棉花纖維特異表達啟動子tb7p1及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體的說，涉及一種棉花纖維特異表達啟動子 TB7P1及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國是棉花生產(chǎn)和消費大國，棉花生產(chǎn)在我國國民經(jīng)濟中占有重要的地位。傳統(tǒng) 的育種方法曾在棉花品種改良上取得了較大的成功，但近20年來，世界棉花品種的產(chǎn)量已 經(jīng)達到平臺期。因此，利用現(xiàn)有的遺傳資源和傳統(tǒng)育種手段難以再大幅度提高棉花產(chǎn)量?；?因工程方法具有后代易于穩(wěn)定，育種周期短等優(yōu)點，可以打破物種間的遺傳障礙，實現(xiàn)優(yōu)良 目的基因的定向轉(zhuǎn)移。利用基因工程改良棉花產(chǎn)量和纖維品質(zhì)是解決這一難題的有效途 徑。但基因工程在作物改良中的作用發(fā)揮取決于三個方面的進展程度：目標(biāo)基因的功能、調(diào) 控目標(biāo)性狀的分子機理和控制目標(biāo)基因在特定部位和特定時間表達的特異啟動子。在棉花 纖維品質(zhì)和產(chǎn)量的基因工程改良中，常常需要在纖維細胞中超量或抑制一些基因的表達， 來達到提高產(chǎn)量或改良品質(zhì)的目的。在棉花纖維發(fā)育的分子機理研究中，也需要纖維細胞 特異表達啟動子來上調(diào)或下調(diào)目標(biāo)基因的表達，進而分析其在纖維細胞中的功能。最大限 度地減少目標(biāo)基因?qū)ζ渌M織和器官的不良影響。但是，目前已報道的具有棉花纖維特異 性的啟動子非常有限。因此，棉花纖維特異啟動子的克隆，對棉花纖維發(fā)育相關(guān)基因功能研 究和棉花纖維的基因工程改良，具有十分重要的意義。
[0003] 近年來，植物組織器官和發(fā)育特異性表達的研究成為植物分子生物學(xué)的一個重要 研究領(lǐng)域，特別是在植物基因工程的實用化階段中，為了使目的基因在特定的組織器官和 特定的發(fā)育階段優(yōu)先表達，對組織特異性表達的研究更是成為熱點。由于棉花纖維的發(fā)育 直接影響纖維的品質(zhì)和產(chǎn)量。因此，研究和篩選纖維特異表達的啟動子不僅有助于解析基 因表達調(diào)控的分子機制，并可為植物基因工程提供有用的調(diào)控元件，有著重要的理論意義 和應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此，本發(fā)明要解決現(xiàn)有技術(shù)對棉花纖維特異性表達啟動子的研究和篩選不 足的技術(shù)問題，提供了一種棉花纖維特異表達啟動子TB7P1及其應(yīng)用。
[0005] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種棉花纖維特異性表達啟動子TB7P1所 述啟動子TB7P1的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0000] 本發(fā)明還公開了 一種含有上述啟動子TB7P1的表達載體。
[0007] 進一步的，所述表達載體為植物表達載體。
[0008] 優(yōu)選的，所述植物表達載體為ρΒΙ121-ΤΒ7Ρ1::⑶S。
[0009] 本發(fā)明再公開了一種含有上述表達載體的宿主。
[0010]優(yōu)選的，所述宿主為根癌農(nóng)桿菌。
[0011] 優(yōu)選的，所述根癌農(nóng)桿菌為農(nóng)桿菌LBA4404。
[0012]本發(fā)明再公開了一種上述啟動子TB7P1在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
[0013]優(yōu)選的，所述轉(zhuǎn)基因植物為棉花。
[0014] 本發(fā)明再公開了一種上述表達載體在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
[0015] 優(yōu)選的，所述轉(zhuǎn)基因植物為棉花。
[0016] 本發(fā)明再公開了一種含有上述植物表達載體的宿主在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
[0017] 優(yōu)選的，所述轉(zhuǎn)基因植物為棉花。
[0018] 本發(fā)明再公開一種利用啟動子TB7P1制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括以下步驟：
[0019] (1)將所述啟動子TB7P1插入到表達載體中，構(gòu)建植物表達載體；
[0020] (2)將獲得植物表達載體導(dǎo)入宿主，獲得轉(zhuǎn)化體；
[0021] (3)用所述轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)化植物，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的植物，獲得轉(zhuǎn)基因植物。
[0022] 進一步的，所述轉(zhuǎn)基因植物為棉花，包括以下步驟：
