)保守域區(qū)域A'、B'和/或C'，所述保守域區(qū)域A'、B'和/或C'具有擬南芥的9種IPT的在圖2 中所示的相應(yīng)域區(qū)域A'、B'和/或C'的一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列。
[0052] 仍然進(jìn)一步優(yōu)選的是，編碼酶細(xì)胞分裂素生物合成異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的基因包含區(qū) 域D，其具有與氨基酸序列SEQ ID N0:6(即SEQ ID N0:2中的對(duì)應(yīng)區(qū)域）具有至少80%同一 性，優(yōu)選至少85 %同一性，更優(yōu)選至少90 %同一性，還更優(yōu)選至少95 %同一性，更更優(yōu)選至 少98 %同一性，還更優(yōu)選至少99 %同一性，最優(yōu)選100 %同一性。
[0053] 編碼酶細(xì)胞分裂素生物合成異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的基因的其它區(qū)域可以以比編碼保 守域區(qū)域A、B和/或C或A'、B'和/或C'和/或區(qū)域D在更廣泛的范圍內(nèi)變化。這些區(qū)域中的同 一性％可以低于80%，低于75%，低于70%，低于60%，或甚至低于50%。
[0054] 在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼酶細(xì)胞分裂素生物合成異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的基因 編碼與SEQ ID N0:2顯示至少80 %同一性，優(yōu)選至少85 %同一性，更優(yōu)選至少90 %同一性， 還更優(yōu)選至少95 %同一性，更更優(yōu)選至少98 %同一性，還更優(yōu)選至少99 %同一性，最優(yōu)選 100%同一性的氨基酸序列。
[0055] 編碼酶細(xì)胞分裂素生物合成異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的基因可以選自編碼不同IPT的基 因，優(yōu)選編碼IPT 7或IPT 5的基因，更優(yōu)選IPT 7的基因。
[0056] 編碼酶細(xì)胞分裂素生物合成異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的基因可以來(lái)源于任意植物屬或種， 其表達(dá)酶功能性細(xì)胞分裂素生物合成異戊烯基轉(zhuǎn)移酶。典型地，植物是被子植物，優(yōu)選擬南 芥屬，樺木屬(Betula)、楊屬，或桉屬(Eucalyptus)植物。
[0057] 效應(yīng)基因 AT3G23630,擬南芥異戊烯基轉(zhuǎn)移酶7(AtIPT7)來(lái)自擬南芥屬，高度直向 同源的擬南芥屬I(mǎi)PT，AtIPT4蛋白的基因序列功能分析已經(jīng)由Kakimoto 2001發(fā)表。
[0058]本發(fā)明通過(guò)使用擬南芥屬細(xì)胞分裂素生物合成異戊烯基轉(zhuǎn)移酶IPT7編碼基因（基 因 AT3G23630)SEQ ID N0:1示例。所述基因編碼氨基酸序列SEQ ID N0:2。當(dāng)氨基酸序列SEQ ID NO: 2與來(lái)自其它來(lái)源的IPT比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)在域區(qū)域A、域區(qū)域B，和/或域區(qū)域C中或擬南芥 中的不同IPT之間可以發(fā)現(xiàn)緊密同源性，發(fā)現(xiàn)在域區(qū)域A'、域區(qū)域B'，和/或域區(qū)域C'中可以 發(fā)現(xiàn)緊密同源性(見(jiàn)圖2和2)。來(lái)自不同來(lái)源的氨基酸序列之間的這些區(qū)域的同一性％為至 少80 %，優(yōu)選至少85 %同一性，更優(yōu)選至少90 %同一性，還更優(yōu)選至少95 %同一性，甚至優(yōu) 選至少97 %同一性，越來(lái)越優(yōu)選至少98 %同一性，還更優(yōu)選至少99 %同一性，最優(yōu)選100 % 同一,性。
[0059] 因此，在本發(fā)明中，可能使用與來(lái)自擬南芥屬的IPT7基因相似的方式發(fā)揮功能的 基因，來(lái)自幾種其它的植物屬和種和/或來(lái)自不同的IPT。還可能使用與SEQ ID NO: 1相比包 含取代，插入，缺失或其它修飾的核酸序列，只要該核酸序列編碼酶細(xì)胞分裂素生物合成異 戊烯基轉(zhuǎn)移酶，優(yōu)選屬于酶類(lèi)EC2.5.1.27。更優(yōu)選地，所述酶屬于IPT7。
[0060] 編碼酶細(xì)胞分裂素生物合成異戊烯基轉(zhuǎn)移酶且用于如本文中所述的遺傳構(gòu)建體 中的核酸序列典型地是從它們的來(lái)源分離的序列，例如，擬南芥IPT7用于遺傳構(gòu)建體中，所 述遺傳構(gòu)建體導(dǎo)入楊屬細(xì)胞以培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因楊屬樹(shù)。然而，也可能增強(qiáng)編碼IPT的內(nèi)源性核酸 序列的表達(dá)。
[0061] 根據(jù)本公開(kāi)的遺傳構(gòu)建體包含第二核酸序列，其為允許植物的分生組織細(xì)胞中的 酶分裂素生物合成異戊烯基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的啟動(dòng)子。優(yōu)選的是，所述啟動(dòng)子允許形成層細(xì)胞 和頂端細(xì)胞中，更優(yōu)選特別在形成層細(xì)胞中的表達(dá)。
[0062]通過(guò)"啟動(dòng)子"表示的是結(jié)合RNA聚合酶并將酶指引到特定多核苷酸序列的適當(dāng)轉(zhuǎn) 錄起始位點(diǎn)的DNA區(qū)域。啟動(dòng)子可以另外包含其它識(shí)別序列，稱(chēng)為上游啟動(dòng)子元件，其影響 轉(zhuǎn)錄起始速率。
[0063]允許在形成層中的分生組織細(xì)胞中和頂端細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子的例子是樺木分 生組織啟動(dòng)子pBpCREl。該啟動(dòng)子優(yōu)選由SEQ ID N0:7(GenBank EU583454，Nieminen et al.2008)限定。
