一種植物多基因遺傳轉(zhuǎn)化的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種植物多基因遺傳轉(zhuǎn)化的方法，特別是涉及一種植物多基因遺傳轉(zhuǎn)化的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]以柳枝稷和芒草為代表的能源草屬于C4多年生高大草本能源植物，富含木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)，產(chǎn)量大、適應(yīng)性強(qiáng)且不占用耕地，符合生物質(zhì)能發(fā)展“不與民爭(zhēng)糧，不與糧爭(zhēng)地”的基本國(guó)策。當(dāng)前主要能源草品種無(wú)論在種植和農(nóng)田管理方面，還是在育種和遺傳改良領(lǐng)域，都積累了大量的數(shù)據(jù)和豐富的經(jīng)驗(yàn)。同時(shí)，能源草的適應(yīng)性強(qiáng)，地理分布范圍廣。此夕卜，柳枝稷和芒草的全基因組序列已基本測(cè)定完畢，其含有的豐富基因資源亟待開(kāi)發(fā)。然而面對(duì)海量的序列信息，如何通過(guò)高通量的遺傳轉(zhuǎn)化體系篩選獲得具有潛在應(yīng)用價(jià)值的基因資源，仍然是當(dāng)前所面臨的一個(gè)巨大挑戰(zhàn)，因此能源草的遺傳改良研究受到了世界各國(guó)科研工作者的廣泛關(guān)注。然而由于能源草屬于單子葉禾本科植物，像該科的大部分植物一樣，能源草的遺傳轉(zhuǎn)化效率低且穩(wěn)定性差。
[0003]與其他能源草相比較，柳枝稷既是重要的能源植物，也是傳統(tǒng)的禾本科牧草，因此柳枝稷的遺傳轉(zhuǎn)化起步相對(duì)較早，研究經(jīng)驗(yàn)相對(duì)豐富。當(dāng)前建立的柳枝稷遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的外植體主要使用幼穗、未成熟的穎果或成熟種子誘導(dǎo)的胚性愈傷組織。與前兩者相比，柳枝稷成熟種子來(lái)源豐富，取材不受植物發(fā)育時(shí)期和生長(zhǎng)環(huán)境的影響，而且使用成熟種子誘導(dǎo)的愈傷組織建立的遺傳轉(zhuǎn)化體系，其效率普遍高于未成熟穎果和幼穗體系。另外，先前報(bào)道的轉(zhuǎn)基因柳枝稷植物大部分使用潮霉素篩選獲得，少數(shù)通過(guò)雙丙氨膦篩選產(chǎn)生，但同時(shí)使用潮霉素和雙丙氨膦雙抗篩選的多基因轉(zhuǎn)化技術(shù)尚未建立。當(dāng)前單抗篩選能夠轉(zhuǎn)入柳枝稷的最多外源基因的數(shù)目為3個(gè)，因此如果能夠建立柳枝稷雙抗篩選體系，則至少可以將外源基因的轉(zhuǎn)入數(shù)目加倍，從而能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)柳枝稷多個(gè)重要農(nóng)藝性狀的綜合調(diào)控和分子設(shè)計(jì)。像大多數(shù)單子植物一樣，柳枝稷難于進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。目前報(bào)道的大部分柳枝稷遺傳轉(zhuǎn)化體系的效率低于10%。雖有極少數(shù)柳枝稷的遺傳轉(zhuǎn)化體系效率超過(guò)10%，但其重復(fù)性和穩(wěn)定性不強(qiáng)，且材料來(lái)源的遺傳背景混雜。這主要是因?yàn)榱︷樽越徊挥H和植物，每一粒種子都代表一個(gè)不同的基因型，因此使用混合種子的愈傷組織，勢(shì)必造成愈傷組織質(zhì)量良莠不齊，不但影響遺傳轉(zhuǎn)化效率的穩(wěn)定性，而且獲得的轉(zhuǎn)基因植物具有不同的基因背景，潛在影響其后續(xù)分析和應(yīng)用。
