一種檢測黃曲霉毒素m1的方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于納米生物傳感W及生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體設及一種檢測黃曲霉毒素 Ml的方法及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 1993年黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織(WHO)的癌癥研究機構(gòu)劃定為1類致癌物，是一 種毒性極強的劇毒物質(zhì)，對人畜危害極大。黃曲霉毒素是黃曲霉、寄生曲霉等產(chǎn)生的代謝產(chǎn) 物。黃曲霉毒素廣泛存在于±壤、大豆、稻谷、玉米、通屯、粉、調(diào)味品、牛奶及其制品、食用油、 肉類(魚)制品、花生和核桃等動植物和各種堅果中，特別是花生和核桃中。由于黃曲霉毒素 污染源極廣，因此無法完全消除黃曲霉毒素污染。哺乳動物攝入被黃曲霉毒素污染的飼料 或食品后，在體內(nèi)可被徑化而生成黃曲霉毒素 Ml。奶牛吃了被黃曲霉毒素污染的飼料，所產(chǎn) 奶中就會有黃曲霉毒素 M1，人們每天都會食用的牛奶，如果其中的黃曲霉毒素 Ml含量過高， 就會造成對人體健康的危害。由于黃曲霉毒素 Ml具有強的致癌作用，世界衛(wèi)生組織制定食 品黃曲霉毒素最高允許濃度為15yg/kg，美國聯(lián)邦政府有關(guān)法律規(guī)定人類消費的牛奶中的 含量不能超過0.化g/kg，其他動物飼料中的含量不能超過3(K)yg/kg。我國《GB 2761-2011食 品中真菌毒素限量》發(fā)布的國家標準中規(guī)定食品中黃曲霉毒素 Ml在乳及乳制品中的限量為 0.5yg/kg。歐盟國家規(guī)定原奶、熱處理奶及加工奶產(chǎn)品中黃曲霉毒素 Ml限量為0.05yg/kg， 嬰兒食品飽括嬰幼兒奶）中黃曲霉毒素 Ml限量為0.02扣g/kg。因此，建立高選擇性、高靈敏 的黃曲霉毒素 Ml的檢測方法具有重要意義。
[0003] 目前國內(nèi)外研究主要有色譜法、化學發(fā)光法和酶聯(lián)免疫法等。色譜法對操作技術(shù) 要求高，檢測成本較高，免疫法需要使用價格較昂貴的酶、抗體等生化試劑，而且運些生化 試劑很容易失活等不足。文獻Materials Science and Engineering C 33(2013)2229-2234公布了一種基于黃曲霉毒素 Ml核酸適體的黃曲霉毒素 Ml電化學測定法，該法選擇性和 檢測靈敏度均高，只是電極組裝較為復雜，需專業(yè)人才才能完成。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的之一在于提供一種簡單、快速、靈敏、高選擇性的檢測黃曲霉毒素 Ml 的方法，該方法包括如下步驟：
[0005] (1)先分別將含黃曲霉毒素 Ml核酸適體Apt的Tris緩沖溶液和含單鏈信號探針 ssDNA的化is緩沖溶液置于90°C水浴中加熱5分鐘后，迅速置于冰浴中保持5分鐘；分別取上 述處理過的3. Ομπιο?黃曲霉毒素 Ml核酸適體Apt溶液40化和3. Ομπιο?信號探針ssDNA溶液40μ L混合，在37°C反應化，形成雜交鏈Apt-ssDNA;
[0006] (2)向該雜交鏈Apt-ssDNA體系中加入待測樣品，當待測樣品中有黃曲霉毒素 Ml即 AFM1時，Apt-ssDNA中的Apt選擇性地與AFM1反應生成Apt-AFMl，同時釋放出單鏈信號探針 ssDNA；
[0007] (3)剩余Apt-SsDNA的去除：向步驟（2)體系中依次加入10化擴增緩沖溶液、1如L (1^?(1〇1111)和化1?扣290論聚合酶（1〇11/41)，在37°(3下反應8分鐘；體系中剩余的4口1-ssDNA經(jīng)DNA擴增形成雙鏈DNA;接著再向該反應體系中加入化L Exo III核酸外切酶(20ιι/μ L)和10化畑4F(25mM)-化Cl (0.1 M)溶液，雙鏈DNA在核酸外切酶選擇性地催化作用下迅速 水解成單核巧酸，體系中單鏈信號探針ssDNA被保留下來，從而消除剩余雜交鏈Apt-ssDNA 的干擾；其中，所述擴增緩沖溶液組成為50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，10mM(NH4)2S〇4，pH 7.5;