[0064] 允許在分生組織細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子的另一個(gè)例子是允許特異性在形成層細(xì)胞 中表達(dá)的啟動(dòng)子。此類(lèi)特異性在形成層細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子是楊屬形成層特異性啟動(dòng)子 pLM5,優(yōu)選由SEQ ID N0:8(pLM5啟動(dòng)子也描述于W02004097024A1，作為SEQIDN04 LMX5 A055P19U)限定。
[0065] 在該遺傳構(gòu)建體中，第一核酸序列（效應(yīng)器)可操作地連接到第二核酸序列（啟動(dòng) 子）。通過(guò)"可操作連接"表示的是兩個(gè)遺傳元件通過(guò)功能性聯(lián)系連接，例如效應(yīng)基因可操作 連接到允許所述效應(yīng)基因表達(dá)的啟動(dòng)子。
[0066] 遺傳構(gòu)建體也可以含有選擇標(biāo)志物，用于選擇包含引入的遺傳構(gòu)建體的細(xì)胞。選 擇標(biāo)志物例如是抗生素抗性氨芐青霉素、羧芐青霉素和潮霉素 B抗性。
[0067] 在本公開(kāi)中，啟動(dòng)子和效應(yīng)器的連接通過(guò)啟動(dòng)子pLMX5示例，其已經(jīng)可操作連接到 效應(yīng)基因，通過(guò)將其插入到Gateway 2nd盒克隆位點(diǎn)中的該效應(yīng)基因的緊密臨近中（圖4)。 [0068] 已經(jīng)使用了以下Gateway克隆引物：
[0069] IPT7_Fwd GW引物：
[0070] ACAAAAAAGCAGGCTTAATGAAGTTCTCAATCTCA(SEQ ID NO:9)
[0071] IPT7_REV GW引物：
[0072] TACAAGAAAGCTGGGTATCATATCATATTGTGGG(SEQ ID NO:10)
[0073] 當(dāng)已經(jīng)將LMX5::AtIPT7構(gòu)建體（SEQIDN0:ll)引入樹(shù)中時(shí)，具有LMX5::AtIPT7構(gòu) 建體的轉(zhuǎn)基因樹(shù)表現(xiàn)出擬南芥腺苷磷酸-異戊烯基轉(zhuǎn)移酶7(IPT;EC 2.5.1.27)的異位過(guò)表 達(dá)，通過(guò)LMX5啟動(dòng)子在形成層帶(cambial zone)中表達(dá)(描述于Love et al.2009)。在該轉(zhuǎn) 基因樹(shù)中，通過(guò)增加形成層帶中細(xì)胞分裂素植物激素的量，刺激細(xì)胞分裂素信號(hào)傳導(dǎo)。來(lái)自 擬南芥的腺苷磷酸-異戊烯基轉(zhuǎn)移酶7(AtIPT7)酶催化異戊二烯細(xì)胞分裂素的生物合成途 徑中的第一(限速)反應(yīng)。AtIPT7在擬南芥屬的維管組織中表達(dá)(Sakakibara，2006)。
[0074] 在圖4中呈現(xiàn)了以下區(qū)域：
[0075] -LB左邊界:根癌土壤桿菌;25bp;用于Ti-質(zhì)粒(Ti-plasmidin)中的毒力基因的識(shí) 別位點(diǎn);插入的起始(轉(zhuǎn)移到植物基因組中的質(zhì)粒的部分）。起始位置lstbp.ColEl(復(fù)制子）： 大腸桿菌PBR322質(zhì)粒的部分;615bp;細(xì)菌培養(yǎng)物的擴(kuò)增(不在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)）；
[0076] -β_內(nèi)酰胺酶(bla)_基因：大腸桿菌pBR322質(zhì)粒的部分;861bp:基因給予細(xì)菌培養(yǎng) 物中的氨芐青霉素/羧芐青霉素抗性(不在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)）；
[0077] -pLMX5:雜交白楊（Populustremula XP. tremuloides); 1807bp;用于過(guò)表達(dá)腺苷 磷酸-異戊烯基轉(zhuǎn)移酶7(AtIPT7)酶基因的啟動(dòng)子。起始位置第3000bp。
[0078] -attBl:合成的（Invitrogen公司）；19bp;Gateway技術(shù)中的重組位點(diǎn)；
[0079]-編碼腺苷磷酸-異戊烯基轉(zhuǎn)移酶7(AtIPT7)酶的基因；擬南芥;990bp。起始位置第 4845bp〇
[0080] -attB:合成的（Invitrogen公司）；17bp;Gateway技術(shù)中的重組位點(diǎn)；
[0081] _pAn〇S(胭脂氨酸合酶基因的非編碼3'區(qū)）：根癌土壤桿菌；約200bp(1);多聚腺苷 酸化信號(hào)（用于轉(zhuǎn)錄終止的信號(hào)）用于ERF基因；
[0082] -pnos，根癌土壤桿菌；約200bp(1);用于潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hpt)基因表達(dá)的啟動(dòng) 子；
[0083] _hpt;大腸桿菌；1000bp(1);基因給予針對(duì)用于選擇的潮霉素財(cái)允性；
[0084] -pAg4(TL-DNA:n基因 4):根癌土壤桿菌;約200bp(1);用于hpt基因的多聚腺甘酸化 信號(hào)
[0085] -RB('右邊界'）：根癌土壤桿菌；25bp:Ti_質(zhì)粒中的毒力基因的識(shí)別區(qū)；植物基因 組插入物的末端。⑴在原始參考文獻(xiàn)(Walden et al.，1990;Koncz et al.，1994)中該位點(diǎn) 的大小沒(méi)有限定，且其不能從其它來(lái)源推導(dǎo)。
[0086] -與土壤桿菌屬二元缺口修復(fù)載體(binary gap repair vector)pGAP_Hyg(完全 序列：Sequence ID: gb IEU933993 · 1長(zhǎng)度：7942)和與pBR322相似的主鏈載體。
[0087] 為了將該遺傳構(gòu)建體引入植物中通常需要載體。適合的載體為例如細(xì)菌根癌土壤 桿菌。
[0088] 也存在可用于將遺傳材料引入植物的可用的其它系統(tǒng)。此類(lèi)系統(tǒng)不必需要載體。 例如通過(guò)樹(shù)之間的有性繁殖和通過(guò)顆粒轟擊(將由經(jīng)DNA覆蓋的金射入細(xì)胞中）將遺傳材料 引入被子植物和裸子植物物種是可能的。
[0089] 本發(fā)明提供樹(shù)，其過(guò)表達(dá)編碼酶細(xì)胞分裂素生物合成異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的內(nèi)源性核 酸序列，或表達(dá)編碼酶細(xì)胞分裂素生物合成異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的外源性核酸序列。