[0004]迄今為止，已有28個(gè)國(guó)家在1.8億公頃的土地上種植了不同類型的轉(zhuǎn)基因作物，比1996年轉(zhuǎn)基因植物首次種植時(shí)的面積增加了 100倍。過(guò)去近20年的大量研究和綜合分析數(shù)據(jù)證實(shí)，轉(zhuǎn)基因技術(shù)使化學(xué)農(nóng)藥的用量減少了 37%，作物產(chǎn)量增加了 22%，農(nóng)民利潤(rùn)增加了 68%，因此轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研發(fā)和使用對(duì)糧食安全、可持續(xù)性發(fā)展和環(huán)境/氣候變化做出了貢獻(xiàn)。然而，轉(zhuǎn)基因植物的商業(yè)化研發(fā)首先需要產(chǎn)生成千上萬(wàn)棵獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因植株，然后對(duì)上述群體中進(jìn)行千里挑一或萬(wàn)里挑一的篩選工作。另外，為了滿足商業(yè)化生產(chǎn)的目的，需要對(duì)植物的多個(gè)不同性狀進(jìn)行綜合改良和分子設(shè)計(jì)，因此為了達(dá)到轉(zhuǎn)基因柳枝稷植物商業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用的目的，亟需發(fā)展高效的多基因遺傳轉(zhuǎn)化體系對(duì)柳枝稷多個(gè)重要農(nóng)藝性狀進(jìn)行綜合改良，從而定向培育出專用纖維生物質(zhì)資源新品種，為纖維生物質(zhì)液體燃料生產(chǎn)提供充足穩(wěn)定且可高效轉(zhuǎn)化的優(yōu)質(zhì)原料。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0005]本發(fā)明的目的是提供一種植物多基因遺傳轉(zhuǎn)化方法，提供一種高效多基因遺傳轉(zhuǎn)化體系，用于植物重要經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳改良和分子設(shè)計(jì)。
[0006]本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的:
[0007]—種植物多基因遺傳轉(zhuǎn)化的方法，它的內(nèi)容包括:
[0008]單一基因型尚質(zhì)量尚農(nóng)桿菌侵染率的胚性愈傷系的建立；
[0009]含有不同雙元載體的農(nóng)桿菌侵染上述愈傷系，并通過(guò)雙抗篩選獲得含有多個(gè)不同外源基因的轉(zhuǎn)基因植物陽(yáng)性植株。
[0010]進(jìn)一步，所述的單一基因型高質(zhì)量胚性愈傷系的外部特征為淡黃色、結(jié)構(gòu)疏松且具有溫潤(rùn)的光澤，其建立的方法包括:植物成熟種子的單一基因型愈傷系建立，高質(zhì)量胚性愈傷系通過(guò)目視法篩選和愈傷系再生率評(píng)價(jià)法獲得，最終獲得的所有單一基因型高質(zhì)量胚性愈傷系的再生率均大于90%。
[0011]進(jìn)一步，所述的用于農(nóng)桿菌侵染效率評(píng)價(jià)的植物愈傷組織來(lái)自上述篩選所獲得多個(gè)單一基因型的高質(zhì)量胚性愈傷系，其中，來(lái)自每個(gè)愈傷系中的所有細(xì)胞均具有相同的基因背景，具體方法為將含有pANIC6A雙元載體農(nóng)桿菌菌液與單一基因型高質(zhì)量胚性愈傷系進(jìn)行共孵育，選擇侵染效率大于30%的愈傷系即為單一基因型高質(zhì)量高農(nóng)桿菌侵染率的胚性愈傷系，然后進(jìn)行繼代擴(kuò)繁，并用于后續(xù)的植物高效遺傳轉(zhuǎn)化方法的建立。
[0012]在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述的農(nóng)桿菌菌株為EHA105或AGLl。
[0013]進(jìn)一步，所述的用于植物高效多基因遺傳轉(zhuǎn)化的雙元載體分別含有潮霉素和雙丙氨膦抗性基因，除了含有上述篩選標(biāo)記基因外，適合本發(fā)明使用的質(zhì)粒還含有一個(gè)或一個(gè)以上的不同目的基因。
