一種熒光核酸銀及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于核酸試劑制備和食品質(zhì)量檢測(cè)領(lǐng)域，特指一種熒光核酸銀及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]鐵是人體必需的微量元素之一，是血紅蛋白和肌紅蛋白的形成因子，具有重要的生理生化功能。鐵元素的缺乏將導(dǎo)致免疫系統(tǒng)功能降低、貧血等癥狀，影響健康，然而過量吸收鐵會(huì)影響人體對(duì)銅、砸等元素的吸收，造成發(fā)育失衡，因此，合理的補(bǔ)鐵對(duì)人體具有重要的意義；對(duì)于嬰幼兒，奶粉是除母乳外最主要的食品，向嬰幼兒奶粉中加入適量的人體必須微量元素非常重要，由于嬰幼兒食品的特殊性和重要性，對(duì)微量元素的檢測(cè)至關(guān)重要，科學(xué)系統(tǒng)地評(píng)價(jià)嬰幼兒配方奶粉中鐵元素的含量，對(duì)評(píng)價(jià)奶粉的質(zhì)量和正確引導(dǎo)消費(fèi)者具有重要的現(xiàn)實(shí)意義；在報(bào)道的文獻(xiàn)中，往往采用干法灰化法處理嬰幼兒配方奶粉，用火焰原子吸收光譜法測(cè)定奶粉中鐵元素的含量[宋龍波，趙龍剛，趙延偉，陳海華.火焰原子吸收光譜法測(cè)定嬰幼兒奶粉中鐵鋅元素含量[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40(33): 16374-16376]，然而，這種檢測(cè)方法存在著樣品制備程序繁雜、耗時(shí)長等缺點(diǎn)；具有高靈敏度和高選擇性的熒光探針近年來在檢測(cè)中有著廣泛的應(yīng)用，熒光核酸銀納米團(tuán)簇(DNA-AgNCs)因合成方法簡(jiǎn)單、毒性低、信號(hào)強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)從眾多探針中脫穎而出[Zhao T T,Chen Q Y, Wang Ρ D, Chen Z P.A DNA-Ag cluster as a sensor for BODIPY isomersand HepG-2 cells [J], RSC Adv., 2014, 4，10390-10394];蛋白質(zhì)和核酸的作用在生物過程中起著重要的作用，研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)和核酸的結(jié)合可以有效提高核酸銀的穩(wěn)定性，拓寬核酸銀在生物、化學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用[Zhou Z X, Dong S J.Protein-DNA interact1ns:a novel approach to improve the fluorescence stability of DNA/Ag nanoclusters[J].Nanoscale, 2015, 7，1296-1300]，穩(wěn)定的核酸銀體系用于食品檢測(cè)鮮見報(bào)道，我們的研究將為奶粉中鐵的定性定量檢測(cè)提供新的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]我們以一種CCCACCCACCCTGAGCTC小分子核酸(DNA)為模版，上述核酸購自上海生工生物工程有限公司，合成了一種新型熒光DNA納米銀簇(標(biāo)記為DNA-AgNCs);納米銀簇的大小為3 nm ;它在梓檬酸緩沖液中顯不淡黃色，用600 nm紅光激發(fā)，666 nm處有較強(qiáng)的熒光發(fā)射，熒光量子產(chǎn)率為0.2 (以聯(lián)吡啶釕為對(duì)照)。
[0004]核酸銀與牛血清白蛋白(BSA)組裝形成BSA-DNA-AgNCs體系中，DNA與BSA摩爾比1:1，由圖2可見該BSA-DNA-AgNCs組合體系的熒光對(duì)于三價(jià)鐵離子有明顯的熒光感應(yīng)，奶粉中富含豐富的蛋白質(zhì)和微量元素鐵，由圖2可知，DNA-AgNCs加入到奶粉中可以有效檢測(cè)奶粉中鐵元素的含量。