[0090] 如本文所述，效應(yīng)基因需要在形成層細(xì)胞中表達(dá)。這通過(guò)使用一般允許在分生組 織細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子是可能的。然而，如果在任意分生組織細(xì)胞中增強(qiáng)細(xì)胞分裂是不利 的。例如，如果樹(shù)的樹(shù)葉生長(zhǎng)得非常大或緊密可能是不利的，雖然樹(shù)干積材同時(shí)增加。根據(jù) 本公開(kāi)，優(yōu)選使用允許在形成層細(xì)胞和頂端細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子，因?yàn)闃?shù)的總體生長(zhǎng)不會(huì) 太大，僅樹(shù)干積材生長(zhǎng)和高度的生長(zhǎng)。最優(yōu)選的是使用允許在形成層細(xì)胞中特異性表達(dá)的 啟動(dòng)子。在這種情況下，樹(shù)干積材生長(zhǎng)增加，但樹(shù)的總體生長(zhǎng)或樹(shù)木的高度不增加。意圖與 相同物種，齡和生長(zhǎng)條件的野生型樹(shù)進(jìn)行所有的比較。
[0091] 可以通過(guò)使用如本文所述的遺傳構(gòu)建體將效應(yīng)基因引入樹(shù)中?；蛘?，可以改進(jìn)樹(shù) 內(nèi)源的效應(yīng)基因的表達(dá)。例如在楊屬中，可以改進(jìn)楊屬I(mǎi)PT7的表達(dá)。
[0092] 可以通過(guò)異位過(guò)表達(dá)，通過(guò)就像通過(guò)備選啟動(dòng)子一樣驅(qū)動(dòng)內(nèi)源性基因，驅(qū)動(dòng)比內(nèi) 源性啟動(dòng)子更高的表達(dá)水平增強(qiáng)基因的表達(dá)。這可以通過(guò)將在選擇的啟動(dòng)子下的內(nèi)源性基 因的新拷貝導(dǎo)入基因組中完成?；蛘?，可以通過(guò)激活標(biāo)記(activation tagging)增強(qiáng)內(nèi)源 性基因的表達(dá)，其中增強(qiáng)子元件引入植物基因組中，在那里它們能夠增強(qiáng)它們臨近處中的 基因的轉(zhuǎn)錄。在將來(lái)，還可以通過(guò)基因編輯獲得內(nèi)源性基因的增強(qiáng)的表達(dá)，例如，使用工程 化的核酸酶，其可以用于刪除抑制期望基因的表達(dá)的沉默子元件(silencor element)。
[0093] 與WT樹(shù)木相比，如本文所述產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因樹(shù)在形成層發(fā)育期間在形成層細(xì)胞中表 達(dá)高至少40%，優(yōu)選至少44%，更優(yōu)選至少46%，仍然更優(yōu)選至少50%，越來(lái)越優(yōu)選至少 60 %水平的細(xì)胞分裂素信號(hào)傳導(dǎo)。
[0094] 此外，與野生型(WT)樹(shù)木相比，在如本文所述產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因樹(shù)中，在所述樹(shù)中的樹(shù) 干積材生長(zhǎng)高至少35%，優(yōu)選至少38%，更優(yōu)選至少40%，仍然更優(yōu)選至少45%，越來(lái)越優(yōu) 選至少50 %。
[0095]在本發(fā)明的一個(gè)方面，優(yōu)選地，在形成層細(xì)胞中表達(dá)效應(yīng)基因的樹(shù)屬于被子植物。 該樹(shù)是一年生樹(shù)或多年生樹(shù)，優(yōu)選多年生樹(shù)。該樹(shù)屬于樺木屬、楊屬或桉屬。優(yōu)選地，該樹(shù)木 屬于楊屬。該楊屬選自楊屬品種P. tremula，銀白楊(P.alba)，美洲山楊(P. tremuloides)， P· canescens，美洲黑楊（P · deltoids)，P · fremontii，小黑楊（P ·nigra)，P · Canadensis， P. inopina，和歐洲山楊(Populustremula)x美洲山楊（tremuloides)的組。
[0096] 在本發(fā)明的第二個(gè)方面，在形成層細(xì)胞中表達(dá)效應(yīng)基因的樹(shù)屬于裸子植物。該樹(shù) 優(yōu)選是云杉(spruce)或松樹(shù)(pine)。
[0097] 本發(fā)明還包含從本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因樹(shù)可獲得的多種木材產(chǎn)品。此類(lèi)木材產(chǎn)品是例如 樹(shù)干、樹(shù)枝、樹(shù)根和種子。
[0098] 本發(fā)明還提供用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述轉(zhuǎn)基因植物與野生型植物相比有 增加的生物量生產(chǎn)和/或增加的樹(shù)干積材生長(zhǎng)的能力。所述方法包括以下步驟
[0099] -向樹(shù)細(xì)胞導(dǎo)入可操作地連接到允許在形成層細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子的編碼酶細(xì)胞 分裂素生物合成異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列，
[0100] -培養(yǎng)所述細(xì)胞以形成細(xì)胞培養(yǎng)物，
[0101] -將所述細(xì)胞培養(yǎng)物再生為植物，其中所述編碼酶細(xì)胞分裂素生物合成
[0102] 異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列在形成層發(fā)育期間在形成層細(xì)胞中表達(dá)。
[0103] 用于被子樹(shù)木的基于土壤桿菌屬的轉(zhuǎn)化方法已經(jīng)由例如Hiiggmanet al.2003， Seppiinenet al.2004和Nilsson et al.1992發(fā)表。一般來(lái)說(shuō)，該方法包括植物外植體 (explant)(葉盤(pán)、莖段等)在土壤桿菌屬培養(yǎng)物中孵育，其后將它們與土壤桿菌屬細(xì)菌在固 體培養(yǎng)基上共培養(yǎng)。為了結(jié)束該共培養(yǎng)，通過(guò)洗滌去除土壤桿菌屬細(xì)菌。植物外植體在愈傷 組織生產(chǎn)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基通過(guò)抗生素補(bǔ)充以將愈傷組織生產(chǎn)限制為攜帶抗生素 抗性基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。將形成中的愈傷組織轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基上用于芽產(chǎn)生。將再生的 芽轉(zhuǎn)移到根誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。在根形成后，該小植株可以在土壤中生長(zhǎng)。
