一種定量檢測(cè)黃曲霉毒素b1的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及定量檢測(cè)黃曲霉毒素 Bl的方法，尤其涉及一種適配體生物傳感器結(jié) 合血糖儀定量檢測(cè)黃曲霉毒素 Bl的方法，屬于黃曲霉毒素 Bl的定量檢測(cè)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 霉菌毒素（mycotoxins)主要是指霉菌或真菌在其所污染的食品中產(chǎn)生的有毒代 謝產(chǎn)物，它們可通過(guò)飼料或食品進(jìn)入人和動(dòng)物體內(nèi)，引起人和動(dòng)物的急性或慢性毒性，損害 機(jī)體的肝臟、腎臟、神經(jīng)組織、造血組織及皮膚組織等。常見(jiàn)的霉菌毒素有黃曲霉毒素、赭 曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、T-2、HT-2毒素、伏馬菌素等。黃曲霉毒素 Bl(AFBl)被世界衛(wèi)生組織（WHO)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)認(rèn)定為一級(jí)致癌物，開(kāi)發(fā)高靈敏的黃曲 霉毒素檢測(cè)方法是國(guó)際關(guān)注的重點(diǎn)。
[0003] 適配體與抗體的性質(zhì)相似，但適配體特異性更強(qiáng)，對(duì)目標(biāo)靶分子具有更高的親和 力，更容易獲得，在體外可以大量快速的合成，制備方法也更為簡(jiǎn)單，可以針對(duì)不同種類的 目標(biāo)物進(jìn)行篩選。血糖儀是一種測(cè)量血糖水平的電子儀器，由于其體積小，成本低，操作簡(jiǎn) 單，能夠得到準(zhǔn)確的定量結(jié)果，已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。然而，血糖儀只能檢測(cè)葡萄糖這一種物 質(zhì)，并且檢測(cè)范圍是0. 6~33mmol/l (10~600mg/dl)。
[0004] 目前，黃曲霉毒素 Bl的很多檢測(cè)方法存在所需試劑多，操作繁瑣，檢測(cè)周期長(zhǎng)，重 現(xiàn)性差，設(shè)備昂貴，前處理復(fù)雜等缺點(diǎn)，不利于進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。因此，開(kāi)發(fā)一種便攜式適配體 生物傳感器結(jié)合血糖儀定量檢測(cè)黃曲霉毒素 Bl這種非葡萄糖物質(zhì)的方法，將具有廣泛的 應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種定量檢測(cè)黃曲霉毒素 Bl的方法，該方法 應(yīng)用適配體生物傳感器結(jié)合血糖儀定量檢測(cè)黃曲霉毒素 B1，具有操作簡(jiǎn)便，檢出限低，特異 性好，重復(fù)再現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。
[0006] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：
[0007] 本發(fā)明首先公開(kāi)了黃曲霉毒素 Bl的適配體，其核苷酸序列為SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4 或 SEQ ID NO. 5 所示。
[0008] 所述適配體的互補(bǔ)DNA，其核苷酸序列為SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8、 SEQ ID Nd 9 或 SEQ ID Nd 10 所示。
[0009] 本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了一種定量檢測(cè)黃曲霉毒素 BI的方法，包括以下步驟：（1)制 備適配體生物傳感器；(2)提取待測(cè)樣品中的黃曲霉毒素 Bl，得到樣品提取液，加入到所述 適配體生物傳感器中，混勻，孵育；（3)分離上清液，加入過(guò)量蔗糖溶液進(jìn)行反應(yīng)；（4)用血 糖儀進(jìn)行定量檢測(cè)。
[0010] 其中，步驟（1)所述適配體生物傳感器按照以下方法制備：（a)活化蔗糖酶；(b) 活化所述互補(bǔ)DNA ; (c)將步驟（a)活化后的蔗糖酶與步驟（b)活化后的互補(bǔ)DNA分別洗 滌，然后混勻，反應(yīng)合成DNA-蔗糖酶聚合物；(d)將鏈霉親和素修飾的磁球鏈接所述黃曲霉 毒素 Bl的適配體；（e)將步驟（c)合成的DNA-蔗糖酶聚合物洗滌后固定在步驟（d)處理 的磁球上，即得。
