一種黃曲霉毒素b1的單克隆抗體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種黃曲霉毒素 B1的單克隆抗體及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃曲霉毒素 B1主要存在于霉變的花生、谷物、果仁和大米中。因其對人、畜肝臟的 劇烈損害而名列毒性之首。它們常存在于各種動物飼料和人類食品中。用污染的飼料飼養(yǎng) 畜禽，會導(dǎo)致肉、乳及其制品的污染，所W必須注意檢查特別容易受黃曲霉毒素污染的食品 原材料，W及用運些原材料加工的食品中的黃曲霉毒素，運些食品有花生、核桃、開屯、果、杏 仁、桃仁和李仁、挪絲、芝麻和各種糧食。人類食用被污染的食品會導(dǎo)致急性中毒，引起肝臟 壞死出血，慢性中毒可引起肝癌。同時用被污染的飼料飼養(yǎng)畜禽會使畜禽生產(chǎn)率降低，增重 減慢，造成重大經(jīng)濟損失。迄今為止，急性AFT中毒病例在世界上許多國家，尤其在發(fā)展中國 家報道較多。因此各國對食品及飼料AFTB1的限量進行了規(guī)定，歐盟等國在2002年對糧食、 花生及其產(chǎn)品中的AFTB1的限量進行了修訂，再次提高上述農(nóng)產(chǎn)品中的AFTB1的限量標(biāo)準(zhǔn)， 如供人類直接食用的花生AFTB1限量為< ^g/kg，作為食品原料進口的花生AFTB1限量為< 祉g/kg。我國也先后于1982、1992和1998年制定并實施了食品和飼料中AFTB1允許含量的強 制性國家標(biāo)準(zhǔn)，但限量要求仍低于國外。
[0003] 我國在食品中真菌毒素限量GB 2761-2005版和2011版中，分別規(guī)定了花生、玉米、 大米、植物油、豆類、發(fā)酵食品W及乳制品中黃曲霉毒素 B1、M1的限量值，在2011年的新版本 中并沒有改變黃曲霉毒素 B1在上述食品中的最高限量值。歐盟在2010年的2月27日頒布了 化U)No 165/2010號法規(guī)中，規(guī)定了谷物，油巧，調(diào)味料和堅果中的黃曲霉毒素含量的最高 限量。該規(guī)則修訂化C)No 1881/2006條例中關(guān)于食品中黃曲霉毒素的最大限量值。該條例 已于2010年3月6日起正式生效。
[0004] 近年來，關(guān)于AFTB1的檢測方法研究較多，大致可分為薄層層析法(TLC)、液相色譜 法化PLC)和酶聯(lián)免疫法化LISA)。薄層層析法雖為GB5009.22-2003《食品中黃曲霉毒素 B1的 測定方法》中的第一檢測法，但是該方法不專一，容易使樣品中的其他巧光物質(zhì)對其測定 造成干擾。液相色譜法專一性較強，但實驗過程繁瑣，容易造成被測物質(zhì)的損失，且所需儀 器設(shè)備昂貴，降低了其推廣性。酶聯(lián)免疫法是當(dāng)今測定黃曲霉毒素 B1較常用的方法之一，該 方法推出前國標(biāo)一直使用的化C法測定AFB1。用化C法測定AFB1，步驟多，耗時長，所用試劑 繁多，且只能實現(xiàn)半定量。在實驗的操作過程中，實驗員必須和毒素長時間直接接觸，不適 合大批量樣品的檢測，也無法實現(xiàn)快速。而化ISA法靈敏度高，分析速度快，簡化了提取和純 化的步驟，整個實驗僅需要化，且可W-次測定多個樣品，正是ELISA獨特的優(yōu)點，使得其在 1998年就被寫進當(dāng)時的國家標(biāo)準(zhǔn)，作為第二法來輔助第一法(高效液相色譜法），在使用色 譜法之前先利用該法對樣品進行初篩，有針對性的對樣品進行定量檢測。
[0005] 在實際的檢測活動中化ISA酶聯(lián)免疫法的使用較為普遍，因為化ISA法不需要專用 的大型設(shè)備、對操作人員要求也不高、成本也相對較低，所W化ISA法已經(jīng)被很多企業(yè)和檢 驗檢測機構(gòu)所采用，作為陽性樣品的初篩工具。但由于同類分子的相似性，AFB1的化ISA等 免疫檢測方法容易對結(jié)構(gòu)相似的其他黃曲霉毒素或化學(xué)物質(zhì)產(chǎn)生一定的交叉反應(yīng)性，影響 實驗的準(zhǔn)確度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為獲得一種靈敏度較高，特異性較強的，可適用于檢測AFTB1的抗體及其應(yīng)用，本 發(fā)明人對此經(jīng)過大量的深入研究，在付出了充分的創(chuàng)造性勞動后，從而完成了本發(fā)明。
[0007] 一種可分泌AFTB1單克隆抗體的雜交瘤細胞4D5,保藏于中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中屯、，保藏號為CGMCC 11199,保藏日期為2015年9月23日，保藏地址為北 京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。
[000引上述雜交瘤細胞4D5在制備AFTB1檢測試劑或者檢測設(shè)備中的應(yīng)用。
[0009] -種由所述雜交瘤細胞4D5分泌的抗AFTB1單克隆抗體。
