使用多個溫度區(qū)域的核酸擴增的制作方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于進行核酸序列擴增的過程并涉及一種用于實施本發(fā)明的方 法的裝置。本發(fā)明尤其適于對樣品（例如生物樣品）中存在的核酸進行同時識別和定量。此 外，本發(fā)明涉及一種在包括彼此熱去耦的至少兩種區(qū)域的反應容器中的擴增溶液中，對擴 增反應中特別是聚合酶鏈式反應(PCR)中的目標核酸序列進行擴增和定量實時檢測的裝 置，其中一個區(qū)域為具有允許寡核苷酸探針雜交到核酸序列的基本恒定生成溫度的表面雜 交區(qū)域，其中表面雜交區(qū)域的內表面包括用于目標核酸序列的捕獲探針。
【背景技術】
[0002] 可以使用各種擴增反應來執(zhí)行核酸序列的擴增，其中且最突出的是聚合酶鏈式反 應(PCRXPCR是一種用于擴增特定核酸序列的方法。PCR為主要在溶液中進行的酶反應。當 擴增過程被實時監(jiān)測時，PCR可以用于定量分析。實時PCR通常使用熒光報告分子，諸如插入 染料、TaqMan探針、蝎形引物、分子信標。當需要分析多于一種核酸目標序列時，可以采用兩 種方法。第一種方法是使反應平行進行，即，在分離隔室中運行每種反應。第二種方法是對 反應進行復用，即，在同一隔室中運行反應并針對每種反應使用不同的熒光團報告分子。這 種方法受可以被有效區(qū)分的熒光團的數(shù)目限制。當前的技術發(fā)展水平是可以復用六種反 應。附圖1說明當前的單室多重PCR以及陣列PCR構思。
[0003] PCR過程和表面雜交過程的熱要求大不相同。PCR擴增過程要求(快速)溫度循環(huán)， 其中在循環(huán)的一部分中，樣品是在dsDNA熔化溫度之上。另一方面，表面雜交需要在低于核 酸熔點的溫度進行，且為了得到最優(yōu)性能，應避免捕獲探針部位之上的擴增子的漫射限制 局部耗盡。
[0004] 本發(fā)明的多個區(qū)域構思允許對這兩種過程即擴增和表面雜交的去耦優(yōu)化。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明涉及一種使用不同溫度區(qū)域擴增和檢測目標核酸序列的方法和裝置。特別 是，本發(fā)明涉及用于擴增和檢測反應容器中的擴增溶液(其有可能包括具有目標核酸序列 的核酸）中的目標核酸序列的方法，包括下述步驟:（a)提供反應容器，該反應容器包括在表 面上固定捕獲探針的至少一個表面雜交區(qū)域，其中所述捕獲探針與所述目標核酸序列上的 區(qū)域基本互補；（b)向所述反應容器添加擴增溶液；（c)生成具有至少兩種熱去耦區(qū)域的反 應容器中的溫度區(qū)域分布圖，其中一種區(qū)域與表面雜交區(qū)域相同或至少交疊，其中表面雜 交區(qū)域具有允許捕獲探針雜交到目標核酸序列的生成溫度；（d)在反應容器中執(zhí)行目標核 酸序列的擴增；以及(e)在擴增期間和/或之后定期地或以限定的時間間隔檢測經(jīng)擴增的核 酸序列，其中經(jīng)擴增的核酸序列通過在所述表面雜交區(qū)域中捕獲探針與所述經(jīng)擴增的核酸 序列的雜交而檢測。在該方法的特別優(yōu)選實施例中，或者是(a)每個表面雜交區(qū)域用于僅在 整個擴增過程的特定階段雜交和檢測經(jīng)擴增的目標核酸序列，或者是(b)至少一個表面雜 交區(qū)域用于在整個擴增過程的多個階段雜交和檢測經(jīng)擴增的目標核酸序列。優(yōu)選地，擴增 在聚合酶鏈式反應(PCR)中執(zhí)行并且擴增溶液包括核酸聚合酶以及與所述目標核酸基本互 補的引物。