[0008] (4)利用Apt-AFMl不能誘導銀離子還原成近紅外巧光銀納米簇，只有單鏈信號探 針ssDNA能夠誘導銀離子還原生成強巧光的近紅外銀納米簇的原理，檢測銀離子還原檢測 體系近紅外巧光的強度，依據(jù)巧光強度與AFM1的量的關(guān)系，測定待測樣品中的黃曲霉毒素 Ml即AFM1的含量；其中，所述銀離子還原檢測體系包括先后添加的150化巧樣酸鋼溶液 (10mM，pH 8)、10化銀離子溶液（2.5mmol)和使銀離子迅速還原成近紅外巧光銀納米簇的 12化L+4價硫無機化合物還原劑8)。
[0009] 具體的，所述黃曲霉毒素 Ml核酸適體Apt為5/ -ACTGCTAGAGATTTTCCACAT-3/。
[0010] 具體的，所述單鏈信號探針S S D N A為5 ' -CCCCCCACACCCGATCCCCCCATGTGGAAAATCTCTA-3 '。
[0011] 本發(fā)明的檢測原理如下:先讓Apt與ssDNA雜交形成Apt-ssDNA雜交鏈；當有黃曲霉 毒素 Ml存在時，雜交鏈Apt-ssDNA與AFM1反應生成Apt-AFM1同時釋放出信號探針ssDNA;體 系中存在Apt-ssDNA(剩余的）、Apt-AFMl和信號探針ssDNAeApt-AFMl不能誘導銀離子還原 生成近紅外巧光的銀納米簇，對測定無干擾;雜交鏈Apt-ssDNA可能有干擾;為了消除雜交 鏈Apt-ssDNA的干擾:a.雜交鏈Apt-ssDNA經(jīng)DNA擴增形成雙鏈DNA; b.雙鏈DNA在核酸外切酶 選擇性地催化作用下迅速水解成單核巧酸而消除，體系中的單鏈信號探針ssDNA不水解(水 解速度極緩慢)而被保留下來。此時體系中有可誘導生成近紅外巧光的銀納米簇的ssDNA。 向體系中加入巧樣酸鋼溶液、銀離子和還原劑，銀離子在單鏈信號探針ssDNA的誘導下生成 被ssDNA修飾的近紅外銀納米簇;通過檢測體系近紅外巧光強度，依據(jù)近紅外巧光強度與 AFM1的量的關(guān)系，測定真菌毒素黃曲霉毒素 Ml的含量。由于消除了體系中背景巧光的干擾， 可W提局檢測的靈敏度和精度。
[0012] 本發(fā)明的目的之二在于提供一種檢測黃曲霉毒素 Ml的試劑盒，該試劑盒包括黃曲 霉毒素 Ml核酸適體Apt的化is緩沖溶液、單鏈信號探針ssDNA的化is緩沖溶液、DNA擴增體 系、核酸外切酶、銀離子還原檢測體系;其中，所述黃曲霉毒素 Ml核酸適體Apt的化is緩沖溶 液的黃曲霉毒素 Ml核酸適體Apt的物質(zhì)含量濃度、溶液體積與單鏈信號探針ssDNA的化is緩 沖溶液的單鏈信號探針ssDNA的物質(zhì)含量濃度、溶液體積均相同。
[0013] 具體的，所述黃曲霉毒素 Ml核酸適體Apt為5/ -ACTGCTAGAGATTTTCCACAT-3/。
[0014] 具體的，所述單鏈信號探針S S D N A為5 ' -CCCCCCACACCCGATCCCCCCATGTGGAAAATCTCTA-3 '。
[0015] 具體的，所述DNA擴增體系包括擴增緩沖溶液、Ξ憐酸脫氧單核巧酸混合溶液dNTP (lOmM)、Phi29DNA聚合酶（lOu/μΙ)和NH4F(25mM)-化Cl (0.1M)溶液；其中，擴增緩沖溶液組 成為50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，10mM(NH4)2S〇4，pH 7.5。
[0016] 具體的，所述核酸外切酶為Exo III核酸外切酶(20uAiL)。
[0017]具體的，所述銀離子還原檢測體系包括先后添加的巧樣酸鋼溶液（lOmM，抑8)、銀 離子溶液(2.5mmol)和使銀離子迅速還原成近紅外巧光銀納米簇的+4價硫無機化合物還原 劑8)。
[0018]本發(fā)明的檢測方法和試劑盒，可W消除背景巧光的干擾，提高了黃曲霉毒素 Ml的 檢測靈敏度和精度。
【附圖說明】
[0019]圖巧本發(fā)明實施例中，ssDNA-Ag納米簇巧光與黃曲霉毒素 Ml的濃度關(guān)系圖。
【具體實施方式】
[0020] 下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。
[0021] 實施例1:
[0022] 本實施例的檢測黃曲霉毒素 Ml的試劑盒包括:3. ΟμL?οΙ黃曲霉毒素 Ml核酸適體Apt 的Tr i S緩沖溶液40化、3. ΟμL?ο 1單鏈信號探針S sDNA的Tr i S緩沖溶液