[0104] 本發(fā)明還提供用于改進(jìn)樹(shù)中生物量生產(chǎn)和/或增加的樹(shù)干積材生長(zhǎng)的方法。所述 方法包括以下步驟
[0105] -向樹(shù)細(xì)胞引入可操作地連接到允許在形成層細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子的編碼酶細(xì)胞 分裂素生物合成異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列，
[0106] -培養(yǎng)所述細(xì)胞以形成細(xì)胞培養(yǎng)物，
[0107] -將所述細(xì)胞培養(yǎng)物再生為植物，其中所述編碼酶細(xì)胞分裂素生物合成異戊烯基 轉(zhuǎn)移酶的基因在形成層發(fā)育期間在形成層細(xì)胞中表達(dá)，
[0108] -允許所述植物生長(zhǎng)為成年樹(shù)木，其具有與野生型樹(shù)相比增強(qiáng)的徑向生長(zhǎng)。
[0109] 在土壤桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化中，植物外植體與含有期望轉(zhuǎn)基因的土壤桿菌屬細(xì)菌共 培養(yǎng)。土壤桿菌屬細(xì)菌通過(guò)將轉(zhuǎn)基因 DNA整合到植物基因組中轉(zhuǎn)化外植體中的植物細(xì)胞。放 置到可選擇的生根和生芽培養(yǎng)基上，將從轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物。
[0110]在顆粒(微粒)轟擊方法中，用DNA包被金或鎢顆粒并射擊到植物細(xì)胞中。插入的 DNA將整合到植物基因組中。
[0111] 在電穿孔方法中，使用電擊(electric shock)在植物原生質(zhì)膜中形成瞬時(shí)的孔； 這允許轉(zhuǎn)基因 DNA進(jìn)入植物原生質(zhì)。
[0112] 在病毒轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)導(dǎo))方法中，期望的轉(zhuǎn)基因包裝到適合的植物病毒中，且通過(guò)該病 毒感染植物。轉(zhuǎn)基因材料將整合到植物基因組中。
[0113] 通過(guò)"增加的生物量生產(chǎn)"這里表示與相同年的野生型樹(shù)相比轉(zhuǎn)基因樹(shù)的生物量 (樹(shù)干干重質(zhì)量)的額外量。
[0114] 在本說(shuō)明書(shū)中，WT樹(shù)的樹(shù)干干質(zhì)量在16周齡測(cè)量（3棵樹(shù)的平均值）且為35±2 (STDEV)g，而 pLMX5-IPT7 樹(shù)(3 棵樹(shù)木)的樹(shù)干為 51±8g。
[0115] 通過(guò)"增加的樹(shù)干積材生長(zhǎng)"這里表示與相同齡的野生型樹(shù)相比轉(zhuǎn)基因樹(shù)中樹(shù)干 積材的額外量。
[0116] 在本說(shuō)明書(shū)中，每周一次測(cè)量樹(shù)干積材，3個(gè)測(cè)量點(diǎn)（土壤水平以上10cm，樹(shù)中間， 頂點(diǎn)以下2cm)，通過(guò)fructa公式計(jì)算積材(底部到中間和中間到頂點(diǎn)的總和）。
[0117]
[0118] 具中v =體枳
[0119] h =高度 [0120] r =上部的半徑
[0121] R =下部的半徑
[0122] http://www.mathwords.com/f/frustum.htm
[0123] 與野生型樹(shù)相比，轉(zhuǎn)基因 IPT7過(guò)表達(dá)的樹(shù)具有更多的樹(shù)干積材(圖5)。轉(zhuǎn)基因樹(shù)中 的樹(shù)干積材生長(zhǎng)平均高53%，并且高至少38% (如果考慮標(biāo)準(zhǔn)誤差的話）。
[0124] 與WT樹(shù)相比，轉(zhuǎn)基因樹(shù)在形成層發(fā)育期間在形成層細(xì)胞中表達(dá)平均高83%和高至 少44% (如果考慮標(biāo)準(zhǔn)誤差的話)的水平的細(xì)胞分裂素信號(hào)傳導(dǎo)。
[0125] 本發(fā)明還包括應(yīng)用，其中該轉(zhuǎn)基因樹(shù)是沒(méi)有花、花粉或種子發(fā)育的能力的不育樹(shù)。 用于產(chǎn)生不育樹(shù)的方法對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是已知的。
[0126] 可以選擇具有不同染色體數(shù)量的兩種相關(guān)物種之間的雜交體(例如四倍體與二倍 體雜交以制成不育的三倍體）的不育克隆用于轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)基因樹(shù)可以無(wú)性繁殖并測(cè)試它們的 不育性(用于消除的，敗育的或不育的花，花粉或種子發(fā)育）。
[0127] 為了示例本發(fā)明，本文描述了表現(xiàn)出升高的細(xì)胞分裂素信號(hào)傳導(dǎo)水平的轉(zhuǎn)基因樹(shù) 的工程化。在這些樹(shù)中，分析了生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素分布和信號(hào)傳導(dǎo)的狀態(tài)和模式。
[0128] 表征了楊屬樹(shù)干中穿過(guò)形成層分生組織的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素概況的濃度。此 外，為了將細(xì)胞分裂素激素概況分析(prifiling)與細(xì)胞分裂素信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)聯(lián)，進(jìn)行了對(duì) 穿過(guò)楊屬形成層帶的細(xì)胞分裂素生物合成和信號(hào)傳導(dǎo)基因的表達(dá)概況的廣泛分析。