[0006] 本發(fā)明還涉及一種用于擴增和檢測反應容器中的擴增溶液中的目標核酸序列的 裝置，包括:（a)反應容器，其包括彼此熱去耦的至少兩種區(qū)域，其中一種區(qū)域為具有允許捕 獲探針雜交到互補目標核酸序列的基本恒定生成溫度的表面雜交區(qū)域，其中表面雜交區(qū)域 的內表面涂布有用于目標核酸序列的捕獲探針，（b)檢測系統(tǒng)，其檢測結合到所述捕獲探針 的目標，（c)一個或多個溫度控制器和一個或多個溫度調節(jié)器，用于控制、調節(jié)和維持各區(qū) 域中的溫度，以及(d)傳輸系統(tǒng)，用于在各區(qū)域之間傳輸擴增溶液。優(yōu)選地，檢測系統(tǒng)基本不 檢測未結合到所述捕獲探針的目標。
[0007] 本發(fā)明還涉及一種用于擴增和檢測反應容器中的擴增溶液中的目標核酸序列的 試劑盒(cartridge)，包括：用于接收包含所述目標核酸序列的擴增溶液的反應容器，其中 反應容器包括在表面上固定捕獲探針的至少一個表面雜交區(qū)域，其中所述捕獲探針與所述 目標核酸序列上的區(qū)域基本互補。優(yōu)選地，反應容器包括在表面上固定捕獲探針的至少兩 個表面雜交區(qū)域，其中所述捕獲探針與所述目標核酸序列上的區(qū)域基本互補。在試劑盒作 為本發(fā)明裝置的部件的上下文中，已經(jīng)在上文中討論了試劑盒的一些說明性實施例的特 征。這種試劑盒的具體實施例在附圖14中說明。當插入該裝置時，試劑盒中的表面雜交區(qū)域 優(yōu)選地與該裝置中生成允許雜交的溫度的那個區(qū)域交疊。
[0008] 因而，本發(fā)明還涉及一種用于接收本發(fā)明的試劑盒的裝置，其中該裝置包括： 一個或多個溫度控制器和/或溫度調節(jié)器用于生成所述試劑盒中包括的反應容器中的 至少兩種溫度區(qū)域的溫度分布圖，其中一種區(qū)域具有允許捕獲探針雜交到互補目標核酸序 列的基本恒定生成溫度且其中溫度控制器和/或溫度調節(jié)器控制、調節(jié)和維持各區(qū)域中的 溫度； 檢測系統(tǒng)，該檢測系統(tǒng)檢測結合到所述捕獲探針的目標，但是基本不檢測未結合到所 述捕獲探針的目標； 傳輸系統(tǒng)，用于在各區(qū)域之間傳輸擴增溶液;以及 用于所述試劑盒的接收元件。
[0009] 優(yōu)選的是，當試劑盒插入該裝置時，試劑盒的表面雜交區(qū)域與該裝置中生成允許 雜交的溫度的那個區(qū)域交疊。
[0010] 優(yōu)選的是，反應容器包括在可交換試劑盒中。
[0011] 將本發(fā)明的方法、試劑盒和裝置用于定量分析目標核酸序列，用于同時定量分析 多個目標核酸序列，或者用于分析樣品以確定目標核酸的存在，這些也在本發(fā)明的范圍之 內。優(yōu)選地，此處描述的方法和裝置用于臨床診斷、定點照護診斷、生物分子診斷、基因或蛋 白質表達陣列、環(huán)境傳感器、食品質量傳感器或法醫(yī)應用。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的方法、試 劑盒和裝置在實時PCR或實時多重PCR中的用途。
【附圖說明】
[0012] 圖1:說明在實時陣列PCR期間的步驟，該實時陣列PCR與實時PCR相似，每個循環(huán)包 括3個溫度步驟。圖1的說明性實例中說明的實時陣列PCR與一般的實時PCR之間的差別在 于，在實時陣列PCR中，退火步驟與雜交步驟組合。