[0011] 步驟（b)所述互補(bǔ)DNA的3'端進(jìn)行巰基修飾；步驟（d)所述黃曲霉毒素 Bl適配 體的3'端進(jìn)行生物素修飾。
[0012] 步驟（a)所述活化鹿糖酶是將鹿糖酶與sulf〇-SMCC(sulfosuccinimidyl-4-( N-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-carboxylate)反應(yīng)；其中，所述反應(yīng)的體系包括： 300-500 μ I 20mg/ml蔗糖酶，0. 5-2mg sulfo-SMCC ;所述反應(yīng)的條件為：先渦旋震蕩5min， 然后在恒溫混勻儀上室溫反應(yīng)l-3h ;
[0013] 優(yōu)選的，所述反應(yīng)的體系包括：400 μ I 20mg/ml鹿糖酶，Img sulfo-SMCC ;所述反 應(yīng)的條件為：先渦旋震蕩5min，然后在恒溫混勻儀上室溫反應(yīng)2h。
[0014] 步驟（b)所述活化互補(bǔ)DNA是將所述互補(bǔ)DNA與TCEP (Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride)反應(yīng)；其中，所述反應(yīng)的體系包括：80_120μ1 100μΜ互補(bǔ) DNA，1-3 μ 1 0.1 M緩沖液Β，1-3 μ I 30mM TCEP ;所述反應(yīng)的條件為：恒溫混勻儀上室溫反 應(yīng) 0· 5-2h ;
[0015] 優(yōu)選的，所述反應(yīng)的體系包括：100 μ 1 100 μM所述互補(bǔ)DNA，2 μ 1 0.1 M緩沖液B， 2 μ I 30mM TCEP ;所述反應(yīng)的條件為：恒溫混勻儀上室溫反應(yīng)Ih ;所述緩沖液B包括：0.1 M 氯化鈉，0.1 M磷酸鈉，質(zhì)量比為0.05 %的吐溫-20, pH = 7. 3。
[0016] 步驟（c)所述洗滌包括：將步驟（a)反應(yīng)后的溶液離心，取上清液，加入到超濾管 Amicon-100K，25°C、12000rcf離心10min，用緩沖液A洗滌；將步驟（b)反應(yīng)后的溶液離心， 取上清液，加入到超濾管Amicon-3K中，25°C、12000rcf離心10min，用緩沖液A洗滌；其中， 所述緩沖液A包括：0.1 M氯化鈉，0.1 M磷酸鈉 ，pH = 7. 3 ;步驟（c)所述反應(yīng)合成DNA-蔗 糖酶聚合物的條件是恒溫混勻儀上室溫反應(yīng)24-72h，優(yōu)選為48h。
[0017] 步驟（d)所述鏈接的體系包括：0. 5_2ml lmg/ml鏈霉親和素修飾的磁球， 40-80 μ 1 0.1 mM所述黃曲霉毒素 Bl的適配體；所述鏈接的條件為：恒溫混勻儀上室溫反應(yīng) 0. 5-2h ；
[0018] 優(yōu)選的，步驟（d)所述鏈接的體系包括：1ml lmg/ml鏈霉親和素修飾的磁球， 60 μ 1 0.1 mM所述黃曲霉毒素 Bl的適配體；所述鏈接的條件為：恒溫混勻儀上室溫反應(yīng) lh〇
[0019] 步驟（e)所述洗滌是將步驟（c)合成的DNA-鹿糖酶聚合物用超濾管Amicon-IOOK 于25°C、12000rcf離心10min，用緩沖液A (所述緩沖液A包括：0.1 M氯化鈉，0.1 M磷酸鈉， pH = 7. 3)洗滌；步驟（e)所述固定是將洗滌后的DNA-鹿糖酶聚合物與步驟（d)處理的 磁球混合，在恒溫混勻儀上室溫反應(yīng)0. 5-2h，優(yōu)選為lh。
[0020] 本發(fā)明定量檢測(cè)黃曲霉毒素 BI的方法中，步驟（2)將樣品提取液加入適配體生物 傳感器中，使適配體生物傳感器的終濃度為3mg/ml ;所述孵育的條件為：25°C孵育30min ; 步驟（3)所述反應(yīng)的條件為：25°C反應(yīng)30min ;所述分離上清液是將反應(yīng)后的溶液用磁分離 器分離，然后吸取上清液；步驟（4)所述定量檢測(cè)是根據(jù)血糖儀的讀數(shù)與黃曲霉毒素 Bl標(biāo) 準(zhǔn)品的濃度作回歸方程，將待測(cè)樣品的血糖儀讀數(shù)帶入回歸方程，計(jì)算待測(cè)樣品中黃曲霉 毒素 Bl的濃度；其中，所述待測(cè)樣品包括食品。
[0021] 本發(fā)明針對(duì)黃曲霉毒素 BI分別合成了 5條適配體序列及不同適配體序列相對(duì)應(yīng) 的互補(bǔ)DNA序列（適配體序列SEQ ID NO. 1，其對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)DNA核苷酸序列為SEQ ID NO. 6; 適配體序列SEQ ID NO. 2,其對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)DNA核苷酸序列為SEQ ID NO. 7;依此類推。）；其 中，SEQ ID NO. 5所示適配體序列與SEQ ID NO. 4所示序列的差異在于：SEQ ID NO. 5所示 序列后多加12個(gè)A堿基。