[0129] 為了更好理解在形成層細(xì)胞分裂的調(diào)節(jié)中兩種主要的激素途徑，細(xì)胞分裂素和生 長(zhǎng)素之間的相互作用，分析了穿過(guò)毛果楊(Populustrichocarpa)樹(shù)干的形成層帶的它們的 濃度水平。分析了代表韌皮部，引導(dǎo)韌皮部，發(fā)育韌皮部，形成層，發(fā)育木質(zhì)部和木質(zhì)部組織 的樹(shù)干冷凍切片（圖6)。
[0130] 為了驗(yàn)證分析的冷凍切片的組織身份，在分析中包括了多種組織類(lèi)型的標(biāo)志物基 因。PtSUC用作韌皮部細(xì)胞標(biāo)志物，PtANT，作為分裂的形成層細(xì)胞的標(biāo)志物，和PtC0MT2用于 韌皮部纖維和木質(zhì)部細(xì)胞。標(biāo)志物與產(chǎn)生冷凍切片期間通過(guò)顯微術(shù)確定的組織身份很好地 相關(guān)。
[0131] 本發(fā)明基于對(duì)細(xì)胞分裂素在樹(shù)干的形成層發(fā)育的調(diào)節(jié)中的功能的詳細(xì)分析。以與 生長(zhǎng)素相似的方式，細(xì)胞分裂素激素也具有穿過(guò)形成層帶的濃度梯度。細(xì)胞分裂素濃度峰 值與該激素的生物合成和信號(hào)傳導(dǎo)基因的的高表達(dá)域相一致。
[0132] 除了 PtCKIl基因外，檢測(cè)到了楊屬形成層中細(xì)胞分裂素生物合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑 的所有組分的表達(dá)。CKI1基因的有效表達(dá)水平非常低，在表達(dá)分析的檢測(cè)極限以下，或者它 們對(duì)于楊屬樹(shù)的活躍生長(zhǎng)期間形成層發(fā)育不是需要的。
[0133] 細(xì)胞分裂素信號(hào)傳導(dǎo)的所有組分的表達(dá)確認(rèn)了該激素信號(hào)傳導(dǎo)途徑對(duì)于維管形 成層的活動(dòng)的重要性。
[0134] 有趣的是，細(xì)胞分裂素的形成層分布概況與生長(zhǎng)素的濃度概況不同，但部分重疊。 高生長(zhǎng)素濃度被限制在活躍分裂的，未分化的形成層細(xì)胞區(qū)域;而高的細(xì)胞分裂素濃度具 有較大的區(qū)域，從未分化的形成層延伸到發(fā)育的韌皮部。
[0135] 在本公開(kāi)中，已經(jīng)示出了通過(guò)刺激轉(zhuǎn)基因楊屬樹(shù)中的細(xì)胞分裂素信號(hào)傳導(dǎo)可以提 高樹(shù)干中的生物量積累。這些樹(shù)表現(xiàn)出增強(qiáng)的細(xì)胞分裂素反應(yīng)性以及升高水平的細(xì)胞分裂 素信號(hào)傳導(dǎo)。與WT樹(shù)木相比，轉(zhuǎn)基因樹(shù)的形成層細(xì)胞分裂活性增加，并分別地，樹(shù)干的徑向 生長(zhǎng)加速。由于這些樹(shù)為WT高度的，細(xì)胞分裂素對(duì)徑向生長(zhǎng)的刺激效果不依賴(lài)于頂端生長(zhǎng) 速率。此外，細(xì)胞分裂素的該刺激作用似乎通過(guò)CK和生長(zhǎng)素之間的串?dāng)_發(fā)生:升高的CK濃度 和信號(hào)傳導(dǎo)增加形成層區(qū)中的生長(zhǎng)素濃度和信號(hào)傳導(dǎo)的水平并加寬其區(qū)域。潛在地，生長(zhǎng) 素和細(xì)胞分裂素作用的部分重疊的區(qū)域在調(diào)節(jié)不同的發(fā)育過(guò)程中具有特定的功能，所述發(fā) 育過(guò)程發(fā)生于形成層帶間。在形成層中間的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素之間的串?dāng)_可能限定用于 維持活躍分化的細(xì)胞合并物的干細(xì)胞小生境(niche)。分別地，可能地，在形成層帶的韌皮 部側(cè)的高細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素比率有助于確定發(fā)育的維管細(xì)胞的韌皮部身份。
[0136] 通過(guò)以下非限制性實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明。本發(fā)明適用于與實(shí)施例中闡明的基因，遺 傳構(gòu)建體和植物不同的基因，遺傳構(gòu)建體和植物。然而，應(yīng)當(dāng)理解，以上說(shuō)明書(shū)中和實(shí)施例 中給出的實(shí)施方案僅用于說(shuō)明的目的，且各種改變和修飾可能在本發(fā)明的范圍內(nèi)。 實(shí)施例
[0137] 實(shí)施例1
[0138] 具有刺激的形成層細(xì)胞分裂素信號(hào)傳導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因楊屬樹(shù)的工程化
[0139] 為了研究細(xì)胞分裂素信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)樹(shù)干生長(zhǎng)的影響，轉(zhuǎn)基因楊屬（P.tremula X tremuloides)樹(shù)經(jīng)工程化以表現(xiàn)出形成層發(fā)育期間升高的細(xì)胞分裂素信號(hào)傳導(dǎo)。為了刺激 生物合成，使用了來(lái)自擬南芥屬的編碼細(xì)胞分裂素生物合成異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的AtIPT7基 因。該AtIPT7基因在形成層特異性的PttLMX5啟動(dòng)子(Love et al.2009)下表達(dá)，其在形成 層和發(fā)育的木質(zhì)部細(xì)胞中表現(xiàn)出高表達(dá)。
[0140] 獲得了具有LMX5: :IPT7構(gòu)建體的幾種單獨(dú)的轉(zhuǎn)基因品系，顯示可檢測(cè)的AtIPT7表 達(dá)。在未轉(zhuǎn)化的品系中沒(méi)有檢測(cè)到AtIPT7表達(dá)。選擇了具有高轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平的兩個(gè)品系 (AtIPT7 1和3)用于進(jìn)一步分析。
[0141] 實(shí)施例2
[0142] 轉(zhuǎn)基因品系中加速的樹(shù)干徑向生長(zhǎng)
[0143] 為了評(píng)價(jià)AtIPT7活性對(duì)樹(shù)發(fā)育的影響，在溫室條件下研究了轉(zhuǎn)基因樹(shù)的生長(zhǎng)動(dòng)力 學(xué)（圖5六）。？11?5::4??17品系的頂端生長(zhǎng)速率與野生型植物相似;該轉(zhuǎn)基因植物具有與相 同齡的對(duì)照相同的高度(圖5A)。相反，與WT樹(shù)相比，轉(zhuǎn)基因樹(shù)中樹(shù)干的直徑增加。分別地，樹(shù) 干積材(其計(jì)算為沒(méi)有樹(shù)葉的節(jié)間的附加體積(additive volume of internodes))比WT樹(shù) 的樹(shù)干積材更大（圖5B)。