[0013] 圖2:說明唯一樣品體積中具有熱隔離區(qū)域的區(qū)域構思。
[0014] 圖3:具有分離室的區(qū)域構思的可能實施例。理想地但不限于，表面雜交區(qū)域的溫 度接近PCR循環(huán)的退火溫度的溫度。
[0015] 圖4:具有分離室的區(qū)域構思的可能實施例，其中樣品可以在室周圍傳輸。理想地 但不限于，表面雜交區(qū)域的溫度接近PCR循環(huán)的退火溫度的溫度。
[0016] 圖5:具有三個恒定溫度區(qū)域的可能實施例，樣品在該三個恒定溫度區(qū)域之間循 環(huán)。
[0017] 圖6:具有兩個恒定溫度區(qū)域的可能實施例，樣品在該兩個恒定溫度區(qū)域之間循 環(huán)。短長度的擴增子的優(yōu)選實施例。
[0018] 圖7:兩個恒定溫度區(qū)域，樣品在其周圍循環(huán)。一個區(qū)域呈通道的形式，該通道具有 用于表面雜交的捕獲探針部位。
[0019] 圖8:PCR產(chǎn)物的快速表面雜交的支持實驗證據(jù)。
[0020] 圖9:擴增子濃度和雜交信號之間的關聯(lián)。
[0021] 圖10:根據(jù)本發(fā)明的實施例的示意性布局。具有：用于變性（1)、雜交和引物退火 (2)以及伸長(3)的（1，2,3)溫度區(qū)域。（10)迂回流動(通道），使得對于每個循環(huán)(N，N+1，N+ 2，···），PCR緩沖液經(jīng)過該溫度區(qū)域;其中在該溫度區(qū)域從左到右迂回行進。（20)用于每個循 環(huán)的專用雜交區(qū)域(原則上可以在某一循環(huán)跳過雜交）。（21)捕獲探針部位。
[0022] 圖11:根據(jù)本發(fā)明另一實施例的示意性布局。具有：用于循環(huán)(N+2)的用于變性 (1)、雜交和引物退火(2)以及伸長(3)的（1，2,3)單獨可尋址溫度區(qū)域。（11)單向的非循環(huán) 流動(通道），使得對于每個循環(huán)(N，N+1，N+2，…），對于該特定循環(huán)PCR流體經(jīng)過單獨可尋址 溫度區(qū)域，在該溫度區(qū)域從左到右流動行進。（20)用于每個循環(huán)的專用雜交區(qū)域(原則上可 以在某一循環(huán)跳過雜交）。（21)捕獲探針部位。
[0023] 圖12:使用迂回流動（10)從而使PCR循環(huán)的雜交區(qū)域之間距離盡可能小的優(yōu)選備 選實施例的示意性布局，從檢測考慮角度這是有利的；相鄰PCR循環(huán)的雜交區(qū)域之間距離越 大，則需要更快的掃描(對于掃描光學讀取器的情形)或者更大的視場(對于成像光學讀取 器的情形）。
[0024]圖13:溫度區(qū)域(p，q)的2D矩陣。溫度區(qū)域的設置與試劑盒的流體通道（12)、（ 13) 的形狀相適應。
[0025] 圖14:根據(jù)本發(fā)明的試劑盒的俯視圖和截面圖(沿著A-A)，具有： (50) 試劑盒 (51) 試劑盒的外殼，該外殼包括至少部分透明材料從而能進行光學檢測。試劑盒優(yōu)選 地由（但不限于)塑料和類似材料或玻璃制成。試劑盒也可以是具有捕獲探針的透明襯底與 含有流體通道的盒的組件。
[0026] (20)具有與目標核酸序列基本互補的捕獲探針的部位(典型地為斑點）。典型地但 絕不是限制，捕獲探針部位是直徑為〇. 1mm的斑點。（20-1)捕獲探針部位，其在沿著線A-A的 截面圖中也可看到。
[0027] (40)流體入口。
[0028] (41)對于該特定實例具有迂回布局的流體通道，流體通道的典型尺寸為：高度為 0.05-lmm且寬度為0. l-lmm。
