抑制ehd2蛋白表達(dá)水平的rna干擾序列及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一段抑制人或哺乳動物細(xì)胞EHD2蛋白表達(dá)水平 的RNA干擾序列以及以此核心序列為基礎(chǔ)的針對EHD2的靶向干擾技術(shù)，具體涉及抑制EHD2 蛋白表達(dá)水平的RNA干擾序列及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] RNA 干擾（RNA interference，RNAi)是由細(xì)胞內(nèi)雙鏈小干擾 RNA(small interference RNA，siRNA)引導(dǎo)的，通過細(xì)胞內(nèi)RNA干擾原理識別具有同源序列的革巴點(diǎn) mRNA后引起mRNA的降解或翻譯抑制，從而抑制或降低mRNA編碼蛋白表達(dá)水平的現(xiàn)象，其核 心是一段21個(gè)核苷酸左右長度的具有靶向性的特異核酸序列，下面統(tǒng)稱為核心序列。RNAi 是廣泛存在于大多數(shù)真核生物中，發(fā)生于轉(zhuǎn)錄后階段的基因沉默現(xiàn)象。
[0003] 近年來，人們利用這一原理針對靶基因表達(dá)進(jìn)行阻斷，從而產(chǎn)生相應(yīng)的功能缺失 表型用于科學(xué)研究，或疾病治療，形成RNAi技術(shù)。根據(jù)RNAi原理，既可以在體外直接合成 以核心序列為基礎(chǔ)的RNA雙鏈（siRNA)轉(zhuǎn)入細(xì)胞，也可以利用不同的DNA表達(dá)載體攜帶核 心序列在體內(nèi)表達(dá)形成短發(fā)夾狀RNA(shRNA)，起到特異性識別與降解相應(yīng)的靶基因 mRNA， 或封閉其翻譯的效果。雖然RNAi技術(shù)提供了一種對任何基因進(jìn)行靶向干預(yù)調(diào)控的手段，在 生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究和疾病治療領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值和前景，但其前提是必需針對靶基 因?qū)ο笳归_分析、預(yù)測和實(shí)驗(yàn)篩選，找到一段特異和有效的核心序列，然后以此核心序列為 基礎(chǔ)，通過如上所述的通用方法實(shí)施對靶基因在蛋白水平的表達(dá)干擾。
[0004] EHD2 (C-terminal EH domain-containing protein 2)屬于 Ε? 蛋白家族，是一種 新型膜轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控蛋白，對受體內(nèi)吞及分子轉(zhuǎn)運(yùn)起關(guān)鍵作用。在腫瘤中，EHD2的表達(dá)情況與腫 瘤緊密相關(guān)，對EHD2表達(dá)水平的干預(yù)與調(diào)控對腫瘤研究及疾病治療具有重要意義。為了進(jìn) 一步研究EHD2在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用以及為EHD2為靶點(diǎn)的腫瘤的基因治療提供新的技 術(shù)手段，本發(fā)明公布了一段抑制人或哺乳動物細(xì)胞EHD2基因表達(dá)的RNA干擾序列，這是一 段與人或哺乳動物細(xì)胞中EHD2 mRNA同源的核酸序列，以此序列為核心序列，可以開發(fā)出各 種基于RNA干擾原理的EHD2干擾技術(shù)用于抑制EHD2蛋白的表達(dá)水平，包括直接合成siRNA 后通過轉(zhuǎn)染（Transfection)技術(shù)引入人或哺乳動物細(xì)胞，或構(gòu)建DNA載體通過轉(zhuǎn)染或病毒 感染技術(shù)引入體外培養(yǎng)細(xì)胞或體內(nèi)細(xì)胞等，從而達(dá)到降低EHD2蛋白表達(dá)水平的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為進(jìn)一步研究EHD2在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用以及為EHD2為靶點(diǎn)的腫瘤等疾病的 基因治療提供了一個(gè)新的技術(shù)手段，本發(fā)明提供了一段抑制人或哺乳動物細(xì)胞EHD2蛋白 表達(dá)水平的RNA干擾序列，該RNA干擾序列與EHD2的mRNA互補(bǔ)，具有抑制或降低EHD2蛋 白表達(dá)的功能。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過如下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：