[0144] 圖5A示出了三個(gè)月齡的WT和pLMX5-IPT7品系1和3楊屬樹(shù)的表型。所有的樹(shù)具有相 似的高度。
[0145] 圖5B示出了與WT相比，轉(zhuǎn)基因 pLMX5-IPT7楊屬品系1和3的樹(shù)干體積（trunk volume)。與WT相比，轉(zhuǎn)基因品系的總樹(shù)干體積增加。數(shù)值從每個(gè)品系的五個(gè)單獨(dú)的樹(shù)取平 均值（土 SD)。
[0146] 實(shí)施例3
[0147] 轉(zhuǎn)基因品系的增強(qiáng)的細(xì)胞分裂素反應(yīng)性
[0148] 為了評(píng)價(jià)形成層AtIPT7表達(dá)對(duì)于細(xì)胞分裂素信號(hào)傳導(dǎo)的影響，測(cè)試了轉(zhuǎn)基因樹(shù)的 細(xì)胞分裂素反應(yīng)性。在經(jīng)典的細(xì)胞分裂素反應(yīng)性測(cè)定(Skoog&Mi 1 ler 1957)中，低的細(xì)胞分 裂素比生長(zhǎng)素比率誘導(dǎo)從植物段的根再生，而高的細(xì)胞分裂素比生長(zhǎng)素比率轉(zhuǎn)而促進(jìn)芽再 生。在該測(cè)定中，從溫室種植的轉(zhuǎn)基因和WT品系切下芽段，然后在具有不同濃度的反式玉米 素 (trans-zeatin)(tZ)的培養(yǎng)基上在體外條件下培養(yǎng)。
[0149] 在該測(cè)定中，大多數(shù)來(lái)自IPT7品系的莖段即使在0.5mg/l tZ濃度中也產(chǎn)生芽，而 只有很少的WT樣品能夠這樣(圖5C)。該結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因品系表現(xiàn)出細(xì)胞分裂素信號(hào)傳導(dǎo)的 升高的基礎(chǔ)水平，因?yàn)榧词故侵械葷舛鹊膽?yīng)用的細(xì)胞分裂素能誘導(dǎo)芽產(chǎn)生;一種典型的細(xì) 胞分裂素反應(yīng)表型。另外，該轉(zhuǎn)基因品系在具有〇mg/l tZ的培養(yǎng)基上產(chǎn)生根。由于生長(zhǎng)素， 與細(xì)胞分裂素一起，促進(jìn)根的形成，該結(jié)果表明這些品系可能比對(duì)照樹(shù)具有更多的細(xì)胞分 裂素和生長(zhǎng)素兩者。
[0150]圖5C描繪了 WT和pLMX5-IPT7品系的細(xì)胞分裂素反應(yīng)性測(cè)定。莖段在具有0.5mg/L 生長(zhǎng)素（IAA)和0，0.5或1.5mg/L的細(xì)胞分裂素 t-玉米素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。在低細(xì)胞分裂素 濃度下(〇.5mg/L)，轉(zhuǎn)基因品系已經(jīng)再生芽，而WT要求更高（1.5mg)濃度的該激素。
[0151] 實(shí)施例4
[0152] 轉(zhuǎn)基因樹(shù)中增強(qiáng)的形成層細(xì)胞分裂素信號(hào)水平傳導(dǎo)
[0153] 研究了轉(zhuǎn)基因樹(shù)中形成層細(xì)胞分裂素信號(hào)傳導(dǎo)的狀態(tài)。分析了兩種細(xì)胞分裂素標(biāo) 志物基因的表達(dá)水平。兩種標(biāo)志物基因用于評(píng)價(jià)細(xì)胞分裂素信號(hào)傳導(dǎo)水平:細(xì)胞分裂素受 體PttHK3a和A型反應(yīng)調(diào)節(jié)子PttRR7。通過(guò)生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)標(biāo)志物基因（PttIAA3)研究了生 長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)的水平。PttRR7代表了細(xì)胞分裂素磷酸接力(phosphorelay)的初級(jí)反應(yīng)基 因：A型反應(yīng)調(diào)芐基因的表達(dá)由細(xì)胞分裂素信號(hào)傳導(dǎo)上調(diào)：該基因的表達(dá)水平反映了分析的 樹(shù)中發(fā)生的細(xì)胞分裂素反應(yīng)的水平。在IPT7品系中，細(xì)胞分裂素受體PttHK3a的表達(dá)與WT樹(shù) 中基本相同，而PttRR7和PttIAA3的表達(dá)水平升高（圖OT)。
[0154] 圖?描繪了WT和pLMX5-IPT7品系1樹(shù)干中細(xì)胞分裂素受體(PttHK3a)，細(xì)胞分裂素 信號(hào)初級(jí)反應(yīng)基因(A型RR PttRR7)和生長(zhǎng)素信號(hào)標(biāo)志物基因（PttIAA3)的表達(dá)。與WT相比， PttRR7和PttIAA3的表達(dá)水平上升，而PttHK3a的表達(dá)不受影響。通過(guò)qRT-PCR分析了每個(gè)品 系兩個(gè)獨(dú)立的樹(shù)木(誤差線=SD)。
[0155] 該結(jié)果表明通過(guò)升高的CK濃度，細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素信號(hào)的水平成功地提高，而 細(xì)胞分裂素感知的能力沒(méi)有改變。
[0156] 實(shí)施例5
[0157] 轉(zhuǎn)基因樹(shù)中增加的形成層細(xì)胞分裂數(shù)量
[0158] 為了研究升高的細(xì)胞分裂素信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)維管結(jié)構(gòu)的影響，分析了轉(zhuǎn)基因樹(shù)的形成 層解剖結(jié)構(gòu)。在橫截面中限定了分生組織的未分化的形成層細(xì)胞為小的且扁平的薄壁細(xì) 胞，定位于分化中的木質(zhì)部和韌皮部細(xì)胞之間的形成層細(xì)胞隊(duì)列中。首先分化的木質(zhì)部和 韌皮部細(xì)胞定義為具有較大和較圓的大小。在IPT7樹(shù)中，維管形成層在形成層細(xì)胞隊(duì)列中 比WT樹(shù)含有更多的分生組織細(xì)胞(24對(duì)15)(圖6A-B)?；谠黾拥募?xì)胞數(shù)量，可以得出結(jié)論 與WT相比形成層細(xì)胞隊(duì)列經(jīng)歷了額外的細(xì)胞分裂。