[0029] (42)流體出口 圖15:根據(jù)本發(fā)明的裝置（100)，不具有包括反應室的試劑盒。裝置準備接收具有反應 室的(一次性)試劑盒。該裝置包括： (70)用于試劑盒(50)的樣品支持器 (80)用于限定試劑盒的區(qū)域（1)-(3)中的溫度的加熱器，對于該特定情形，將具有三個 加熱器(80)來限定區(qū)域(1)、（2)、（3)中的溫度。
[0030] (90)用于檢測雜交到捕獲探針(20)的目標核酸的檢測系統(tǒng)（"讀取器"）。示出了用 于共焦檢測的掃描單元的簡化示意說明圖。其中掃描單元包括照射/收集(熒光)透鏡/物鏡 (92)和二向色鏡(91 )，該二向色鏡反射激勵光（圖16中的101)，導致激勵光被引導向試劑 盒。同一透鏡(92)收集由標記目標分子生成的熒光（圖16中的201)并經(jīng)由透射熒光的二向 色鏡(91)將該熒光引導向檢測器(此處未示出）。
[0031] 圖16:具有包括反應室的試劑盒(50)的圖15裝置。編號與圖15的編號相同。
【具體實施方式】
[0032] 本發(fā)明涉及一種用于擴增和檢測反應容器中的擴增溶液中的目標核酸序列的方 法，包括下述步驟 提供反應容器，該反應容器包括在表面上固定捕獲探針的至少一個表面雜交區(qū)域，其 中所述捕獲探針與所述目標核酸序列上的區(qū)域基本互補； 向所述反應容器添加擴增溶液； 生成具有至少兩種熱去耦區(qū)域的反應容器中的溫度區(qū)域分布圖，其中一種區(qū)域與表面 雜交區(qū)域相同或至少交疊，其中表面雜交區(qū)域具有允許捕獲探針雜交到目標核酸序列的生 成溫度； 在反應容器中執(zhí)行目標核酸序列的擴增；以及 在擴增期間和/或之后定期地或以限定的時間間隔檢測經(jīng)擴增的核酸序列，其中經(jīng)擴 增的核酸序列通過在所述表面雜交區(qū)域中捕獲探針與所述經(jīng)擴增的核酸序列的雜交而檢 測。
[0033] 在一個優(yōu)選實施例中，每種區(qū)域中的溫度是單獨可調節(jié)的。在另一優(yōu)選實施例中， 每種區(qū)域中的溫度由單獨溫度控制器和/或調節(jié)器控制。
[0034] 優(yōu)選地，表面雜交區(qū)域具有基本恒定生成溫度。在一個優(yōu)選實施例中，反應容器可 包括一個或一個以上的表面雜交區(qū)域。術語"至少一個表面雜交區(qū)域"和"一個或一個以上 的表面雜交區(qū)域"在此可以互換使用。
[0035] 在優(yōu)選實施例中，反應容器例如可以包括至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少 6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、 至少18、至少19、至少20或多于20個表面雜交區(qū)域。在一些實施例中，反應容器可包括至多 60、至多70、至多80、至多90或至多100個表面雜交區(qū)域。在一些實施例中，反應容器例如可 以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、介于1和15、介于1和20、 介于1和30、介于1和40、介于1和50、介于1和60、介于1和70、介于1和80、介于1和90或介于1 和100個表面雜交區(qū)域之間，或者例如至少1且至多60、至少1且至多70、至少1且至多80、至 少1且至多90或者至少1且至多100個表面雜交區(qū)域。