[0022] 本發(fā)明分別用不同的適配體序列及其互補(bǔ)DNA序列合成適配體生物傳感器，比較 不同適配體序列的血糖儀信號(hào)值。結(jié)果表明，當(dāng)AFBl的濃度為25 μΜ，SEQ ID NO. 1-4所 示適配體序列所產(chǎn)生的血糖儀信號(hào)值分別為37mg/dl、35mg/dl、43mg/dl、53mg/dl ;SEQ ID NO. 5所示適配體序列加了 12個(gè)A堿基以后血糖儀的信號(hào)值為115mg/dl?？赡苁怯捎谔砑?12個(gè)A堿基以后，適配體序列的3'端與磁球結(jié)合，增大了適配體與磁球之間的空間位置，適 配體能更好的與AFBl分子結(jié)合，釋放下來(lái)更多的蔗糖酶分子，血糖儀的信號(hào)值明顯增加。 因此，本發(fā)明黃曲霉毒素 Bl適配體的核苷酸序列優(yōu)選為SEQ ID NO. 5所示，其互補(bǔ)DNA的 核苷酸序列為SEQ ID NO. 10所示。
[0023] 本發(fā)明適配體生物傳感器結(jié)合血糖儀定量檢測(cè)食品中黃曲霉毒素 Bl的原理包 括，鏈霉親和素包被的磁球與生物素修飾的適配體相結(jié)合，蔗糖酶和互補(bǔ)DNA相結(jié)合；將 DNA-蔗糖酶聚合物通過(guò)互補(bǔ)DNA與適配體堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則固定到磁球表面；當(dāng)溶液中 含有所需檢測(cè)目標(biāo)分子時(shí)，目標(biāo)分子與適配體特異性結(jié)合，從而將DNA-蔗糖酶聚合物從磁 球上釋放到溶液中；用磁分離器分離溶液，釋放到溶液中的DNA-蔗糖酶聚合物能夠高效水 解蔗糖為葡萄糖，從而通過(guò)血糖儀進(jìn)行定量檢測(cè)。由于被釋放到溶液中的DNA-蔗糖酶聚合 物的量能夠通過(guò)葡萄糖的量來(lái)表示，并且蔗糖酶的量與樣品中目標(biāo)分子的量存在一定的比 例關(guān)系。因此，血糖儀的讀數(shù)能夠被用來(lái)定量目標(biāo)分子的濃度。
[0024] 本發(fā)明適配體生物傳感器4°C條件下能有效保存7天。
[0025] 本發(fā)明對(duì)適配體生物傳感器檢測(cè)AFBl的過(guò)程中整個(gè)實(shí)驗(yàn)溫度、生物傳感器與目 標(biāo)分子的孵育時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，蔗糖酶的活性在25°C時(shí)實(shí)驗(yàn)效果更好；目標(biāo)物 和DNA-蔗糖酶固定的磁球孵育時(shí)間30分鐘，固定在磁球上的DNA-蔗糖酶被釋放的更完 全。因此，本發(fā)明適配體生物傳感器檢測(cè)AFBl的過(guò)程中實(shí)驗(yàn)溫度均為25°C，孵育時(shí)間為 30min〇
[0026] 本發(fā)明運(yùn)用適配體生物傳感器結(jié)合血糖儀檢測(cè)緩沖液中不同濃度的AFB1，結(jié)果表 明隨著AFBl濃度的增加，血糖儀的信號(hào)值也在逐步增加。當(dāng)AFBl的濃度在2. 5X KT8M~ 4. OX 10 6M范圍時(shí)，血糖儀的信號(hào)值有一個(gè)良好的線性關(guān)系。AFBl的最低檢測(cè)限是5. 9ng/ ml。歐洲食品安全局規(guī)定了 AFBl在食品中限量范圍是0~12.0yg/kg。中國(guó)現(xiàn)行的 GB2761-2011 "食品中黃曲霉毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)"和其他標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定在嬰幼兒谷類輔助食品中黃 曲霉毒素 Bl的限量標(biāo)準(zhǔn)是0. 5 μ g/kg，在玉米，花生及其制品中（花生油除外）黃曲霉毒素 Bl的限量是20 μ g/kg，在大米和食用油中限量是10 μ g/kg，在其他谷物、豆類、發(fā)酵食品中 限量是5 μ g/kg。因此，本發(fā)明方法的檢出限除嬰幼兒輔助食品以外基本能滿足檢測(cè)要求。
[0027] 重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明適配體