[0159] 此外，研究了是否除了刺激細(xì)胞分裂速率之外，升高的細(xì)胞分裂素信號(hào)傳導(dǎo)也影 響產(chǎn)生的木質(zhì)部細(xì)胞的形態(tài)學(xué)。要了解這一點(diǎn)，在浸漬的樹(shù)干樣品中分析了木質(zhì)部細(xì)胞、維 管和纖維的尺寸。與WT樹(shù)相比，IPT7樹(shù)中的木質(zhì)部細(xì)胞的長(zhǎng)度和寬度沒(méi)有顯著差異。
[0160] 實(shí)施例6
[0161]升高的細(xì)胞分裂素信號(hào)傳導(dǎo)影響形成層生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)域
[0162] 接下來(lái)，研究了形成層分生組織的激素調(diào)節(jié)如何對(duì)升高的細(xì)胞分裂素濃度反應(yīng)。 為了研究這個(gè)，通過(guò)激素濃度和標(biāo)志物基因表達(dá)研究對(duì)形成層激素信號(hào)傳導(dǎo)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行概 況分析。在轉(zhuǎn)基因樹(shù)中，生物活性的iP和tZ的濃度高幾乎30%，而IAA和cZOG濃度翻倍。值得 注意的是，在WT和轉(zhuǎn)基因品系之間，細(xì)胞分裂素分布概況大體相似，而生長(zhǎng)素分布的形狀不 同。轉(zhuǎn)基因樹(shù)具有較寬范圍的高生長(zhǎng)素濃度:IAA水平在發(fā)育的木質(zhì)部和木質(zhì)部細(xì)胞中比在 WT中高。
[0163] 為了將激素概況與信號(hào)傳導(dǎo)模式相連，表征了整個(gè)形成層區(qū)間的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分 裂素信號(hào)傳導(dǎo)標(biāo)志物基因的表達(dá)模式。使用PttRR7作為細(xì)胞分裂素的標(biāo)志物，并且使用 PttIAA3作為生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)的標(biāo)志物。與激素濃度研究相似，分析了代表韌皮部，發(fā)育韌 皮部，形成層，發(fā)育木質(zhì)部和木質(zhì)部的冷凍切片。PttSUC2和PttCOMT分別用作韌皮部和韌皮 部纖維以及木質(zhì)部細(xì)胞的標(biāo)志物基因，以確定切片的身份。分析了兩棵野生型樹(shù)和兩棵 IPT7樹(shù)。在轉(zhuǎn)基因和WT樹(shù)兩者中，RR7表達(dá)在發(fā)育的韌皮部組織中達(dá)到峰值，在那里韌皮部 標(biāo)志物PtSUC2也具有高表達(dá)（圖6)。形成層，其中韌皮部和木質(zhì)部標(biāo)志物具有低表達(dá)水平， 表現(xiàn)出高IAA3和上升的RR7表達(dá)水平。發(fā)育的木質(zhì)部組織具有高IAA3和上升的C0MT表達(dá)，而 在成熟的木質(zhì)部中僅木質(zhì)部標(biāo)志物的表達(dá)較高。
[0164] 當(dāng)將WT和轉(zhuǎn)基因樹(shù)比較時(shí)，可以看到IPT7樹(shù)具有較寬區(qū)域的高生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)。 與WT樹(shù)相比，形成層(其是高IAA3和RR7表達(dá)的區(qū)域），以及發(fā)育的木質(zhì)部(高IAA3和中等RR7 表達(dá)的區(qū)域)組織在轉(zhuǎn)基因品系中更大（圖6)。生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)的擴(kuò)寬區(qū)域與分生組織細(xì)胞 數(shù)量的增加一致。
[0165] 圖6中示出了WT(A)和轉(zhuǎn)基因楊屬品系pLMX5: : IPT7品系1樹(shù)干(B)的形成層解剖結(jié) 構(gòu)，激素含量和激素信號(hào)傳導(dǎo)概況。在IPT7樹(shù)中，維管形成層在形成層細(xì)胞隊(duì)列中含有比WT 樹(shù)中更多的分生組織細(xì)胞(24對(duì)15)。收集了四個(gè)部分(A-D)用于激素分析。在WT中，第4個(gè)部 分代表完全發(fā)育的木質(zhì)部細(xì)胞，而在PLMX5: : IPT7中，其仍然含有發(fā)育中的木質(zhì)部細(xì)胞，表 明形成層分生組織區(qū)在PLMX5: : IPT7樹(shù)干中比在WT中更寬。
[0166] 在四個(gè)形成層部分(A-D)中分析了生長(zhǎng)素（IAA)和生物活性細(xì)胞分裂素（iP和tZ) 連同細(xì)胞分裂素貯存形式(cZOG)的激素概況。在轉(zhuǎn)基因樹(shù)中生物活性的細(xì)胞分裂素 iP和tZ 的濃度高幾乎30%，而IAA和cZOG濃度翻倍。值得注意的是，在WT和轉(zhuǎn)基因品系之間，細(xì)胞分 裂素分布概況大體相似，而生長(zhǎng)素分布的形狀不同。轉(zhuǎn)基因樹(shù)具有高生長(zhǎng)素濃度的較寬區(qū) 域(通過(guò)灰色陰影突出顯示）。
[0167]為了將激素概況和信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)域相關(guān)，通過(guò)在來(lái)自韌皮部（1)到木質(zhì)部（14)組織 的14個(gè)冷凍切片中的qRT-PCR分析了標(biāo)志物基因的表達(dá)模式。圖下方的字母表示了四個(gè)激 素分析部分(A-D)的位置用作韌皮部標(biāo)志物，細(xì)胞分裂素初級(jí)反應(yīng)基因 PttRR7作 為CK信號(hào)傳導(dǎo)標(biāo)志物，PttIAA3作為生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)標(biāo)志物，和PttC0MT2作為韌皮部纖維和 木質(zhì)部身份標(biāo)志物。基于PttRR7表達(dá)，細(xì)胞分裂素信號(hào)傳導(dǎo)水平在pLMX5: :IPT7樹(shù)中升高。 取而代之，高細(xì)胞分裂素濃度區(qū)域(WT和pLMX5: :ΙΡΤ7兩者中部分3-7)的寬度沒(méi)有被影響。 相反，具有高生長(zhǎng)素標(biāo)志物基因表達(dá)和降低的細(xì)胞分裂素標(biāo)志物基因表達(dá)的形成層區(qū)域 (WT部分5-7對(duì)pLMX5: :ΙΡΤ7部分5-11)在轉(zhuǎn)基因品系中比WT樹(shù)木中更寬（3對(duì)7個(gè)部分）。在WT 中轉(zhuǎn)基因 AtIPT7表達(dá)的水平在檢測(cè)極限以下，而在pLMX5: :ΙΡΤ7樹(shù)的形成層帶處具有高表 達(dá)。