[0036] 在一個優(yōu)選實施例中，所述至少兩種熱去耦區(qū)域的另一種區(qū)域為溫度循環(huán)器區(qū) 域、變性區(qū)域、退火區(qū)域或延伸區(qū)域。
[0037] 在一些優(yōu)選實施例中，可以在具有多于兩種熱去耦區(qū)域的反應容器中生成溫度區(qū) 域分布圖。例如，在一些實施例中，可以在具有多于兩種熱去耦區(qū)域的反應容器中生成溫度 分布圖，其中一種區(qū)域與表面雜交區(qū)域相同或至少交疊，其中表面雜交區(qū)域具有允許捕獲 探針雜交到目標核酸序列的生成溫度，以及其中另一種區(qū)域為變性區(qū)域、退火區(qū)域和/或延 伸區(qū)域。在特別優(yōu)選實施例中，在具有至少兩種熱去耦區(qū)域的反應容器中生成溫度區(qū)域分 布圖，其中一種區(qū)域與表面雜交區(qū)域相同或至少交疊，其中表面雜交區(qū)域具有允許捕獲探 針雜交到目標核酸序列的生成溫度且一種其它類型的區(qū)域為溫度循環(huán)器區(qū)域、變性區(qū)域、 退火區(qū)域或延伸區(qū)域。
[0038] 在一些優(yōu)選實施例中，在所述至少兩種熱去耦區(qū)域其中之一中，優(yōu)選地在溫度循 環(huán)器區(qū)域中執(zhí)行目標核酸序列的擴增，或者備選地，可以通過使擴增溶液經(jīng)過反應容器中 的至少兩種或所有類型的熱去耦區(qū)域來執(zhí)行目標核酸的擴增。在一些優(yōu)選實施例中，使擴 增溶液經(jīng)過全部區(qū)域以進行目標核酸的擴增。
[0039] "生成溫度區(qū)域分布圖"在此是指由溫度控制器和/或調節(jié)器(例如包括加熱器、冷 卻器、熱傳遞裝置等等)在反應容器中引起不同區(qū)域的局部或空間溫度模式或分布圖。區(qū)域 或溫度區(qū)域在此是指反應容器中的限定面積或體積。區(qū)域可以優(yōu)選地為熱去耦區(qū)域。區(qū)域 優(yōu)選地由它們的溫度限定且溫度區(qū)域在此是指限定溫度的區(qū)域，該限定溫度可以是基本恒 定生成溫度或在本發(fā)明方法的過程中變化的溫度，然而，這依賴于區(qū)域的類型并依賴于如 此處下文討論的具體實施例。
[0040] 在另外方面，本發(fā)明涉及用于擴增和檢測反應容器中的擴增溶液中的目標核酸序 列的方法，包括下述步驟： 提供反應容器，該反應容器包括所述擴增溶液且進一步包括至少兩種熱去耦區(qū)域，其 中一種區(qū)域為表面雜交區(qū)域； 在反應容器中執(zhí)行目標核酸序列的擴增；以及 在擴增期間和/或之后定期地或以限定的時間間隔檢測經(jīng)擴增的核酸序列，其中經(jīng)擴 增的核酸序列通過捕獲探針與所述經(jīng)擴增的核酸序列的雜交而檢測，以及其中所述雜交在 所述表面雜交區(qū)域中進行并且所述捕獲探針固定在表面上并與所述目標核酸序列上的區(qū) 域基本互補。
[0041] 在本發(fā)明的方法的一些實施例中，在擴增期間定期地或以限定的時間間隔檢測經(jīng) 擴增的核酸序列。
[0042] 在本發(fā)明的上下文中"反應容器"是包括反應溶液的任何容器的總和。作為對于各 種實施例的在此實例性所討論的，在本發(fā)明的不同實施例中，反應容器可包括不同數(shù)目的 區(qū)域和隔室且可具有不同的形式和尺寸。措詞"反應容器"不限于反應管、毛細管、試管、孔 板等等，且根據(jù)具體實施例還包括具有兩個或更多個隔室和/或互連的管、隔室、通道和/或 毛細管等等的系統(tǒng)的更復雜布置。反應容器