對殺菌劑抗性且不產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉生防菌株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及農(nóng)產(chǎn)品安全領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種對殺菌劑抗性且不產(chǎn)黃曲霉毒素的黃 曲霉生防菌株及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃曲霉毒素主要由黃曲霉（AspergillusfIavus)和寄生曲霉（Aspergillus parasiticus)的代謝產(chǎn)物組成，是迄今發(fā)現(xiàn)的污染農(nóng)產(chǎn)品毒性最強的一類生物毒素。其中， 毒性最強、危害最大的為黃曲霉毒素BI,其毒性為氯化鐘的10倍、祇霜的68倍，被列入嚴管 的特劇毒物質(zhì)。農(nóng)產(chǎn)品黃曲霉毒素污染已成為影響食品安全和危害人們身體健康的重要污 染物。
[0003] 據(jù)世界糧農(nóng)組織估計，目前世界范圍內(nèi)有25%的農(nóng)作物產(chǎn)品受真菌毒素的污染， 其中主要就是黃曲霉毒素。黃曲霉毒素污染已對農(nóng)產(chǎn)品輸出國的對外貿(mào)易已產(chǎn)生了嚴重影 響。黃曲霉毒素主要污染花生、玉米等作物，嚴重影響我國花生、玉米等作物及其制品的出 口，給我國的出口貿(mào)易帶來了巨大損失。因此，黃曲霉毒素的有效防治與控制，對于保障我 國食品安全和提升我國農(nóng)產(chǎn)品出口競爭力具有重要意義。
[0004] 利用不產(chǎn)黃曲霉毒素菌株來抑制產(chǎn)毒菌菌群數(shù)量及產(chǎn)毒量的生物防治是目前控 制農(nóng)產(chǎn)品黃曲霉毒素非常有效的手段。美國近來在黃曲霉毒素生物防治研究方面已取得重 大進展，已經(jīng)批準兩個不產(chǎn)毒素的黃曲霉生防菌株（AF36和NRRL21882)，該黃曲霉生防菌 株在大田大面積使用，取得了顯著的經(jīng)濟和社會效益。利用不產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉菌株 NRRL21882能有效防治花生黃曲霉毒素污染，其防效可達90%W上，使花生中黃曲霉毒素 的含量能有效控制在限量標(biāo)準范圍內(nèi)。我國在黃曲霉毒素生防防治方面還處于初步階段， 暫無登記的防治黃曲霉的生防菌劑。篩選、開發(fā)利用防治黃曲霉毒素的生物農(nóng)藥，對解決我 國農(nóng)產(chǎn)品黃曲霉毒素污染問題將具有重要的應(yīng)用價值。 陽0化]在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，使用不產(chǎn)毒素的黃曲霉生防菌株來抑制毒素面臨一個重要的不利 因素，即農(nóng)用殺菌劑。農(nóng)田系統(tǒng)中，為了防治其他真菌病害，殺菌劑的使用是不可避免的。常 見的不產(chǎn)毒素的黃曲霉生防菌株對殺菌劑敏感，殺菌劑的使用將會抑制運些生防菌種群在 農(nóng)田系統(tǒng)中的增殖，從而影響生防效果及防效穩(wěn)定性。
[0006] 因此，篩選抗常用殺菌劑的不產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉生防菌株將能提高生防效果 的穩(wěn)定性，對防治黃曲霉毒素有著重要應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供了一種對殺菌劑抗性且不產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉生防菌株及其應(yīng)用。 該黃曲霉生防菌株不僅能有效抑制玉米和花生中黃曲霉毒素的形成，降低農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉 毒素的污染；還對常用殺菌劑多菌靈、戊挫醇和阿米西達具有較高抗性，能夠有效降低農(nóng)田 系統(tǒng)中殺菌劑對其種群增殖的抑制作用，從而維持生防菌的生防效果。 陽OO引本發(fā)明提供了一種黃曲霉生防菌株，命名為黃曲霉（Aspergillusflavus)AF054， 保藏編號為CGMCCNO. 9860,保藏日期為2014年11月20日。
[0009] 所述黃曲霉（Aspergillusflavus)AF054對常用的殺菌劑多菌靈、戊挫醇和阿米 西達均具有較高的抗性。
[0010] 具體地，AF054在含10yg/mL多菌靈或25yg/mL戊挫醇或100yg/mL阿米西達 的PDA平板上生長速率與不加藥的對照無顯著差異。