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【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種遺傳構(gòu)建體，其包含與第二核酸序列（啟動(dòng)子)可操作連接的編碼酶細(xì)胞分裂素 生物合成異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的第一核酸序列（效應(yīng)器），所述第二核酸序列允許所述第一核酸 序列在形成層細(xì)胞中表達(dá)，所述第一核酸序列為選自下組： a) 包含SEQ ID NO: 1的核酸序列； b) 編碼SEQ ID NO:2的核酸序列； c) 編碼包含保守域區(qū)域A、B和/或C的氨基酸序列的核酸序列，所述保守域區(qū)域A、B和/ 或C具有選自下組的氨基酸序列：SEQ ID N0:3、4和5; d) 編碼包含區(qū)域D的氨基酸序列的核酸序列，所述區(qū)域D與氨基酸序列SEQ ID N0:6具 有至少80 %同一性； e) 編碼與SEQ ID N0:2顯示至少80%同一性的氨基酸序列的核酸序列;和 f) 編碼酶的核酸序列，所述酶屬于酶類(lèi)EC 2.5.1.27。2. 根據(jù)權(quán)利要求1的遺傳構(gòu)建體，其中所述第一核酸序列編碼腺苷磷酸-異戊烯基轉(zhuǎn)移 酶7，IPT7。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的遺傳構(gòu)建體，其中所述第一核酸序列來(lái)源于擬南芥屬 (Arabidopsis)04. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的遺傳構(gòu)建體，其中所述第二核酸序列是樺樹(shù)分生組織 啟動(dòng)子pBpCREl，優(yōu)選通過(guò)SEQIDN0 :7限定。5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的遺傳構(gòu)建體，其中所述第二核酸序列是形成層特異性 啟動(dòng)子。6. 根據(jù)權(quán)利要求5的遺傳構(gòu)建體，其中所述啟動(dòng)子是楊屬(Populus)形成層特異性啟動(dòng) 子PLM5,優(yōu)選通過(guò)SEQ ID NO:8限定。7. -種載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的遺傳構(gòu)建體。8. -種樹(shù)，其特征在于它在形成層細(xì)胞中 (a) 過(guò)表達(dá)內(nèi)源性核酸序列，或 (b) 表達(dá)外源性核酸序列， 所述內(nèi)源性核酸序列和外源性核酸序列編碼酶細(xì)胞分裂素生物合成異戊烯基轉(zhuǎn)移酶。9. 根據(jù)權(quán)利要求8的樹(shù)，其中所述樹(shù)表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的遺傳構(gòu)建體或 權(quán)利要求7的載體。10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9的樹(shù)，其中與WT樹(shù)相比，所述樹(shù)在形成層發(fā)育期間在形成層細(xì)胞 中表達(dá)高至少40%，優(yōu)選至少50%水平的細(xì)胞分裂素信號(hào)傳導(dǎo)。11. 根據(jù)權(quán)利要求8至10中任一項(xiàng)的樹(shù)，其中與WT樹(shù)相比，所述樹(shù)中的樹(shù)干積材生長(zhǎng)高 至少35%，優(yōu)選高至少40%。12. 根據(jù)權(quán)利要求8至11中任一項(xiàng)的樹(shù)，其中所述樹(shù)屬于被子植物。13. 根據(jù)權(quán)利要求12的樹(shù)，其中所述樹(shù)選自下組:樺木屬，楊屬，和桉屬，優(yōu)選楊屬。14. 根據(jù)權(quán)利要求8至13中任一項(xiàng)的樹(shù)，其中所述樹(shù)屬于裸子植物。15. 根據(jù)權(quán)利要求14的樹(shù)，其中所述樹(shù)選自下組:云杉和松樹(shù)。16. 從如權(quán)利要求8至15中任一項(xiàng)限定的樹(shù)可獲得的木材產(chǎn)品。17. -種用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述轉(zhuǎn)基因植物與野生型植物相比有增加的生 物量生產(chǎn)和/或增加的樹(shù)干積材生長(zhǎng)的能力，所述方法包括以下步驟 -向樹(shù)細(xì)胞導(dǎo)入可操作地連接到允許在形成層細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子的編碼酶細(xì)胞分裂 素生物合成異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列， -培養(yǎng)所述細(xì)胞以形成細(xì)胞培養(yǎng)物， -將所述細(xì)胞培養(yǎng)物再生為植物，其中所述編碼酶細(xì)胞分裂素生物合成異戊烯基轉(zhuǎn)移 酶的核酸序列在形成層發(fā)育期間在形成層細(xì)胞中表達(dá)。18.-種用于改進(jìn)樹(shù)中生物量生產(chǎn)和/或增加的樹(shù)干積材生長(zhǎng)的方法，其包括以下步驟 -向樹(shù)細(xì)胞導(dǎo)入可操作地連接到允許在形成層細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子的編碼酶細(xì)胞分裂 素生物合成異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列， -培養(yǎng)所述細(xì)胞以形成細(xì)胞培養(yǎng)物， -將所述細(xì)胞培養(yǎng)物再生為植物，其中所述編碼酶細(xì)胞分裂素生物合成異戊烯基轉(zhuǎn)移 酶的基因在形成層發(fā)育期間在形成層細(xì)胞中表達(dá)， -允許所述植物生長(zhǎng)為成年樹(shù)，其具有與野生型樹(shù)相比增強(qiáng)的徑向生長(zhǎng)。
【文檔編號(hào)】A01H7/00GK105916988SQ201480071586
【公開(kāi)日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2014年12月29日
【發(fā)明人】J.伊曼嫩, Y.赫拉里烏塔, K.尼米嫩
【申請(qǐng)人】斯道拉恩索公司