蓮藕淀粉合成相關(guān)酶基因hxk功能分子標(biāo)記引物及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及蓮藕淀粉合成相關(guān)酶基因 H)(K(己糖激酶， HXKase)功能分子標(biāo)記引物及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 蓮藕是多年生水生草本植物，是具有許多單子葉植物特征的最古老的雙子葉植物 之一，中國是原產(chǎn)地之一，在中國南方普遍種植。蓮產(chǎn)品包括鮮藕、藕粉、藕帶和蓮籽，是公 認(rèn)的滋補(bǔ)食品，含豐富的淀粉、蛋白質(zhì)、多種維生素和礦物質(zhì)，是特色蔬菜和副食佳品，具有 很高的營養(yǎng)保健功能，深受消費(fèi)者喜愛。隨著中國加入WT0,蓮藕加工產(chǎn)品鹽漬藕、水煮藕及 藕粉等遠(yuǎn)銷日本、韓國及歐、美等國家和地區(qū)，蓮藕已成為中國重要的出口創(chuàng)匯特色蔬菜之 〇
[0003] 不同的蓮藕產(chǎn)品對蓮藕品質(zhì)的要求不一樣，藕蓮按淀粉含量和種類可以分為粉藕 和脆藕兩類不同質(zhì)地的品種，粉藕品種的藕身硬度、纖維素含量、淀粉含量等都比脆藕品種 高，但水分含量比脆藕品種低；鮮粉藕品種中，直鏈淀粉含量、支鏈淀粉含量及支直比均比 脆藕高，口感粉糯。粉藕品種適合于煨湯，脆藕品種適合于炒藕片。影響蓮藕加工和蒸煮品 質(zhì)的主要因素是以淀粉為主的碳水化合物和淀粉中直鏈淀粉、支鏈淀粉含量。
[0004] 目前國內(nèi)外對蓮藕地下莖碳水化合物代謝的研究，僅見蓮藕膨大過程中和田間越 冬過程中淀粉等主要碳水化合物的含量變化，及成熟期地下莖淀粉粒形態(tài)和淀粉糊化特性 的報道；而對于地下莖中淀粉的積累與淀粉合成相關(guān)酶活性的關(guān)系研究較少。所以開發(fā)一 種依據(jù)基因型選擇不同淀粉含量的蓮藕品系的技術(shù)，可以有效的鑒別粉藕和脆藕，具有重 要的育種利用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供了一種蓮藕淀粉合成酶相關(guān)基因 H)(K功能分子標(biāo)記引物， 其為：HXKFl :TCTAAATCCCAATCCGTCC，HXKRl :GCACGAACTCTTGGCAATC。該引物可用于鑒別蓮 藕中的支、直鏈淀粉含量。
[0006] 本發(fā)明的另一個目的在于提供了一種蓮藕淀粉合成酶相關(guān)基因 H)(K功能分子標(biāo) 記引物的應(yīng)用，該應(yīng)用包括鑒定不同直鏈淀粉含量的蓮藕品系，蓮藕的早期育種篩選。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施：
[0008] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)HXK等位基因中第一個引物擴(kuò)增序列存在差異，將該功能分子標(biāo)記命 名為FMHXK-1。一種蓮藕淀粉相關(guān)基因 HXK功能分子標(biāo)記FMHXK-1，其序列如SEQ ID NO. 1 和圖1所示?；谠摲肿訕?biāo)記設(shè)計的引物如下：
[0009] -種蓮藕淀粉相關(guān)基因 H)(K功能分子標(biāo)記引物，其為：
[0010] HXKFl ：TCTAAATCCCAATCCGTCC,
[0011] HXKRl :GCACGAACTCTTGGCAATC。
[0012] -種蓮藕淀粉相關(guān)基因 HXK功能分子標(biāo)記或分子標(biāo)記引物的應(yīng)用，包括蓮藕淀粉 含量的測定，蓮藕的育種篩選（如在幼苗階段篩選）。
[0013] 所述的應(yīng)用通過以下方式實(shí)現(xiàn)：利用引物HXKFl :TCTAAATCCCAATCCGTCC，HXKRl : GCACGAACTCTTGGCAATC對蓮藕DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電 泳結(jié)果為320bp的A條帶和/或308bp的a條帶，根據(jù)A條帶的有無來確定蓮藕淀粉的含 量。將擴(kuò)增的A和a兩條帶進(jìn)行測序，部分序列的比對如圖2所示。