[0007] 通過直接合成以本發(fā)明所公開的序列為核心的雙鏈RNA，或通過構(gòu)建以本發(fā)明所 公開的序列為核心的DNA表達(dá)載體，經(jīng)轉(zhuǎn)染或病毒感染等常規(guī)轉(zhuǎn)基因手段引入人或哺乳動 物細(xì)胞，利用細(xì)胞RNA干擾原理，起到對細(xì)胞內(nèi)EHD2的mRNA的識別降解或蛋白翻譯抑制效 果。
[0008] 利用本發(fā)明技術(shù)，可以對EHD2的生物學(xué)作用進(jìn)一步展開廣泛深入的基礎(chǔ)研究，并 可為以EHD2為靶點(diǎn)的腫瘤等疾病的基因治療等轉(zhuǎn)化研究與臨床應(yīng)用提供新的有效手段。
[0009] 該序列的DNA脫氧核糖核酸序列如下：
[0010] 5' -ACCAAGGACAAGTCCAAATAC-3'，具體為國際通用基因序列號為 NM_014601 的 EHD2基因序列中的第1339至第1359位核苷酸。
[0011] 與此DNA序列對應(yīng)的RNA核糖核酸序列為：
[0012] 5' -ACCAAGGACAAGUCCAAAUAC-3'
[0013] 其特征是：通過以該核糖核酸序列作為核心序列合成基因干擾RNA片段，或以該 脫氧核糖核酸序列作為核心序列構(gòu)建DNA表達(dá)載體，經(jīng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)引入人或哺乳動物細(xì)胞 后，在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生對EHD2 mRNA的特異性識別，從而起到抑制EHD2蛋白翻譯、降低EHD2蛋 白表達(dá)水平的作用。這項(xiàng)技術(shù)可以用于對EHD2作用機(jī)制的廣泛研究，以及進(jìn)行以EHD2為 靶點(diǎn)的腫瘤等疾病的干預(yù)與治療。
[0014] 有益效果
[0015] 本發(fā)明的有益效果為：
[0016] 本發(fā)明公開了一段抑制人或哺乳動物細(xì)胞EHD2蛋白表達(dá)水平的RNA干擾核心序 列，該序列能夠有效地抑制或降低EHD2的蛋白表達(dá)，為深入研究EHD2的生物學(xué)作用以及為 腫瘤等疾病的臨床治療提供了可行的手段。
【附圖說明】
[0017] 圖1是轉(zhuǎn)入EHD2干擾序列為核心的核酸后細(xì)胞EHD2蛋白表達(dá)水平受到抑制的免 疫印跡檢測結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明。
[0019] 實(shí)驗(yàn)材料來源：
[0020] 人宮頸癌Hela細(xì)胞、人乳腺癌Bcap37細(xì)胞、人非癌乳腺上皮細(xì)胞HbllOO購于美 國 American Type Culture Collection(ATCC)公司，由本公司保存。pCMV/Neo 質(zhì)粒和陰性 對照Ctrl-siRNA質(zhì)粒購自上海吉?jiǎng)P公司；Neomycin購自Invitrogen公司。EHD2抗體為抗 原純化的兔抗人多克隆抗體，由本公司制備，為非商品化試劑，已申請專利。
[0021] 實(shí)施方法：
[0022] I. EHD2干擾序列的合成
[0023] 以本發(fā)明中的RNA干擾序列為核心序列（由下劃線標(biāo)出），合成以下DNA片段及其 反義片段：
[0024] 5' -AAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGAACCAAGGACAAGTCCAAATACAGTGAAGCCACAGATGT AGTATTTGGACTTGTCCTTGGTCTGCCTACTGCCTCGCAATTC-3，
[0025] 2. EHD2-shRNA表達(dá)載體構(gòu)建
[0026] 表達(dá)載體pCMV/Neo用Xho I和EcoR I酶切形成粘性末端。將上述合成的EHD2 干擾DNA片段退火，連入pCMV/Neo質(zhì)粒載體中，轉(zhuǎn)染感受態(tài)大腸桿菌DH5 α后，鋪平板過夜 培養(yǎng)。挑取轉(zhuǎn)化菌擴(kuò)增培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，測序驗(yàn)證插入序列。
[0027] 陰性對照Ctrl-shRNA載體由吉?jiǎng)P公司提供，含有一段與人類已知基因均不同源 的 shRNA。
[0028] 3.載體轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞株
