靶向性沉默ID1的shRNA序列、引物、應(yīng)用、shRNA慢病毒載體及構(gòu)建方法【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)與生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，主要涉及一種靶向性沉默IDl的shRNA序列、引物、應(yīng)用、shRNA慢病毒載體及構(gòu)建方法?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]RNA干擾（RNAinterference，RNAi)是一種在進(jìn)化上保守的基因防御機(jī)制，即一種序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默（post-transcriptionalgenesilencing，PTGS)。近年來，RNAi技術(shù)作為一種新基因療法，已被廣泛應(yīng)用于疾病的基因治療研究領(lǐng)域，例如老年視黃斑退化、肌肉萎縮性側(cè)索硬化癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。相比其它治療手段，RNAi技術(shù)對(duì)致病基因的靶向性更強(qiáng)，毒副作用更低，因此開發(fā)更多的針對(duì)癌癥的RNA干擾片段具有十分重要的意義。[0003]細(xì)胞分化抑制因子（inhibitorofDNAbindingordifferentiation)，簡稱ID蛋白，屬于螺旋-環(huán)-螺旋（helix-loop-helix)轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，該家族是調(diào)控細(xì)胞增殖和分化的重要因子。IDl是ID蛋白的一個(gè)重要亞型，具有ID類蛋白的典型功能。IDl不僅參與正常細(xì)胞的生長發(fā)育，也與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、腫瘤血管生成有密切關(guān)系。近期研究發(fā)現(xiàn)，IDl在宮頸癌細(xì)胞等惡性腫瘤中表達(dá)明顯上調(diào)，其上調(diào)程度與腫瘤惡性程度相關(guān)。宮頸癌（cervicalcancer)是指源發(fā)于子宮頸及宮頸周圍組織的惡性腫瘤，腫瘤組織可直接或通過淋巴轉(zhuǎn)移，常見病理類型有鱗狀細(xì)胞癌，腺癌等。在我國，每年約有13.15萬新發(fā)病例，其發(fā)病率有明顯增高和年輕化趨勢(shì)，且腺癌比例增加。IDl的高表達(dá)與腫瘤侵襲相關(guān)性已得到證實(shí)，IDl可能成為提示腫瘤預(yù)后的有效因子。[0004]因此，以宮頸癌細(xì)胞Hela為例，研究通過RNA干擾技術(shù)沉默IDl基因，將shIDl作為基因治療手段，研究shIDl在宮頸癌等腫瘤疾病的基因治療領(lǐng)域的應(yīng)用，具有很大的意義。但是，目前現(xiàn)有技術(shù)中尚未有此類研究?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0005]本發(fā)明的目的是提供一種靶向性沉默IDl的shRNA序列、引物、應(yīng)用、shRNA慢病毒載體及構(gòu)建方法，旨在通過抑制IDl基因的表達(dá)，抑制宮頸癌細(xì)胞等惡性腫瘤的增殖。[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案如下：[0007]-種靶向性沉默IDl的shRNA序列，其中，包含針對(duì)人IDl基因（GeneID:3397)設(shè)計(jì)的siRNA，其對(duì)應(yīng)的靶位點(diǎn)序列為：5'-CCTACTAGTCACCAGAGACTT-3'。[0008]-種用于制備如上所述的shRNA序列的引物，其中，引物序列如下：[0009]上游引物序列shIDl-Pl:5'-ACCGCCTACTAGTCACCAGAGACTTCTCGAGAAGTCTCTGGTGACTAGTAGG-3，；[0010]下游引物序列shIDl-P2:5'-AAAACCTACTAGTCACCAGAGACTTCTCGAGAAGTCTCTGGTGACTAGTAGG-3,。[0011]-種ShRNA慢病毒載體，其中，所述ShRNA慢病毒載體用于表達(dá)如上所述的shRNA序列，所述shRNA慢病毒載體包含沉默目的基因IDl的靶位點(diǎn)序列5'-CCTACTAGTCACCAGAGACTT-3'。[0012]所述的shRNA慢病毒載體，其中，所述shRNA慢病毒載體中包含采用以下引物退火合成得到的IDl序列；引物序列如下：[0013]上游引物序列shIDl-Pl:5'-ACCGCCTACTAGTCACCAGAGACTTCTCGAGAAGTCTCTGGTGACTAGTAGG-3，；[0014]下游引物序列shIDl-P2:5'-AAAACCTACTAGTCACCAGAGACTTCTCGAGAAGTCTCTGGTGACTAGTAGG-3,。[0015]-種如上所述的shRNA慢病毒載體的構(gòu)建方法，其中，包括以下步驟：[0016]采用引物退火合成shRNA序列；其中，上游引物序列shIDl-Pl:5'-ACCGCCTACTAGTCACCAGAGACTTCTCGAGAAGTCTCTGGTGACTAGTAGG-3'；下游引物序列shIDl-P2:5'-AAAACCTACTAGTCACCAGAGACTTCTCGAGAAGTCTCTGGTGACTAGTAGG-3'；[0017]將合成的shRNA序列連接到shRNA慢病毒載體上；[0018]轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞stable3,涂LB-Amp平板培養(yǎng)過夜，隨機(jī)挑取一個(gè)單克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，構(gòu)建得到用于表達(dá)靶向性沉默IDl的shRNA序列的shRNA慢病毒載體。