[0011] 所述黃曲霉生防菌株的生物學(xué)特征為：菌落呈黃綠色，產(chǎn)生分生抱子；分生抱子 梗的長度為700ym~1200Jim，直徑為11Jim~16Jim，頂囊近球形；分生抱子為球形或近 球形，直徑為3. 5Jim~4. 5Jim，抱子表面粗糖。 陽01引 本發(fā)明黃曲霉菌株AF054缺乏黃曲霉毒素合成基因C2、C3、norB、cypA、aflT、 pksA、aflR、aflj、adhA、estA、norA、adhA和vbs。
[0013] 本發(fā)明還提供了所述黃曲霉生防菌株在抑制產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉生長中的應(yīng) 用。
[0014] 具體地，所述黃曲霉生長在農(nóng)產(chǎn)品中。
[0015] 所述的農(nóng)產(chǎn)品為谷物、油料作物、堅果、香辛料、飼料原料、中草藥或水果。優(yōu)選地， 所述的農(nóng)產(chǎn)品為玉米或花生。
[0016] 本發(fā)明還提供了一種用于抑制產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉產(chǎn)毒的生防菌劑，所述菌劑 的活性成分為所述的黃曲霉生防菌株。
[0017] 作為優(yōu)選，所述的生防菌劑中，所述黃曲霉生防菌株的的抱子數(shù)為2~5X105個/ ITlLO
[0018] 所述的生防菌劑的制備方法，包括：W小麥為基質(zhì)，將小麥浸泡、高溫滅菌后，接 種黃曲霉菌株，在28°C溫度、0. 04-0. 06Mpa氣壓下發(fā)酵48小時。發(fā)酵終止后，將溫度升至 40°C，攬拌烘干的發(fā)酵產(chǎn)品。
[0019] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有W下有益效果：
[0020] (1)本發(fā)明分離獲得的黃曲霉不產(chǎn)黃曲霉毒素，能有效抑制農(nóng)產(chǎn)品中的黃曲霉毒 素的形成，降低農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素的污染，提高農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量；
[0021] (2)本發(fā)明獲得的不產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉菌株AF054具有對常用殺菌劑多菌 靈、戊挫醇和阿米西達的抗性，克服了現(xiàn)有生防菌劑對農(nóng)田系統(tǒng)中殺菌劑的敏感性問題，有 效提高了生防菌株在田間的適生性和定殖能力，從而提高了生防菌的生防效果。
【附圖說明】 陽02引圖1為本發(fā)明黃曲霉菌株AF054中黃曲霉毒素合成基因缺失示意圖。 陽02引圖2為本發(fā)明黃曲霉菌株AF054對多菌靈、戊挫醇和阿米西達的抗性示意圖。
【具體實施方式】
[0024] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[00巧]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0026] 黃曲霉毒素Bl購于Sigma公司。
[0027] 實施例1不產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉菌株AF054的分離、鑒定 陽02引 1、從±壤、玉米、花生等生境中分離黃曲霉菌株
[0029] 從江蘇、浙江、山東、福建、安徽等地的玉米、花生田塊中采集±壤，將該±壤用YES 培養(yǎng)基培養(yǎng)分離黃曲霉菌株。每升YES培養(yǎng)基成分：酵母提取物Ig,薦糖lOg，化Cl60g，瓊 脂20g，滅菌后加入CuS04.ZnS04l血，0.4%氯硝胺5ml，鏈霉素100yg/mL。
[0030] 2、用生物測定、薄層層析W及酶聯(lián)免疫法分析菌株產(chǎn)生黃曲霉毒素的情況。 陽0川具體如下；
[0032] 生物測定方法：將分離到的黃曲霉菌株接種在含0.3 %環(huán)狀糊精的YES培養(yǎng)基上， 30°C培養(yǎng)7天后，將菌落用25%氨水熏蒸3分鐘，如果菌落背面呈粉紅色，該菌株為產(chǎn)毒菌 株；如果菌落背面不變色，該菌株可能是不產(chǎn)毒素菌株，需進行下一步的薄層層析檢測。薄 層層析測定方法：將分離到的黃曲霉菌株接種在含0. 3%環(huán)狀糊精的YES培養(yǎng)基上，3(TC培 養(yǎng)7天后，收集100毫克菌絲和抱子，置于1. 5毫升的離屯、管中，并向其中加入200微升的 80%甲醇；室溫下震蕩30分鐘后10,OOOg離屯、5分鐘，取50微升上清液點到硅膠層析板上， 吹干后將薄層層析板置于展布槽內(nèi)用無水乙酸預(yù)展12厘米，取出涼干后在經(jīng)過丙酬：=氯 甲燒（8:9。展開10~12cm，然后，取出層析板，365nm紫外燈下觀測，有淡藍色銀光斑點的 菌株為產(chǎn)毒菌株；如果沒有淡藍色銀光斑點，說明該菌株很可能是不產(chǎn)毒菌株，運些菌株可 進行下一步分子生物學(xué)檢測。