[0029] 上述質(zhì)粒在脂質(zhì)體介導(dǎo)下分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，5% 0)2溫箱孵育48h。添加0. 25mg/ml Neomycin篩選至無轉(zhuǎn)染對照組細(xì)胞完全死亡，約14天。
[0030] 4.檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中EHD2的表達(dá)水平
[0031] 采用免疫印跡的方法檢測EHD2的表達(dá)水平，將對照細(xì)胞和EHD2-shRNA轉(zhuǎn)染的細(xì) 胞用RIPA裂解液裂解，用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度的測定，取相同蛋白總量進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，將膠上蛋白電轉(zhuǎn)到PVDF膜，室溫5%牛奶封閉1小時(shí)。洗滌后加一抗（兔抗人EHD2 抗體）室溫孵育1小時(shí)，然后用兔二抗室溫孵育1小時(shí)，最后用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測。 對曝光條帶進(jìn)行定量分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。
[0032] 本發(fā)明實(shí)施效果：
[0033] 見圖1，EHD2_shRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入三種人源細(xì)胞，通過免疫印跡的方法證明：與 對照細(xì)胞相比，干擾細(xì)胞中EHD2蛋白表達(dá)量明顯降低。
[0034] 從以上結(jié)果得出：本發(fā)明設(shè)計(jì)的EHD2特異的核心序列可以對細(xì)胞中EHD2基因表 達(dá)進(jìn)行干擾并有效抑制EHD2蛋白的表達(dá)，為進(jìn)一步研究EHD2的作用及臨床治療提供了可 行的手段。
[0035] 上述實(shí)施例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā) 明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一段能夠特異性抑制人或哺乳動物EHD2基因表達(dá)的核酸序列，其特征在于，該序列 與人或哺乳動物EHD2mRNA互補(bǔ)，干擾或抑制其蛋白翻譯，該序列的DNA脫氧核糖核酸序列 如下： 5' -ACCAAGGACAAGTCCAAATAC-3'，其對應(yīng)的RNA核糖核酸序列為： 5' -ACCAAGGACAA⑶CCAAAUAC-3'。2. -種抑制人或哺乳動物EHD2基因表達(dá)的小RNA干擾技術(shù)，其特征在于，以權(quán)利要求 1中所述的一段能夠特異性抑制人或哺乳動物EHD2基因表達(dá)的核酸序列為核心序列制備 基因干擾RNA片段或構(gòu)建DNA表達(dá)載體。3. 如權(quán)利要求2所述的一種抑制人或哺乳動物EHD2基因表達(dá)的小RNA干擾技術(shù)，其 特征在于，將制備的基因干擾RNA片段或構(gòu)建的DNA表達(dá)載體經(jīng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)引入人或哺乳 動物細(xì)胞后，在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生對EHD2mRNA的特異性識別，從而起到抑制EHD2蛋白翻譯、降低 EHD2蛋白表達(dá)水平的作用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一段人或哺乳動物EHD2(C-terminal？EH？domain-containing？protein2)基因特異的核酸序列，該序列與EHD2的mRNA互補(bǔ)，可以在細(xì)胞內(nèi)通過識別EHD2mRNA的同源序列干擾或抑制EHD2蛋白翻譯。該序列的DNA脫氧核糖核酸序列為：5’-ACCAAGGACAAGTCCAAATAC-3’。以此序列為核心的基因干擾技術(shù)可用于抑制人或哺乳動物細(xì)胞EHD2蛋白的表達(dá)。
【IPC分類】C12N15/113
【公開號】CN105400788
【申請?zhí)枴緾N201511004588
【發(fā)明人】應(yīng)國光, 劉博
【申請人】天津市應(yīng)世博科技發(fā)展有限公司
【公開日】2016年3月16日
【申請日】2015年12月25日