[0023] (1)將所述啟動子TB7P1可操作地插入到表達載體中，構(gòu)建植物表達載體；
[0024] (2)將獲得植物表達載體導(dǎo)入宿主，獲得轉(zhuǎn)化體：
[0025] (3)用所述轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)化棉花愈傷再生組織，培養(yǎng)所述棉花愈傷再生組織，經(jīng)篩選和 誘導(dǎo)獲得含棉花纖維特異性啟動子TB7P1的棉花植株。
[0026] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明可以獲得包括以下技術(shù)效果：
[0027] 1)本發(fā)明提供了微管蛋白基因 GhTUB7的啟動子(TB7P1)及應(yīng)用，該啟動子是一個 棉花纖維細胞特異表達啟動子。
[0028] 2)本發(fā)明利用基因工程技術(shù)成功地分離了棉花纖維特異表達的GhTUB7基因的啟 動子，所述TB7P1啟動子含2010bp片段。
[0029] 3)本發(fā)明還驗證了 TB7P1啟動子序列在棉花中具有纖維表達特異性，能夠指導(dǎo)報 告基因在棉花纖維中特異性表達，為利用基因工程改良棉花纖維的品質(zhì)和產(chǎn)量提供了纖維 特異性表達的啟動子。
[0030] 4)本發(fā)明的TB7P1啟動子與組成型啟動子(如CaMV35S啟動子)相比，具有較高的表 達效率(多數(shù)纖維特異性啟動子表達效率極低)和纖維表達特異性;在改良纖維的基因工程 中，能夠很好地避免目的基因在其它組織器官表達帶來的副作用。
[0031 ] 5)本發(fā)明為進一步研究基因在纖維發(fā)育中的功能提供了新選擇，同時為改良棉花 品種和纖維品質(zhì)的分子設(shè)計提供了有效途徑。
[0032]當(dāng)然，實施本發(fā)明的任一產(chǎn)品必不一定需要同時達到以上所述的所有技術(shù)效果。
【附圖說明】
[0033]此處所說明的附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，構(gòu)成本發(fā)明的一部分，本發(fā) 明的示意性實施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中： [0034]圖1為本發(fā)明實施例1中GhTUB7基因在棉花不同器官和組織中的表達特性；
[0035]圖2為本發(fā)明實施例1中GhTUB7基因在棉花纖維和胚珠不同發(fā)育時期的表達特性； [0036]圖3為本發(fā)明實施例1中TB7P1啟動子序列上具有的順式調(diào)控元件；
[0037]圖4為本發(fā)明實施例2中pBI121-TB7Pl: :GUS植物表達載體圖譜；
[0038] 圖5為本發(fā)明實施例2中啟動子分析植物表達載體的酶切驗證電泳圖；
[0039] 圖6為本發(fā)明實施例3中擴增驗證轉(zhuǎn)基因棉花中的GUS基因電泳圖；
[0040]圖7為本發(fā)明實施例3中TB7P1啟動子在轉(zhuǎn)基因棉花根、莖和葉中的表達情況圖； [00411圖8為本發(fā)明實施例3中TB7P1啟動子在轉(zhuǎn)基因棉花花器官中的表達情況圖；
[0042]圖9為本發(fā)明實施例3中TB7P1在轉(zhuǎn)基因棉花纖維發(fā)育過程中的表達情況圖。
【具體實施方式】
[0043] 以下將配合附圖及實施例來詳細說明本發(fā)明的實施方式，藉此對本發(fā)明如何應(yīng)用 技術(shù)手段來解決技術(shù)問題并達成技術(shù)功效的實現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實施。
[0044] 除非另有說明，本發(fā)明實施例中的試劑、藥品、材料均為市售可得，方法均參考《分 子克隆實驗指南》(Sambrook和Russell，2001)。
[0045]在本發(fā)明的下述實施例中，所用的棉花實驗材料為徐州142(Gossypium hirsutum L.cv徐州142)，來源于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所。轉(zhuǎn)基因受體為冀棉14,來源于河北農(nóng)業(yè) 大學(xué)。
[0046] 實施例一
[0047] 1、棉花RNA的提取
[0048] 選取新鮮棉花材料(根、莖、葉、花、開花后0天的胚珠和纖維至開花后6天的胚珠和 纖維、開花后6天的纖維至開花后20天的纖維、開花后6天的胚珠至開花后20天的胚珠），利 用北京艾德來(Aidlab，中國）生物科技公司的EASYspin植物RNA快速提取試劑盒（貨號： RN09)提取各個樣品的總RNA，具體操作按說明書進行。
[0049] 2、cDNA-鏈合成
[0050] 利用寶生物工程有限公司（TakaRa，中國大連）的cDNA -鏈合成試劑盒 (PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser，貨號：RR047A)和實驗 1 提取的總RNA， 合成cDNA-鏈。于-20 °C凍存產(chǎn)物。
[0051] 3、GhTUB7基因在棉花不同組織器官和纖維胚珠不同發(fā)育時期中的表達特性
[0052]