[0019]所述的shRNA慢病毒載體的構(gòu)建方法，其中，將合成的shRNA序列連接到shRNA慢病毒載體上的過程包括以下步驟：[0020]以pCDFl-MCS2-EFl-copGFP載體為模板，PCR擴(kuò)增得到EFl-copGFP片段，用MluI和AfeI雙酶切PCR產(chǎn)物，然后插入到同樣經(jīng)過MluI和AfeI雙酶切的慢病毒載體pLVX-Puro上，得到載體骨架pLVX-EFl-copGFP-PGK-Puro;[0021]用ClaI和XhoI雙酶切載體骨架pLVX-EFl-copGFP-PGK-Puro,去磷酸后進(jìn)行電泳回收；設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增啟動(dòng)子U6,將擴(kuò)增后的啟動(dòng)子U6與酶切回收后的pLVX-EFl-copGFP-Puro載體連接；[0022]PCR擴(kuò)增大腸桿菌ccdB致死基因，用XhoI和MluI雙酶切后，與經(jīng)過XhoI和MluI雙酶切的pLVX-U6-EFl-copGFP-PGK-Puro載體連接，得到用于表達(dá)IDl的shRNA慢病毒載體pLVX-U6-ccdB-EFl-copGFP-PGK-Puro;[0023]用BsmBI單酶切shRNA慢病毒載體pLVX-U6-ccdB-EFl-copGFP-PGK-Puro,得到pLVX-U6-EFl-copGFP-PGK-Puro載體骨架；將退火合成的shIDl片段與PLVX-U6-EFI-copGFP-PGK-Pur〇載體骨架通過相應(yīng)的酶切位點(diǎn)連接。[0024]進(jìn)一步地，用于擴(kuò)增EFl-copGFP的寡核苷酸引物為EFl-copGFP-F:5'-CGACGCGTCGAAGGATCTGCGATCGCTCCG-3'；EFl-copGFP-R:5'-AGCGCTTTAGCGAGATCCGGTGGAGCCGG-3'。[0025]進(jìn)一步地，所述的shRNA慢病毒載體的構(gòu)建方法，其中，用于擴(kuò)增U6啟動(dòng)子的寡核苷酸引物為U6-Clal-F:5'-CCATCGATGGAAGGTCGGGCAGGAAGAGG-3'，U6-XhoI-R:5'-CCGCTCGAGCGGTCGTCCTTTCCACAA-3'。[0026]一種如上所述的靶向性沉默IDl的shRNA序列的應(yīng)用，其中，所述shRNA序列用于制備抑制IDl基因表達(dá)的生物制劑。[0027]所述的靶向性沉默IDl的shRNA序列的應(yīng)用，其中，所述shRNA序列用于制備治療宮頸癌等惡性腫瘤的藥物。[0028]有益效果：本發(fā)明針對(duì)IDl設(shè)計(jì)了shRNA序列，并構(gòu)建了相應(yīng)的shRNA慢病毒沉默載體。通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)本發(fā)明的shRNA能夠顯著沉默IDl的表達(dá)。鑒于IDl作為一種潛在的腫瘤疾病治療靶點(diǎn)，因此本發(fā)明提供的shIDl及其相關(guān)生物試劑，可用于研究和制備治療宮頸癌等惡性腫瘤的相關(guān)藥物。本發(fā)明證實(shí)抑制IDl基因表達(dá)可抑制宮頸癌細(xì)胞(Hela)的異常增殖和迀移，證明IDl是一種潛在的治療腫瘤疾病的新型靶點(diǎn)，有利于進(jìn)一步研究宮頸癌等腫瘤疾病的藥物及應(yīng)用。【附圖說明】[0029]圖1為本發(fā)明實(shí)施例3中shIDl對(duì)Hela中IDl基因的沉默效果圖。[0030]圖2A~2B為本發(fā)明實(shí)施例4的結(jié)果圖，顯示shIDl能顯著抑制Hela的細(xì)胞增殖。其中，圖2A是熒光顯微鏡下觀察Hela細(xì)胞增殖的結(jié)果圖，圖2B為根據(jù)熒光顯微鏡觀察結(jié)果，對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)后分析增殖的檢測(cè)結(jié)果圖。[0031]圖3為本發(fā)明實(shí)施例5的結(jié)果圖，顯示shIDl能顯著抑制Hela的細(xì)胞迀移。圖中顯示了在細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行饑餓培養(yǎng)0h，24h和48h后的顯微鏡下觀察的結(jié)果圖?！揪唧w實(shí)施方式】[0032]本發(fā)明提供一種靶向性沉默IDl的shRNA序列、引物、應(yīng)用、shRNA慢病毒載體及構(gòu)建方法，及其作為腫瘤增殖抑制劑的應(yīng)用，為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及效果更加清楚、明確，以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。[0033]本發(fā)明公開了一種靶向性沉默IDl的shRNA序列，及其相應(yīng)shRNA雙鏈的引物、shRNA慢病毒載體及其構(gòu)建方法。所述shIDl慢病毒表達(dá)載體經(jīng)過慢當(dāng)前第1頁1 2 3