[0014] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果：
[0015] (1)本發(fā)明所用引物少、且效率高，可以加快育種速度、降低育種成本；并具有操 作簡單、成本低廉、周期短的優(yōu)點(diǎn)，適于推廣應(yīng)用，為蓮藕種質(zhì)資源鑒定和蓮藕育種選擇提 供了一種快捷的方法，具有很高的應(yīng)用價值。
[0016] (2)本發(fā)明所用引物直接開發(fā)于H)(K基因上，基因序列的長度差異直接對應(yīng)于品 種的表型差異，具有直接指示作用，可靠性更高。
【附圖說明】
[0017] 圖1是蓮藕淀粉相關(guān)基因 HXK功能分子標(biāo)記FMHXK-I的序列及引物HXKFl和HXKRl 的設(shè)計位點(diǎn)圖，其中黑色加粗斜體為引物序列。
[0018] 圖2是引物HXKFl和HXKRl擴(kuò)增條帶A和a的部分序列比對圖。
[0019] 圖3是引物HXKFl和HXKRl對實(shí)施例1中45個蓮藕品系DNA擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物條 帶。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均在常 規(guī)生化試劑商店購買得到的。
[0021] 實(shí)施例1蓮藕淀粉合成酶相關(guān)基因 H)(K功能分子標(biāo)記引物的獲得
[0022] (1)取45份成熟蓮藕樣品，測定蓮藕（蓮地下莖）的支鏈淀粉占干物質(zhì)百分含量、 直鏈淀粉占干物質(zhì)百分含量、總淀粉占干物質(zhì)百分含量；支鏈淀粉占總淀粉百分含量、直鏈 淀粉占總淀粉百分含量。測定結(jié)果見表1。
[0023] 表1蓮藕樣品的淀粉含量及PCR擴(kuò)增條帶結(jié)果
[0024]

[0026] (2)在NCBI中找出蓮藕淀粉合成酶相關(guān)基因 HXK(己糖激酶）的DNA序列，然后使 用軟件DNAMN設(shè)計引物，下表2列出所設(shè)計引物中的17對引物。
[0027] 表2 17對引物的序列

[0030] (3)取步驟（1)中的45份蓮樣品的嫩葉干燥脫水后，采用天根生化科技（北京） 有限公司的Plant Genomic DNA Kit植物基因組DNA提取試劑盒提取蓮總DNA。具體如下：
[0031] ①取30mg干燥的葉片，打磨成粉末。
[0032] ②將粉末迅速轉(zhuǎn)移到裝有700 μ L 65°C預(yù)熱緩沖液GPl的離心管中，迅速顛倒混 勻后，將離心管放在65°C水浴20min，水浴過程中顛倒離心管以混合樣品。
[0033] ③加入700 μ L氯仿，充分混勾，12000rpm離心5min。
[0034] ④小心的將上一步所得上層水相轉(zhuǎn)入一個新的離心管中，加入700 μ L緩沖液 GP2,充分混勻。
[0035] ⑤將混勻的液體轉(zhuǎn)入吸附柱CB3中，12000rpm離心30s，棄掉廢液。
[0036] ⑥向吸附柱CB3中加入500 μ L緩沖液⑶，12000rmp離心30s，倒掉廢液，將吸附柱 CB3放入收集管中。
[0037] ⑦向吸附柱CB3中加入600 μ L緩沖液PW，12000rmp離心30s，倒掉廢液，將吸附柱 CB3放入收集管中。
[0038] ⑧重復(fù)操作步驟⑦。
[0039] ⑨將吸附柱CB3放入收集管中，12000rmp離心2min，倒掉廢液。將吸附柱CB3置 于室溫數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附柱材料中殘余的漂洗液。
[0040] ⑩將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個干凈的