[0010] 所述抗AFTB1單克隆抗體在制備AFTB1檢測試劑或檢測設(shè)備中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明提供的雜交瘤細胞株制備過程，步驟為:將黃曲霉毒素 B1溶于0.5ml生理鹽 水中，加入等體積佐劑制成乳化劑，免疫雌性BALB/c小鼠3次，第一次免疫劑量為第二Ξ次 的2倍，最后一次加強免疫用與第Ξ次一樣免疫劑量無佐劑的AFTB1，免疫49天后進行細胞 融合。用間接化ISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液，選出陽性產(chǎn)抗黃曲霉毒素 B1抗體的單克隆孔， 挑出陽性高，阻斷情況好的單克隆孔繼續(xù)做亞克隆，直至最后一次克隆有細胞的孔都為陽 性產(chǎn)目的抗體。采用有限稀釋法對雜交瘤細胞進行克隆。用間接化ISA法檢測細胞培養(yǎng)上清 液，選出陽性產(chǎn)抗黃曲霉毒素 B1抗體的單克隆孔，挑出陽性高，阻斷情況好的單克隆孔繼續(xù) 做亞克隆，直至最后一次克隆有細胞的孔都為陽性產(chǎn)目的抗體。
[0012] 本發(fā)明提供的抗黃曲霉毒素 B1單克隆抗體的制備方法，步驟如下:采用小鼠體內(nèi) 誘生腹水的方法制備單克隆抗體。取健康BALB/c雌性小鼠，注入液體石蠟0.5ml，1~2周后 備用。將擴大培養(yǎng)的陽性克隆雜交瘤細胞用基礎(chǔ)培養(yǎng)液制備成細胞懸液，細胞計數(shù)后，將細 胞數(shù)調(diào)至1〇6個/ml,注射小鼠腹腔ImL/只。7~10天后收集腹水，一只小鼠可獲5~lOmL腹 水，300化pm離屯、lOmin，棄脂肪層和細胞層，收集中間澄清層，分裝，-70°C凍存。
[0013] 按上述方案，所述單克隆抗體的純化步驟為：
[0014] ①腹水的預(yù)處理采用二氧化娃吸附法:取一定量的腹水，加等量己比妥緩沖鹽水 (VBS)稀釋。加適量二氧化娃粉末，室溫30min，不時搖動。2000g離屯、20min，即得澄清的腹 水。
[0015] ②辛酸一硫酸錠沉淀法純化IgG:向一份預(yù)處理過的腹水中加入兩份0.06M、抑5.0 的乙酸緩沖液，用0.1N肥1調(diào)抑至4.8。于室溫攬拌下在30min內(nèi)逐滴緩慢加入辛酸，每ml稀 釋前的腹水加33μ1，4Γ靜置化，15000g離屯、30min，棄沉淀。上清經(jīng)砂屯、漏斗過濾，加入1/10 體積的0.1M PBS;用1N化0H調(diào)pH至7.4。于4°C冰浴下于30min內(nèi)加入0.277g/ml的（NH4) 2S04，使其達到45 %的飽和度;靜置比W上。4°C下lOOOOg離屯、30min，棄上清。沉淀溶于適量 抑7.4,含137mM化Cl，2.6mM KCl，0.2mM抓TA的PBS中，對50~100倍的PBS于4°C透析過夜。 4°C下lOOOOg離屯、30min，除去不溶性沉渣。
[0016] ③親和層析純化IgG:
[0017] (1)柱子用結(jié)合buffer平衡10個柱體積(約10ml);
[0018] (2)樣品用0.45皿的濾器過濾去除不溶物，與結(jié)合buffer按1:1(V:V)混合。用注射 器進樣，然后依次用10個柱體積（約10ml)洗脫Buffer B1和Buffer B2洗脫，并分別加入 0.5ml和 1.3ml中和Buffer C;
[0019] (3川欠集Buffer B1洗脫液和Buffer B2洗脫液，對5mM PBS透析，濃縮備用。
[0020] 即得純化好的抗黃曲霉毒素 B1單克隆抗體。
[0021] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0022] 本發(fā)明提供的雜交瘤細胞株可W用于制備高效價抗黃曲霉毒素 B1單克隆抗體，抗 黃曲霉毒素 B1小鼠腹水抗體酶聯(lián)免疫吸附分析化LISA)法測得的效價可達1:100000,培養(yǎng) 液效價1:20000~1:100000之間。
[0023] 本發(fā)明提供的抗黃曲霉毒素 B1單克隆抗體靈敏度高、特異性好，對黃曲霉毒素 B1 的親合常數(shù)在1〇8~1〇>-1之間。
[0024] 本發(fā)明提供的抗黃曲霉毒素 B1單克隆抗體可應(yīng)用于測定黃曲霉毒素 B1含量。
【附圖說明】
[00巧]圖1校準(zhǔn)曲線圖
【具體實施方式】
[0026] 下面通過具體的實施例對本發(fā)明進行詳細說明，但運些例舉性實施方式的用途和 目的僅用來例舉本發(fā)明，并非對本發(fā)明的實際保護范圍構(gòu)成任何形式的任何限定，更非將 本發(fā)明的保護范圍局限于此。
[0027] 實施例1、雜交瘤細胞株的篩選
[0028] 1、動物飼養(yǎng)及處理
[0029] 健康雌性BALB/c小鼠先飼養(yǎng)觀察1周，無異樣，斷尾取血，W間接競爭化ISA分析血 清，陰性者用于制備抗體，陰性血清-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0030] 1.1動物免疫
[0031] 將黃曲霉毒素 B1溶于0.5ml生理鹽水中，加入等體積佐劑制成乳化劑，免疫雌性 BALB/c小鼠。第Ξ次免疫后7~lOd測定血清效價。免疫程序見表1。
[0032] 表1動物免疫程序
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[00巧]1.2血清效價的測定
[0036] 免疫后的BALB/c小鼠尾部采血0.1ml，3000巧m離屯、5min，收集血清，4°C保存。用 ELISA法測定血清效價。
[0037