[0014]本發(fā)明可用于在植物中過(guò)表達(dá)或RNAi抑制任何基因。目的基因可以是耐除草劑基因、細(xì)胞壁調(diào)控基因、分蘗數(shù)目決定基因、莖桿粗細(xì)控制基因、開(kāi)花基因或逆境抗性基因。
[0015]本發(fā)明中所述的植物為單子葉禾本科自交不親和植物，包括柳枝稷和芒草等能源草和禾本科牧草植物。
[0016]本發(fā)明中所述的抗性篩選試劑為潮霉素和雙丙胺磷。
[0017]—種植物多基因遺傳轉(zhuǎn)化的方法，它具體包括植物成熟種子愈傷組織誘導(dǎo)、單一基因型高質(zhì)量高農(nóng)桿菌侵染率的胚性愈傷組織系的獲得以及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的多基因遺傳轉(zhuǎn)化步驟。
[0018]所述的植物成熟種子愈傷組織誘導(dǎo)，把植物的成熟種子消毒清洗后接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)箱溫度25 ± 2 °C，暗培養(yǎng)6-7周，獲得愈傷組織。
[0019]所述的單一基因型高質(zhì)量高農(nóng)桿菌侵染率的胚性愈傷組織系的獲得，把所獲得的愈傷組織采用目視法進(jìn)行篩選，選擇其中淡黃色、結(jié)構(gòu)疏松且具有溫潤(rùn)的光澤的胚性愈傷組織為高質(zhì)量胚性愈傷組織，將獲得的高質(zhì)量胚性愈傷組織分出一半愈傷組織接種到愈傷組織再生培養(yǎng)基培養(yǎng)基上，組培室溫度25±2°C，光照時(shí)間每天16h光/8h暗，培養(yǎng)4-5周，獲得再生芽，并進(jìn)行再生效率的評(píng)估，然后選擇再生率大于90%的愈傷系進(jìn)行繼代，培養(yǎng)箱溫度25±2°C，暗培養(yǎng)3-4個(gè)周，然后用于農(nóng)桿菌侵染效率的評(píng)估，最后選擇農(nóng)桿菌侵染效率大于30%的愈傷系即為單一基因型高質(zhì)量高農(nóng)桿菌侵染率的胚性愈傷組織系，然后進(jìn)行擴(kuò)繁，培養(yǎng)箱溫度25±2°C，暗培養(yǎng)，每3-4周繼代一次。
[0020]所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的多基因遺傳轉(zhuǎn)化，把所述的擴(kuò)繁的單一基因型高質(zhì)量高農(nóng)桿菌侵染率的胚性愈傷組織系中的愈傷組織分成小塊，然后置于三通干燥皿中抽真空，使用含有不同雙元載體的農(nóng)桿菌菌液對(duì)所述的柳枝稷單一基因型高質(zhì)量胚性愈傷組織進(jìn)行共孵育，然后去除殘留的農(nóng)桿菌菌液，25±2°C，黑暗中共培養(yǎng)3天，將共培養(yǎng)后的愈傷組織轉(zhuǎn)接于抗性愈傷組織篩選培養(yǎng)基MSD3HB進(jìn)行篩選，培養(yǎng)箱溫度25 ± 2°C，暗培養(yǎng)，每3個(gè)周轉(zhuǎn)接一次，直到抗性愈傷組織長(zhǎng)出，將獲得的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)接到抗性愈傷組織篩選培養(yǎng)基MSK2HB上，組培室溫度25±2°C，光照時(shí)間每天16h光/8h暗，每4個(gè)周轉(zhuǎn)接一次，直到抗性芽長(zhǎng)出；獲得的抗性再生芽轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基MSRHB上，組培室溫度25±2°C，光照時(shí)間每天16h光/Sh暗；獲得的再生苗按照常規(guī)方法移栽到土中，2周后再生苗成活。
[0021]進(jìn)一步，所述的抗性愈傷組織篩選培養(yǎng)基MSD3HB(pH = 5.8)為MS基本培養(yǎng)基添加30g/L蔗糖、3mg/L2，4_D、30mg/L潮霉素、2.4mg/L雙丙胺磷、400mg/L頭孢塞肟鈉和