[0005]新型熒光DNA納米銀簇(DNA-AgNCs)的合成反應(yīng)過程如下:將CCCACCCACCCTGAGCTC小分子核酸溶解于檸檬酸緩沖液(pH 7，10 mM)中，DNA濃度為6.4μ Μ ;將DNA溶液水浴加熱，慢慢升溫至45~70 °C (最佳為60 °C )，加入硝酸銀溶液，Ag+的濃度為100~300 μ Μ (最佳為200 μ Μ);將上述溶液混合均勻后繼續(xù)升溫至DNA序列的Tm值75 V，在該溫度下穩(wěn)定1~10分鐘(最佳為3分鐘)，緩慢降至室溫，降溫時(shí)間為3小時(shí)，向上述溶液中加入NaBH4溶液，NaBH^濃度為100~300 μ Μ (最佳為200 μ M)，混合均勻后于室溫避光保存24 h即得核酸銀產(chǎn)物(DNA-AgNCs)。
[0006]將核酸銀產(chǎn)物和檸檬酸緩沖液混合得到核酸銀溶液，核酸銀溶液中以摩爾比DNA: BSA=1:1加入BSA溶液，可得BSA-DNA-Ag NCs穩(wěn)定熒光體系。
[0007]所述核酸銀溶液的濃度為0.5 -2 μΜ，優(yōu)選1 μΜ。
[0008]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):
本發(fā)明基于一種新型小分子核酸序列構(gòu)建新型熒光核酸銀納米團(tuán)簇，結(jié)果表明制備的核酸銀能夠與牛血清白蛋白(BSA)結(jié)合，形成穩(wěn)定的熒光核酸(BSA-DNA-Ag NCs),目前首個(gè)BSA穩(wěn)定的熒光核酸；其次，該熒光核酸探針對(duì)三價(jià)鐵離子有著明顯的熒光響應(yīng)，基于此，將BSA-DNA-Ag NCs (核酸銀)能直接運(yùn)用于檢測(cè)奶粉中的鐵含量(圖1，圖2)。
【附圖說明】
[0009]圖1為BSA-DNA-AgNCs (1 μ Μ,摩爾比1:1)溶液加入Fe3+后的熒光變化圖，λ ex=600 nm，圖中 Fe3+濃度為從上至下分別為 0、0.1、0.5、1.0、2.0、4.0 μΜ。
[0010]
圖2為BSA-DNA-AgNCs (1 μ Μ,摩爾比1:1)和DNA-AgNCs (1 μΜ)在不同條件下的熒光淬滅常數(shù)；鐵離子濃度分別為0，0.5，1.0, 2.0，4.0 μΜο
【具體實(shí)施方式】
[0011]、試劑和原料
反應(yīng)中所用的溶劑皆為分析純，所用試劑未加特殊說明直接應(yīng)用而未經(jīng)任何特殊處理；一水合檸檬酸鈉，九水合硝酸鐵，氫氧化鈉，硼氫化鈉(粉末，96%)，硝酸銀(99%，A.C.S.)購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，DNA序列(上海生工生物工程有限公司)，奶粉(荷蘭 Nutrilon 品牌，F(xiàn)e3+含量為 1.2 mg/14.9 g)0
[0012]紫外可見分光光度儀(日本島津UV-2450型)，190-800 nm ；Carry Eclipse熒光分光光度計(jì)(美國瓦里安有限公司)；JEM-200CX型透射電鏡(日本電子株式會(huì)社)Jasco-810圓二色譜儀(日本分光公司)；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干箱(上海-恒科技有限公司)；DZF-6051型真空干燥箱(上海-恒科技有限公司)JopPette手動(dòng)單道可調(diào)式移液槍(20-200 μ 1) ;PHS-3C酸度計(jì)(上海第二分析儀器廠)；恒溫水浴鍋(鞏義市予華儀器有限公司)。
[0013]化合物的合成方法:
實(shí)施例1 (最佳合成條件):
將CCCACCCACCCTGAGCTC小分子DNA溶解于檸檬酸緩沖液(pH 7，10 mM)中，DNA濃度為
6.4μ Μ ;將DNA溶液水浴加熱，慢慢升溫至60 °C，加入硝酸銀溶液，Ag+的濃度為200 μ Μ ;將上述溶液混合均勻后繼續(xù)升溫至DNA序列的Tm值75 V，在該溫度下穩(wěn)定3分鐘，緩慢降至室溫，降溫時(shí)間為3小時(shí)，向上述溶液中加入NaBH4溶液，NaBH 4的濃度為200 μ M，混合均勻后于室溫避光保存24 h即得核酸銀產(chǎn)物(標(biāo)記為DNA-Ag NCs);配制2 μ M、1 μ Μ、0.5μ Μ DNA-AgNCs (溶劑為檸檬酸緩沖液)溶液，用600 nm紅光激發(fā)，