[0033] 酶聯(lián)免疫法檢測菌株是否產(chǎn)生黃曲霉毒素：按照中華人民共和國國家標(biāo)準GB/ T5009. 22-2003《食品中黃曲霉毒素Bl的測定》方法，并利用北京市營養(yǎng)源研究所研發(fā)的 ELISA定量試劑盒定量檢測黃曲霉毒素Bl。
[0034] 通過上述方法分析，篩選出不產(chǎn)黃曲霉毒素的菌株AF054,分離自浙江省紹興市的 上壤。
[0035] 3、菌株的分子鑒定
[0036] 通過巧調(diào)基因序列對真菌AF054進行分子鑒定（Ro化igues P, Santos C,VenaneioA, LimaN.，2011. Species identification of Aspergillus section Flavi isolates from Portuguese almonds using phenotypic, including MALDI-TOF ICMS, and molecular approaches.JAppl Microbiol. 111(4):877-92.)黃曲霉基因組巧調(diào)基因cmdA 的PCR擴增所用的引物為化I和化2A，序列為：
[0037] CLl :5> -GARTWCAAGGAGGCCTTCTC-3> 陽的8] CL2A:5' -TTTTTGCATCATGAGTTGGAC-3'。
[0039]PCR反應(yīng)的體系為：1yLDNA模板（約 4ng)，0.ImM引物各 1yL，IOmMdNTP 0. 5yL25mMMgC122yL，10Xbuffer2. 5yL，聚合酶 1.抓個單位，雙蒸水補足至 25yL。 W40] 反應(yīng)條件為：95 °C預(yù)變性3min，94°C變性40s，各組引物53 °C退火40s，72 °C延伸 Imin，進行35個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。
[0041] PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后送至華大基因進行測序。測序結(jié)果在BLAST researches上比對 測序結(jié)果化ttp://www. ncbi. nlm. nih. gov/)。 陽0創(chuàng)菌株AF054的巧調(diào)蛋白基因的PCR擴增產(chǎn)物的測序結(jié)果分別如SEQIDNO. 1所 示。序列在NCBI上對比結(jié)果顯示，菌株AF054與黃曲霉菌標(biāo)準菌株NRRL3357的同源性為 100%。
[0043]菌株AF054在YES培養(yǎng)基上菌落生長較快，30°C條件下5天可長滿直徑9cm的培 養(yǎng)皿；菌落黃綠色，產(chǎn)生大量分生抱子；分生抱子梗長度一般為700Jim~1200Jim，直徑為 11Jim~16Jim，頂囊近球形；分生抱子球形或近球形，直徑3. 5Jim~4. 5Jim，抱子表面粗 糖。符合黃曲霉菌株的特征。
[0044] 綜上，通過上述各方法從±壤、花生上，分離、篩選和鑒定出不產(chǎn)黃曲霉毒素的黃 曲霉菌株AF054,并對菌株進行了保藏。
[0045] 菌株保藏說明：
[0046] 菌株名稱：黃曲霉；拉下名：AspergillusfIavus;菌株編號：AF054 ;
[0047] 保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、；
[0048]保藏號：CGMCCNO. 9860。 W例保藏機構(gòu)簡稱：CGMCC;
[0050] 地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號；保藏日期：2014年11月20日；
[0051] 實施例2不產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉菌株AF054中黃曲霉毒素合成基因缺失鑒定 陽0巧 （1)引物合成 陽053] 為明確不產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉菌株AF054中黃曲霉毒素合成基因缺失情況， 試驗參考 了文獻F*erng-KuangQiang(Qiang,P.K. ,Horn,B.W.andDorner,J.W. (2005)Sequencebre曰kpointsinthe曰fl曰toxinbiosynthesisgenecluster曰ndfl曰nking regionsinnonafIatoxigenicAspergillusflavusisolates.FungalGenetBio 42, 914 - 923.)中設(shè)計的關(guān)于毒素合成基因的鑒定引物，對菌株AF054中相關(guān)基因進行了 缺失情況鑒定。
[0054]似基因缺失鑒定 陽化5] W提取的黃曲霉菌株AF054的DNA為模板，分別用W上引物進行常規(guī)PCR反應(yīng)，每 個反應(yīng)均有產(chǎn)毒黃曲霉菌株DNA對照和